一種炭疽桿菌莢膜表面三糖綴合物及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種炭疽桿菌莢膜表面三糖綴合物及其制備方法和應(yīng)用，所述三糖蛋白綴合物結(jié)構(gòu)通式如式I所示：其中，所述R為載體蛋白KLH或BSA。本發(fā)明以氨基葡萄糖鹽酸鹽和D?半乳糖為原料，合成了如上式所示的三聚寡糖，并將其與載體蛋白偶聯(lián)得到糖蛋白綴合物。將制備的化合物作為抗炭疽疫苗免疫小鼠，結(jié)果表明本發(fā)明的化合物能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答，因此本發(fā)明具有較強的應(yīng)用價值。
【專利說明】
一種炭疽桿菌莢膜表面三糖綴合物及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及糖蛋白綴合物，具體地說，是一種炭疽桿菌莢膜表面三糖綴合物及其 制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 多數(shù)致病病原體的外殼通常包裹一層具有弱免疫原性的多糖，使其能夠逃避過宿 主的免疫監(jiān)控；由于其結(jié)構(gòu)的高度保守性及免疫應(yīng)答的可靠性，基于此類細菌莢膜多糖結(jié) 構(gòu)的疫苗已經(jīng)在感染性疾病控制方面取得了突破性的進展，已有針對新生兒、幼兒肺炎和 腦膜炎的疫苗上市，針對瘧疾、腫瘤和多種真菌、細菌感染的疫苗處于不同的研究階段，顯 示出了良好的研究前景。
[0003] 炭疽桿菌為致病菌中最大的革蘭氏陽性桿菌，屬于需氧芽孢桿菌屬，其繁殖體易 被殺滅。但是炭疽桿菌的芽孢可在動物、尸體及其污染環(huán)境和泥土中存活多年。炭疽桿菌一 旦進入人體，便會迅速產(chǎn)生外毒素，引起組織水腫、出血和壞死，使人喪失勞動力，直至死 亡。
[0004] 現(xiàn)有炭疽疫苗存在許多弊端，主要問題在于：（一)組成成分復(fù)雜而不確定；（二)免 疫反應(yīng)所對應(yīng)的抗原不夠明確，針對性較差；（三)疫苗的支鏈難以控制，效果不穩(wěn)定；（四） 免疫效果不理想。
[0005] 糖類合成的難點在于有更多的功能基團需要保護與去保護，且為了區(qū)分這些相似 的官能團，保護和去保護的方法必須具有很好的選擇性和專一性;更重要的是，糖苷鍵的形 成還應(yīng)具有較好的立體選擇性，并且在后續(xù)合成中要保持其構(gòu)型不變，這些因素都是限制 多糖合成的主要原因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種炭疽桿菌莢膜表面三糖蛋白綴 合物。
[0007] 本發(fā)明的再一的目的是，提供如上所述的炭疽桿菌莢膜表面三糖蛋白綴合物的制 備方法。
[0008] 本發(fā)明的另一的目的是，提供如上所述三糖蛋白綴合物的用途。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0010] 一種炭疽桿菌莢膜表面三糖蛋白綴合物，所述三糖蛋白綴合物結(jié)構(gòu)通式如式I所 示：
[0011]
[0012] 其中，所述R為載體蛋白KLH或BSA。
[0013] 所述三糖蛋白綴合物由三聚寡糖與載體蛋白偶聯(lián)制得。
[0014] 所述組成寡糖的單糖單元為氨基葡萄糖和D-半乳糖。
[0015] 所述以戊二烯基作為三糖和載體蛋白的連接基團。
[0016] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0017] 如上任一所述炭疽桿菌莢膜表面三糖蛋白綴合物的制備方法
[0018] 包括如下步驟：
[0019] (1)化合物2與化合物3在NIS/AgOTf作用下發(fā)生反應(yīng)制備化合物5;
[0020] (2)化合物5的4，6-位脫去芐叉基制備化合物6;
[0021] (3)化合物6與化合物4在NIS/TMSOTf作用下發(fā)生糖基化反應(yīng)制備化合物7;
[0022] (4)化合物7脫除保護基分別制備得到化合物8和化合物1;
[0023] (5)化合物1在戊二醛和甘氨酸條件下活化偶聯(lián)載體蛋白KLH或BSA，得目標(biāo)糖蛋白 綴合物；
[0024]所述化合物1-8結(jié)構(gòu)及合成路線如下：
[0025]
[0026] 優(yōu)選地，所述的制備方法，包括如下步驟：
[0027] (1)化合物2與化合物3在無水DCM、NIS/AgOTf的條件下于-30°C反應(yīng)制備化合物5; 所述NIS/AgOTf摩爾比為15:1;
[0028] (2)化合物5與對甲苯磺酸和乙硫醇在無水二氯甲烷條件下反應(yīng)制備化合物6;所 述化合物5、對甲苯磺酸、乙硫醇的摩爾比為1:0.2:9;
[0029] (3)化合物6與化合物4在無水DCM、NIS/TMS0Tf的條件下于-70°C反應(yīng)制備化合物 7;所述NI S/TMSOTf摩爾比為15:1;
[0030] (4)化合物7與乙二胺溶于正丁醇，在90°C加熱回流4小時；產(chǎn)物溶于無水吡啶，與 醋酸酐及DMAP反應(yīng)得到化合物8;
[0031] (5)化合物8在二氯甲烷、甲醇、氯化鈀、氫氣的條件下反應(yīng)得到化合物1;所述二氯 甲烷與甲醇的摩爾比為1:4;
[0032] (6)化合物1溶解在蒸餾水中，BSA或KLH溶解在roS緩沖液中，將二者融合，先加入 戊二醛攪拌反應(yīng)2小時后，再加入甘氨酸，反應(yīng)得到目標(biāo)糖蛋白綴合物。
[0033]優(yōu)選地，所述制備方法如下：
[0034] (1)以氨基葡萄糖鹽酸鹽和D-半乳糖為原料，在反應(yīng)助劑的作用下制備氨基葡萄 糖受體，氨基葡萄糖硫苷供體和2，3，4，6-0-四芐基半乳糖硫苷供體；
[0035] (2)上述制備的半乳糖供體和單糖受體在催化劑(NIS/AgOTf)作用下發(fā)生糖基化 反應(yīng)制備二糖，在二糖的4,6-位脫去芐叉基制備二糖受體;二糖受體和氨基葡萄糖硫苷供 體催化劑(NI S/TMSOTf)作用下發(fā)生糖基化反應(yīng)制備三糖;將三糖脫去所有保護基得化合物 1;
[0036] (3)化合物1在戊二醛和甘氨酸條件下活化偶聯(lián)載體蛋白，即得相應(yīng)糖蛋白綴合 物。
[0037] 為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0038] 如上任一所述三糖蛋白綴合物在制備預(yù)防和/或治療抗炭疽感染的藥物中的應(yīng) 用。
[0039] 如上任一所述三糖蛋白綴合物在制備抗炭疽感染的疫苗中的應(yīng)用。
[0040] -種藥物組合物，它還包含權(quán)利要求1-4任一所述三糖蛋白綴合物和藥學(xué)上可接 受的輔料或佐劑。
[00411 本發(fā)明提供了氨乙基-2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基_(α1-6)-(?Η)-吡 喃半乳糖基)-(al-3)_2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖的制備方法，包括：
[0042] (1)以氨基葡萄糖鹽酸鹽和D-半乳糖為原料，按照文獻方法制備氨基葡萄糖受體， 氨基葡萄糖硫苷供體和2，3，4，6-0-四芐基半乳糖硫苷供體；
[0043] (2)上述制備的半乳糖供體和單糖受體在催化劑(NIS/AgOTf)作用下發(fā)生糖基化 反應(yīng)制備二糖，在二糖的4,6-位脫去芐叉基制備二糖受體;二糖受體和氨基葡萄糖硫苷供 體催化劑(NIS/TMSOTf)作用下發(fā)生糖基化反應(yīng)制備三糖;將三糖脫去所有保護基即得目標(biāo) 化合物。
[0044] 本發(fā)明還提供了氨乙基-2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(al-6)-(i3-D- 吡喃半乳糖基)-(al-3)_2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖蛋白的制備方法，包括： [0045] (1)將按上述方法制備的氨乙基-2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基_(al - 6)-(?Η)_吡喃半乳糖基)-(al-3)_2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖在戊二醛和甘氨 酸條件下活化偶聯(lián)載體蛋白，即得相應(yīng)糖蛋白綴合物。
[0046] 本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0047] 1、本發(fā)明的糖蛋白綴合物作為抗炭疽疫苗免疫小鼠，結(jié)果表明本發(fā)明的化合物能 誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的免疫應(yīng)答，因此本發(fā)明具有較強的應(yīng)用價值。
[0048] 2、本發(fā)明的三糖蛋白綴合物合成路線簡潔，操作簡單，原料成本低，通用性強，糖 基化反應(yīng)立體選擇性好，產(chǎn)物收率高。
【附圖說明】
[0049]附圖1是氨乙基-2-脫氧-2-乙酰氨基-β-D-吡喃葡萄糖基-(al-6)-(i3-D-吡喃半 乳糖基)_(a 1-3) _2_脫氧_2_乙酰氨基-β-D-吡喃匍萄糖蛋白綴合物通式。
[0050]附圖2是二糖、三糖合成路線。反應(yīng)條件：a)4A-MS，NIS，AgOTf，-30°C;b)Ts0H， EtSH, DCM ； c) 4A-MS, NIS, TMSOTf, -70 °C ； d )NH2CH2CH2NH2, n-Butano 1,90 °C , ref lux ； then Ac2〇,DMAP,pyridine；then MeOH,NaOMe；e)Me0H,PdCb,H2〇 [0051 ] 附圖3是化合物1-BSA的MALDI-T0F-MS譜圖。
[0052]附圖4是化合物1 -KLH免疫小鼠后檢測血清中總抗體滴度。
【具體實施方式】
[0053]下面結(jié)合【具體實施方式】，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。
[0054] 實施例1三糖綴合物1-BSA和1-KLH的合成
[0055] (1)二糖受體6的合成
[0056] 取化合物（3.29g，5. lmmol)(AcadJSecMilMed Univ,2016,37(2): 145-152)和3 (2g，3 · 4mmol )^111'.】.0作.(]]16111.2014,4577-4584)溶于無水00\1(4〇1111^)后加入分子篩 (2.5g)，在氬氣保護下室溫攪拌lh。降溫至-30°C，迅速加入N-碘代丁二酰亞胺（1.15g， 5. lmmo 1)和三氟甲磺酸銀(87.3mg，0.34mmo 1)繼續(xù)攪拌lh。TLC(石油醚：乙酸乙酯=2:1，Rf = 0.5)監(jiān)測反應(yīng)完全。加三乙胺淬滅反應(yīng)后，過濾除去分子篩，濾渣用DCM洗滌，合并濾液。 依次用飽和硫代硫酸鈉溶液，飽和碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗兩遍。有機層用無水 硫酸鈉干燥后，濃縮硅膠柱層析(石油醚：乙酸乙酯=6:1)得白色固體5 (2.94g，79 % )。咕 NMR(600MHz，CDCl3)S7.72(d，J=1.9Hz，2H，Ar)，7.40((1, J = 4.0Hz，2H，Ar) ,7.37-7 ·28(ι?， 18H,Ar),7.18-7.10(m,6H,Ar),7.05-6.98(m,6H,Ar),5.54(d ,J = 3.8Hz,lH,Hgaia-l),5.34 (s,lH,PhCH(0)2) ,5.28(d,J = 8.5Hz,lH,HgiuN-l) ,5.00(d,J=12.4Hz,lH) ,4.9-4.81(m, 4H) ,4.71(d,J= 11.2Hz, 1H),4.65(d,J= 11.6Hz, 1H),4.50(d,J= 12.4Hz, 1H) ,4.41-4.38 (m,2H),4.33-4.31(m,lH),4.25(d,J=11.2Hz,lH),3.92(s,2H),3.89-3.86(m,2H),3.83-3.73(m,3H),3.70-3.66(m,lH),3.63(s,lH),3.61-3.58(m,lH),3.38-3.36(m,lH),3.30-3.22(m，3H)，2.88-2.86(m，lH) .13C 匪R(150MHz，CDC13)S156.1，138.9，138.6，138.5， 137.92,136.9,136.5,134.2,131.3,129.3,128.5,128.4,128.2,128.1,128.1,128.0， 128.0. 127.4.127.3.127.2.127.1.127.0.126.3.101.7(PhCH(0)2),99.0(C gaia-l), 97.3 (CgiuN-1) ,78.1,75.4,74.8,74.8,73.3,72.9,72.5,71.7,69.4,69.1,68.7,67.8,66.6, 65 · 9，55 · 3，40 · 8 · ESI-MS calcd · for C65H64N2〇i4[M+Na]+m/z，1119 · 43，found: 1119 · 64。
[0057] 取化合物5(2 · 2g，2mmol)，對甲苯橫酸(70mg，0 · 4mmol)和乙硫醇（1 · 3mL，1 8mmo1) 溶于無水二氯甲烷(50mL)，室溫下攪拌反應(yīng)3h，待TLC(石油醚：乙酸乙酯=3: 2，Rf = 0.3)檢 測反應(yīng)結(jié)束，加三乙胺淬滅反應(yīng)。濃縮溶劑，硅膠柱層析(石油醚：乙酸乙酯= 1:1)得白色產(chǎn) 物6(1.848,91%)。咕匪1?(60010^，0)(：13)37.72((1，了 = 7.1抱，1!1，八〇,7.61(^ = 7.8!^， 1H,Ar),7.53-7.42(m,2H,Ar),7.39-7.26(m,18H,Ar),7.24-7.18(m,5H,Ar),7.15(d,J= 7.7Hz,2H,Ar),5.19(s,lH),5.11(d ,J = 8.3Hz,lH),5.10-4.97(m,2H),4.85(d ,J = 11.7Hz, 1H),4.78(d,J=ll.ΙΗζ,ΙΗ),4.74-4.65(m,4H),4.38-4.33(m,2H),4.17-4.07(m,3H), 3.98-3.90(m,4H),3.80-3.72(m,3H),3.68-3.54(m,3H),3.36-3.20(m,2H),3.10(t,J= 9.1Hz,1H). 13C 匪R(150MHz，CDC13)Sl68.5,167.7,156.2,138.6,138.2,138.1,136.91， 136.5.134.0. 133.9.131.6.128.8.128.6.128.5.128.4.128.3.128.1.128.1.128.0， 127.9,127.7,127.6,127.5,127.4,127.3,123.4,102·5,98·9,83·7,79·3,75.9,75.4, 74.9.74.6.74.0. 73.0.72.4.72.2.70.0.69.2.66.9.66.6.62.9.55.4.41·0·ESI-MS calcd.for C58H6〇N2〇i4[M+Na].m/z，1031 · 39，found: 1031 ·84〇
[0058] (2)目標(biāo)化合物1的合成
[0059] 取化合物6(505mg，0 · 5mmol)和4(406mg，0 · 75mmol,Carbohydrate Research, 2008，343: 2894-2902)溶于無水DCM(15mL)后加入分子篩(500mg)，在氬氣保護下室溫攪拌 111。降溫至-70°(：，迅速加入^碘代丁二酰亞胺（16811^，0.75111111〇1)和了]\^(^以0.111^， 0.05mmol)繼續(xù)攪拌3LTLC(石油醚：乙酸乙酯=2:1，心=0.5)檢測反應(yīng)完全。加三乙胺淬 滅反應(yīng)后，過濾除去分子篩，濾渣用DCM洗滌，合并濾液。依次用飽和硫代硫酸鈉溶液，飽和 碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌。有機層用無水硫酸鈉干燥后，濃縮硅膠柱層析(石油 醚：乙酸乙酯= 2:1)得白色固體7(54011^,76^)^11^^(60010^,00(:13)57.84-7.77(111,211, Ar),7.70-7.61(m,3H,Ar),7.58-7.56(m,lH,Ar),7.49-7.41(m,2H,Ar),7.38-7.27(m,16H, Ar),7.25-7.23(m,2H,Ar),7.22-7.18(m,5H,Ar),7.13-7.11(m,2H,Ar),5.81-5.78(m,lH), 5.48(d,J = 8.5Hz,lH),5.17(t,J = 9.6Hz,lH),5.06(t,J = 5.6Hz,lH) ,5.00(d,J=12.4Hz, lH),4.96-4.90(m,2H),4.79-4.74(m,2H),4.71-4.64(m,3H),4.58(d,J=3.4Hz,lH),4.38-4.30(m,3H),4.25-4.15(m,3H),4.14-4.07(m,2H),4.00-3.97(m,1H),3.93-3.86(m,3H), 3.85-3.79(m,1H),3.72-3.61(m，2H),3.57(t，J=8.5Hz，lH),3.40-3.32(m，3H),3.10-2.97 (m，3H)，2.26-2.23(m，lH)，2.13(s，3H，Ac)，2.03(s，3H，Ac)，1.86(s，3H，Ac). 13C 匪R (150MHz,CDC13)5170.3,169.7,169.0,167.9,167.2,155.7,138.0,137.7,137.6,136.4, 136.2.133.9.133.5.133.3.131.1.131.0. 130.8.128.2.128.1.127.9.127.7.127.6， 127.5.127.4.127.2.127.1.126.9.126.8.123.1.122.9.102.0. 97.7.83.1.78.7.75.1， 74·8，74·4，73·9，73·4，72·5，71·8，71·3，71·0，70·3，69·4，68·5，68·4，67·8，66·3，66 · 0， 61 · 5，54 · 8，54 · 2，40 · 4，20 · 3，20 · 2，20 · 0 · ESI-MS calcd · for C78H79N3O23 [M+Na]+m/z， 1448.50,found :1448.77〇
[0060]取化合物7(154mg，0. llmmol)和乙二胺（0· 15mL，2.2mmol)溶于正丁醇（5mL)，加熱 回流(90°C)4h。反應(yīng)完畢，蒸干溶劑，真空干燥，得中間產(chǎn)物;溶于無水吡啶(3mL)并加入醋 酸酐(0.5mL)和催化量DMAP室溫下攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束，加甲醇淬滅反應(yīng)，蒸干溶劑，加 DCM (50mL)萃取，依次使用1M HC1溶液，飽和碳酸氫鈉溶液和飽和氯化鈉溶液洗滌，有機層用無 水硫酸鈉干燥，。硅膠柱層析純化得白色產(chǎn)物8(10011^，73%)。 1!1匪1?(6001抱，〇)(：13)67.41-7.35(m 8H),7.33-7.27(m,13H),7.24-7.22(m,4H),5.31-5.25(m,lH),5.21(d,J=7.8Hz, lH),5.14-5.08(m,3H),5.04(t ,J = 9.6Hz,lH),4.94-4.89(m,2H),4.82(d ,J=12.0Hz,lH), 4.77(d ,J = 3.3Hz,lH),4.69-4.62(m,3H),4.56(d ,J=11.7Hz,lH),4.41(s,2H),4.31-4.28 (m,2H),4.23-4.20(m,lH),4.10-3.91(m,5H),3.78-3.76(m,1H),3.67(d,J=1.9Hz,1H), 3.64-3.60(m,3H),3.53-3.51(m,lH),3.32-3.29(m,3H),3.10-3.08(m,lH),2.79-2.76(m, 1H),2.06(s，3H，Ac),2.03(s，3H，Ac),2.01(s，3H，Ac),1.83-1.67(m，6H,Ac). 13C 匪R (150MHz,CDC13)5171.5,170.3,170.2,170.1,168.8,156.0,138.1,137.7,137.6,136.4, 136.1.128.1.128.1.128.0. 128.0.128.0.127.9.127.6.127.6.127.5.127.47.127.41, 127.21.127.10.101.08.98.98.98.59.79.23.77.99.75.03.74.0. 73.34.73.0.72.7.71.8， 71.4.70.5.70.1.69.0. 68.4.68.0.67.6.66.2.61.5.58.7.53.5.40.6.22.6.22.4.20.2, 20. l〇
[0061 ] 取化合物8(30mg,0.024mmol)溶于二氯甲烷和甲醇(DCM:MeOH= 1:4,5mL),加入催 化量氯化鈀，通入氫氣震蕩反應(yīng)3h。待反應(yīng)結(jié)束，濾去氯化鈀殘渣，濃縮濾液，得中間產(chǎn)物。 置于含催化量甲醇鈉的無水甲醇中攪拌反應(yīng)20min，加入酸性樹脂調(diào)節(jié)溶液pH=6~7,除去 樹脂，濃縮濾液，再由P2凝膠柱純化得白色終產(chǎn)物1 (10mg，67 % )。咕600MHz，CD30D/ D2〇)S5.35(d，J = 3.2Hz，2H，H-l，HgiUN_l) ,4.59-4.58(m，3H，Hgaia-l，NH2)，4.27(dd，J = 28.5,13.4Hz,lH),4.10-4.03(m,2H),3.96-3.81(m,10H),3.76-3.71(m,8H),3.66(d,J= 9 · 2Hz，1H)，3 · 29-3 · 13(m，3H)，2 · 06，2 · 02(s，6H,Ac) · 13C NMR( 150MHz，CD3OD/D2O)δ173 · 6， 100.5.99.2.80.0. 75.2.70.6.70.2.69.1.68.7.68.3.65.0.60.2.60.0.53.4.39.0.21.7〇
[0062] (3)三糖綴合物1-BSA和1-KLH的合成
[0063] 取三糖化合物l(2mg)和10mg BSA或KLH分別溶解在0.5ml蒸餾水和0.5ml PBS緩沖 液中，然后將二者融合。向混合液中加 lmL 0.2 %戊二醛(過量)后，旋轉(zhuǎn)攪拌反應(yīng)2小時。向 反應(yīng)液中加 0.5mL 1M甘氨酸，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)攪拌反應(yīng)1小時。待反應(yīng)結(jié)束，取反應(yīng)液對蒸餾水透 析過夜，凍干得1-BSA或1-KLH白色粉末。
[0064] 實施例2本發(fā)明的化合物免疫活性測試
[0065] 一、試驗材料及來源
[0066]供試化合物:本發(fā)明實施例1中所制備得到的糖蛋白化合物1-KLH。
[0067]二、試驗方法 [0068](一)小鼠免疫方案
[0069] 1)選用6-8周雌性Balb/c小鼠（購于中國科學(xué)院上海實驗動物中心），每組5只小 ￡3
[0070] 2)將糖蛋白化合物ι-KLH添加相應(yīng)佐劑(溶于PBS)混懸液皮下注射小鼠，每次免疫 的糖蛋白含有2yg的糖，每隔3周再用同樣方法加強免疫，共免疫3次。分別于免疫前和第三 次免疫后一周，分離血清并置于-80°C冰箱凍存待測。
[0071 ](二)小鼠免疫前后血清中抗體滴度測定
[0072] 1、包被抗原(ELI SA包被緩沖液，5yg/mL) 100μ 1 /we 11，4 °C包被過夜；
[0073] 2、Blacking:洗板，gelatin，200yL/wel 1，37 °C孵育 2 小時；
[0074] 3、Abl:洗板，以不同稀釋倍數(shù)加入抗體血清，lOOyL/wel 1，37°C孵育2小時；
[0075] 4、Ab2:洗板，羊抗小鼠 -HRP，100yL/we 11，37 °C 孵育 1 小時；
[0076] 5、加底物顯色：反應(yīng)7min，加2M H2S〇4中止；
[0077] 6、ELISA 儀測4500D 值。
[0078]檢測設(shè)置空白對照(本底），即在Abl反應(yīng)時以稀釋液代替樣品。
[0079]三、試驗結(jié)果
[0080] 本發(fā)明制備的KLH-糖蛋白綴合物1-KLH皮下免疫小鼠，均能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的 免疫應(yīng)答，實驗結(jié)果見附圖4。
[0081] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種炭痘桿菌芙膜表面Ξ糖蛋白綴合物，其特征在于，所述Ξ糖蛋白綴合物結(jié)構(gòu)通 式如式I所示：其中，所述R為載體蛋白KLH或BSA。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述炭痘桿菌芙膜表面Ξ糖蛋白綴合物，其特征在于，所述Ξ糖蛋白 綴合物由Ξ聚寡糖與載體蛋白偶聯(lián)制得。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述炭痘桿菌芙膜表面Ξ糖蛋白綴合物，其特征在于，所述組成寡糖 的單糖單元為氨基葡萄糖和D-半乳糖。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述炭痘桿菌芙膜表面Ξ糖蛋白綴合物，其特征在于，W戊二締基作 為Ξ糖和載體蛋白的連接基團。5. 權(quán)利要求1-4任一所述炭痘桿菌芙膜表面Ξ糖蛋白綴合物的制備方法，其特征在于， 包括如下步驟： (1) 化合物2與化合物3在NIS/AgOTf作用下發(fā)生反應(yīng)制備化合物5; (2) 化合物5的4,6-位脫去節(jié)叉基制備化合物6; (3) 化合物6與化合物4在NIS/TMSOTf作用下發(fā)生糖基化反應(yīng)制備化合物7; (4) 化合物7脫除保護基分別制備得到化合物8和化合物1; (5) 化合物1在戊二醒和甘氨酸條件下活化偶聯(lián)載體蛋白KLH或BSA，得目標(biāo)糖蛋白綴合 物； 所述化合物1-8結(jié)構(gòu)及合成路線如下：ο6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 化合物2與化合物3在無水DCM、NIS/AgOTf的條件下于-30°C反應(yīng)制備化合物5;所述 NIS/AgOTf 摩爾比為15:1; (2) 化合物5與對甲苯橫酸和乙硫醇在無水二氯甲燒條件下反應(yīng)制備化合物6;所述化 合物5、對甲苯橫酸、乙硫醇的摩爾比為1:0.2:9; (3) 化合物6與化合物4在無水DCM、NIS/TMSOTf的條件下于-70°C反應(yīng)制備化合物7;所 述NIS/TMSOTf摩爾比為15:1; (4) 化合物7與乙二胺溶于正下醇，在90°C加熱回流4小時；產(chǎn)物溶于無水化晚，與醋酸 酢及DMAP反應(yīng)得到化合物8; (5) 化合物8在二氯甲燒、甲醇、氯化鈕、氨氣的條件下反應(yīng)得到化合物1;所述二氯甲燒 與甲醇的摩爾比為1:4; (6) 化合物1溶解在蒸饋水中，BSA或化Η溶解在PBS緩沖液中，將二者融合，先加入戊二 醒攬拌反應(yīng)2小時后，再加入甘氨酸，反應(yīng)得到目標(biāo)糖蛋白綴合物。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法如下： (1) W氨基葡萄糖鹽酸鹽和D-半乳糖為原料，在反應(yīng)助劑的作用下制備氨基葡萄糖受 體，氨基葡萄糖硫巧供體和2，3，4，6-0-四芐基半乳糖硫巧供體； (2) 上述制備的半乳糖供體和單糖受體在催化劑(NIS/AgOTf)作用下發(fā)生糖基化反應(yīng) 制備二糖，在二糖的4，6-位脫去節(jié)叉基制備二糖受體;二糖受體和氨基葡萄糖硫巧供體催 化劑(NIS/TMSOTf)作用下發(fā)生糖基化反應(yīng)制備Ξ糖;將Ξ糖脫去所有保護基得化合物1; (3) 化合物1在戊二醒和甘氨酸條件下活化偶聯(lián)載體蛋白，即得相應(yīng)糖蛋白綴合物。8. 權(quán)利要求1-4任一所述Ξ糖蛋白綴合物在制備預(yù)防和/或治療抗炭痘感染的藥物中 的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求1-4任一所述Ξ糖蛋白綴合物在制備抗炭痘感染的疫苗中的應(yīng)用。10. -種藥物組合物，其特征在于，它還包含權(quán)利要求1-4任一所述Ξ糖蛋白綴合物和 藥學(xué)上可接受的輔料或佐劑。
【文檔編號】C07K1/113GK106084037SQ201610407023
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】廖俊, 廖萬清, 柴曉云, 黃蕾, 方文捷, 王保剛, 張治強, 潘瑋華, 陳敏, 吳秋業(yè)
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)