一種全人源抗GPC3的全分子IgG抗體及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種全人源抗GPC3的全分子IgG抗體，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是該序列經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是該序列經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。本發(fā)明還公開了上述全人源抗GPC3的全分子IgG抗體的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了一種編碼上述全人源抗GPC3的全分子IgG抗體的基因。本發(fā)明還公開了一種表達載體，包含有上述基因以及與該基因操作性相連的表達調(diào)控序列。本發(fā)明還公開了一種宿主細胞，被上述表達載體所轉(zhuǎn)化。
【專利說明】
一種全人源抗GPC3的全分子I gG抗體及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物免疫技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種全人源抗GPC3的全分子IgG抗體及 其應(yīng)用，還涉及其編碼基因，其編碼基因的表達載體，及宿主細胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 原發(fā)性肝細胞癌(HCC)的發(fā)病率在惡性腫瘤中排名世界第5位，而死亡率則位居第 3位。我國是肝癌高發(fā)區(qū)之一，每年有超過10萬人死于原發(fā)性肝癌，只有10-20%的HCC患者 能在早期被診斷且接受手術(shù)治療，大部分患者被診斷時已是晚期，預(yù)后較差，且治療手段不 多。此外，原發(fā)性肝癌容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，即使是小肝癌根治性切除，術(shù)后5年轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率仍高達 50% ACC多通過血液循環(huán)，其次為淋巴管，也可以直接蔓延、侵襲或種植。肝癌的肝外器官 血行轉(zhuǎn)移發(fā)生較早且交廣泛，有研究表明，在尸檢中發(fā)現(xiàn)60%以上的肝細胞癌伴肝外轉(zhuǎn)移， 其中以肺最為常見(約占血行轉(zhuǎn)移中的90%)。因此，早期診治是改善HCC患者預(yù)后的最關(guān)鍵 因素之一。
[0003] 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖中的磷脂酰肌醇聚糖家族通過共價鍵 (glycosylphosphatilinositol，GPI)錨定在細胞表面的。在脊椎動物中，6個家庭成員已確 定(GPC1-6)。磷脂酰肌醇聚糖蛋白能夠修改細胞信號通路，導(dǎo)致細胞增殖和組織生長。磷脂 酰肌醇聚糖3(GPC3)在肝細胞癌和其癌癥包括黑色素瘤、鱗狀細胞癌的肺，和卵巢透明細胞 癌中高表達，而在正常組織中不表達。GPC3基因編碼一個70kDa大小的前體核心蛋白，可以 通過弗林蛋白酶裂解生成40kDa氨基(N)終端碎片和30kDa膜結(jié)合羧基(C)終端片段。其C端 有兩個硫酸肝素（HS)多糖鏈。GPC3蛋白通過GPI錨定在細胞膜表面。GPC3結(jié)合Wnt和 Hedgehog信號通路中的蛋白，也可以結(jié)合一些基礎(chǔ)的生長因子，如通過HS多糖鏈結(jié)合纖維 母細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2)〇
[0004] 抗GPC3抗體通過抑制GPC3基因功能可以阻止肝癌細胞的增殖或轉(zhuǎn)移。目前抗GPC3 抗體大多以雜交瘤方式制備得到，如申請?zhí)枮?01210086009.X的專利《GPC3單克隆抗體雜 交瘤細胞株7D11及其制備方法和應(yīng)用》，但往往特異性及親和力不夠理想。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于【背景技術(shù)】存在的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種全人源抗GPC3的全分 子IgG抗體。
[0006] 本發(fā)明的目的又在于提供一種編碼上述全人源抗GPC3的全分子IgG抗體的基因。
[0007] 本發(fā)明的目的又在于提供一種含有能編碼上述全人源抗GPC3的全分子IgG抗體基 因的表達載體。
[0008] 本發(fā)明的目的又在于提供一種被上述表達載體所轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
[0009] 本發(fā)明的目的還在于提供上述全人源抗GPC3的全分子IgG抗體的應(yīng)用。
[0010]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出的一種全人源抗GPC3的全分子IgG抗體，所述輕鏈可 變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，或者是該序列經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替 換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；
[0011] 所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，或者是該序列經(jīng)一個或多個 氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。
[0012] 優(yōu)選地，所述輕鏈可變區(qū)的三個抗原互補區(qū)CDR的氨基酸序列如SEQ ID N0.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；
[0013] 所述重鏈可變區(qū)的三個抗原互補區(qū)CDR的氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO. 10所示。
[0014]本發(fā)明還提出的一種全人源抗GPC3的全分子IgG抗體，所述輕鏈恒定區(qū)的氨基酸 序列如SEQ ID N0.11所示，所述重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.12所示。
[0015] 本發(fā)明還提出的一種DNA分子，其編碼上述全分子IgG抗體的輕鏈和/或重鏈。
[0016] 優(yōu)選地，編碼上述全分子IgG抗體的輕鏈可變區(qū)的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0017] 優(yōu)選地，編碼如上述全分子IgG抗體的重鏈可變區(qū)的核酸序列如SEQ ID NO.2所 不。
[0018] 本發(fā)明還提出的一種表達載體，包含有上述DNA分子以及與該DNA分子操作性相連 的表達調(diào)控序列。
[0019] 本發(fā)明還提出的一種宿主細胞，被上述表達載體所轉(zhuǎn)化。
[0020]優(yōu)選地，所述宿主細胞可以是被上述表達載體轉(zhuǎn)化的293Freestyle細胞。
[0021]本發(fā)明還提出的一種上述全分子IgG抗體在制備與GPC3相關(guān)的腫瘤的診斷或治療 藥劑中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明還提出的一種抑制GPC3介導(dǎo)的腫瘤藥物，所述藥物的活性成分為上述全分 子IgG抗體。
[0023]本發(fā)明使用噬菌體抗體庫技術(shù)篩選到了對GPC3具有高度親和力的人源Fab抗體， 并獲取了賦予所述抗體優(yōu)異特性的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列和核苷酸序列，并將所 述抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)與含有抗體恒定區(qū)的表達載體連接，最終獲得了具有特異的抗 原結(jié)合性和在細胞學上證明抗體可以抑制腫瘤細胞的生長對腫瘤細胞有殺傷作用的全人 源全分子抗體。
[0024]與國內(nèi)現(xiàn)有的抗GPC3鼠源單抗相比，本發(fā)明制備的是全人源IgG抗體，而且實驗證 明有很好的特異性及對GPC3陽性的腫瘤細胞有很好的殺傷作用。
[0025]本發(fā)明提供了一種具有高特異性、良好親和力的抗GPC3的全分子全人源單克隆抗 體。GPC3在肝細胞癌和其癌癥包括黑色素瘤、肺部鱗狀細胞癌和卵巢透明細胞癌中高表達， 而在正常組織中不表達，因此本發(fā)明的抗GPC3抗體可應(yīng)用于有關(guān)GPC3陽性的腫瘤的診斷、 治療。本發(fā)明以GPC3為靶分子，在噬菌體抗體庫技術(shù)的基礎(chǔ)上制備出全分子人源抗體。對制 備的人源抗GPC3抗體做功能鑒定，顯示該抗體能夠與GPC3特異性結(jié)合，體外GPC3陽性腫瘤 細胞殺傷實驗結(jié)果證實，該抗體能夠有效抑制GPC3陽性的腫瘤細胞的增殖。
[0026]本發(fā)明人通過腫瘤細胞增殖抑制實驗，證明抗GPC3抗體可以明顯抑制肝癌細胞 Hep3B的增殖，細胞增殖率降低至約為20%。抗GPC3抗體對GPC3陽性的肝癌細胞具有較好的 殺傷作用。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明實施例1所得純化全人源抗GPC3的全分子I gG抗體的SDS-PAGE檢測結(jié) 果，其中Μ為標準標記物，1為抗GPC3抗體，2為細胞培養(yǎng)上清，3為流穿。
[0028] 圖2為本發(fā)明實施例1所得抗GPC3抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測結(jié)果。
[0029]圖3為本發(fā)明實施例1所得抗GPC3抗體的免疫印跡鑒定結(jié)果，其中1為抗GPC3抗體 與GPC3陽性的肝癌細胞Η印3Β，2為抗GPC3抗體與GPC3陽性的肝癌細胞Α431。
[0030]圖4為本發(fā)明實施例1所得抗GPC3抗體的親和力檢測結(jié)果。
[0031]圖5為本發(fā)明實施例1所得抗GPC3抗體在體外與肝癌細胞的相互作用。
【具體實施方式】
[0032]下面，通過具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。
[0033]實施例1:全人源抗GPC3的全分子IgG抗體的制備
[0034] 1)用GPC3抗原在人源Fab噬菌體庫中經(jīng)過六輪"吸附-洗脫-擴增"的富集篩選，獲 得抗GPC3的Fab抗體，然后通過PCR擴增測序獲得Fab抗體的可變區(qū)序列；
[0035] 2)根據(jù)已獲得的抗體的重輕鏈可變區(qū)序列設(shè)計引物；
[0036] 3)擴增PA21抗體重鏈、輕鏈：
[0037] 以上述制備的人源Fab模板，分別以上述涉及的重鏈和輕鏈的上下游引物擴增全 分子人源抗體重鏈、輕鏈基因。
[0038] (l)PCR
[0039] 反應(yīng)體系如下：
[0040]
[0041 ]反應(yīng)條件如下：
[0042]
[0043] (2)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外下觀察目的條帶，切膠回收。
[0044] (3)膠回收試劑盒純化目的DNA片段，去離子水洗脫。
[0045] 4)雙酶切IgG表達質(zhì)粒
[0046] IgG表達質(zhì)粒pFUSE-CHIg-hGl、pFUSE-CLIg-hk(購自 Invivogen公司）包含IgGl型 人源的重鏈和輕鏈(Kappa)恒定區(qū)堿基編碼序列。
[0047] (1 )pFUSE-CHIg-hGl、pFUSE-CLIg-hk 模板載體的雙酶切 [0048] 反應(yīng)體系如下：
[0049]
[0050]反應(yīng)條件為:37 °C酶切過夜。
[0051 ] (2) 1 %瓊脂糖凝膠電泳，紫外下切膠回收。
[0052] (3)膠回收試劑盒純化目的DNA片段，去離子水洗脫。
[0053] 5)Infusion PCR重組表達質(zhì)粒
[0054] 反應(yīng)體系如下：
[0055]
[0056] 反應(yīng)條件為：5(TC孵育15min。
[0057] 取5yL反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌，鋪于相應(yīng)抗性的平板上，次日挑克隆送測序。將測 序結(jié)果正確的克隆保存菌種并擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。
[0058] 6)抗GPC3抗體的表達
[0059] (1)取50yg重組后的重鏈質(zhì)粒于lmL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，取50yg的輕鏈質(zhì)粒于 lmL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，取200yL的293Fectin于2.8mL的Opti-MEM培養(yǎng)基中，將上述三種 混合液室溫靜置5min;
[0060] (2)然后將兩個質(zhì)?；旌弦夯旌暇鶆蚝?，補加500yL的Opti-MEM培養(yǎng)基混合均勻后 直接加入轉(zhuǎn)染試劑293Fectin的混合液，混合均勻后靜置20min。期間處理293F細胞，將293F 細胞離心后用293F Expression Medium重懸，然后計數(shù)以及用臺盼藍計算細胞活力比，吸 取IX 108個細胞于培養(yǎng)瓶中，用293F Expression Medium定容為94mL;
[0061 ] (3)20min結(jié)束后將6mL的DNA、293Fectin的復(fù)合物加入準備好的293F細胞中；
[0062] (4)將細胞放在搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件8%C02，120rmp，37°C，6天后收集細 胞上清。
[0063] 7)抗GPC3抗體的純化
[0064]將收集的細胞上清用0.22μπι的濾膜過濾，同時將平衡液和洗脫液過濾膜。用AKATA 純化儀按照Protein Α純化的標準步驟純化，以lmL/min的速度上樣，以1.5mL/min的速度洗 脫。
[0065] 結(jié)果成功表達并純化抗GPC3抗體。將純化抗GPC3抗體進行SDS-PAGE檢測，其結(jié)果 如圖1所示，由圖1可知純化的抗體純度很高，且用Pro. A柱純化效果較好。
[0066]實施例2:抗GPC3抗體的功能活性鑒定 [0067] 1)酶聯(lián)免疫法
[0068]用包被液(0.1M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)GPC3蛋白至2yg/mL包被ELISA 96孔板，每孔 加入100yL，4 °C過夜;PBST (PBS含0.5 % TWeen20) 5 %脫脂牛奶-洗滌緩沖液封閉，37 °C孵育 2h; TOST洗滌5次后，每個孔中加入100yL PA21抗體(2yg/mL起始濃度，14個濃度梯度稀釋） 37°C2h;以1:4000稀釋的羊抗人二抗100μL7孔加入到孔內(nèi)，37°C孵育lh;過氧化物酶底物顯 色液100μL7孔，室溫下10分鐘后用2M硫酸中止反應(yīng)，上機檢測比色采用雙波長450nm/ 690nm〇
[0069] 結(jié)果如圖2所示，由圖2可知:抗GPC3抗體能與GPC3蛋白起抗原抗體反應(yīng)，且結(jié)合能 力較強。
[0070] 2)ffestern blot
[0071] 以不表達GPC3蛋白的肝癌細胞A431為陰性對照，分別將高表達GPC3的肝癌細胞 Hep3B和不表達GPC3蛋白的肝癌細胞A431進行10%SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上， 將此膜與2yg/mL PA21抗體室溫孵育lh，1:4000稀釋HRP-羊抗人IgG(北京中杉公司）和ECL 發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司）曝光于凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司）。
[0072] 結(jié)果如圖3所示，由圖3可知:抗GPC3抗體與Hep3B表達的GPC3蛋白有特異性結(jié)合。
[0073] 3)親和力檢測
[0074] 根據(jù)GPC3的等電點以及按照BiacoreXIOOcontrol soft的protocol優(yōu)化偶聯(lián)條 件，斜率優(yōu)化選擇醋酸鈉作為偶聯(lián)稀釋緩沖液。用此緩沖液稀釋GPC3樣品稀釋至25yg/mL后 偶聯(lián)到CM5芯片上。預(yù)設(shè)偶聯(lián)水平1500RU。然后用pH7.4的Running buffer稀釋PA21樣品，稀 釋一系列濃度至 〇11]?、511]\1、1〇11]\1、2〇11]\1、4〇11]\1、8〇11]\1。設(shè)置進樣時間為18〇8，解離時間1〇1^11，再 生緩沖液用50mM pH2 · 2Gly_HCl。按照BiacoreXIOOcontrol soft的protocol進行上機測 試。
[0075] 其親和力檢測結(jié)果如圖4所示，KD值為7.9X10、。
[0076] 4)肝癌細胞體外殺傷實驗
[0077] 將被試細胞A431和Hep3B細胞培養(yǎng)在含有10%小牛血清(FBS)和1%抗生素(P/S) 的DMEM培養(yǎng)基中，37 °C 5 %二氧化碳條件下培養(yǎng)。待細胞培養(yǎng)良好后轉(zhuǎn)種在96微孔細胞培養(yǎng) 板上，過夜培養(yǎng)當細胞生長在96微孔細胞培養(yǎng)板上達70 %時，無菌條件下加入不同劑量的 抗體，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，顯微鏡下觀察細胞死亡情況并照相，然后加 Cell Titer 96aqueous nonradioactive cell Proliferation assay(Promega MI)檢查LDH，計算分析細胞死亡百 分數(shù)，實驗重復(fù)三次。
[0078]抗GPC3抗體與肝癌細胞的相互作用結(jié)果如圖5所示，由圖5可知:在抗體的作用下， GPC3陽性的細胞，細胞存活率為20 %左右，而對GPC3陰性的細胞沒有殺傷作用；當抗體量達 到ΙΟμ mol/L時可以使高表達GPC3的Hep3B細胞的存活率只有10%左右，而對照的A431細胞 存活率沒有明顯變化。
[0079] 上述文中Μ為mol/L的含義。
[0080] 以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其 發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種全人源抗GPC3的全分子IgG抗體，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如 SEQ ID NO.3所示，或者是該序列經(jīng)一個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變 而獲得的保守性變異體； 所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是該序列經(jīng)一個或多個氨基 酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述全分子IgG抗體，其特征在于，所述輕鏈可變區(qū)的三個抗原互補 區(qū)CDR的氨基酸序列如SEQIDN0.5、SEQIDN0.6和SEQIDN0.7所示 ； 所述重鏈可變區(qū)的三個抗原互補區(qū)⑶R的氨基酸序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和 SEQ ID NO .10所示。3. -種全人源抗GPC3的全分子IgG抗體，其特征在于，所述輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如 SEQ ID NO. 11所示，所述重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示。4. 一種DNA分子，其編碼權(quán)利要求1-3任一項所述全分子IgG抗體的輕鏈和/或重鏈。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述DNA分子，其特征在于，編碼如權(quán)利要求1所述全分子IgG抗體的 輕鏈可變區(qū)的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述DNA分子，其特征在于，編碼如權(quán)利要求1所述全分子IgG抗體 的重鏈可變區(qū)的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。7. -種表達載體，包含有權(quán)利要求4-6任一項所述DNA分子以及與該DNA分子操作性相 連的表達調(diào)控序列。8. -種宿主細胞，被權(quán)利要求7所述表達載體所轉(zhuǎn)化。9. 一種如權(quán)利要求1-3任一項所述全分子IgG抗體在制備與GPC3相關(guān)的腫瘤的診斷或 治療藥劑中的應(yīng)用。10. -種抑制GPC3介導(dǎo)的腫瘤藥物，其特征在于，所述藥物的活性成分為權(quán)利要求1-3 任一項所述全分子I gG抗體。
【文檔編號】G01N33/574GK106084041SQ201610483207
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】馮振卿, 唐奇, 許國貞, 劉振云, 朱進, 熊四平, 唐小軍
【申請人】安徽未名細胞治療有限公司