一種半互穿網絡納米雜合水凝膠及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種半互穿網絡納米雜合水凝膠及其制備方法和應用，首先將殼聚糖進行修飾，制備成水溶性的羧甲基殼聚糖(CMCS)；再經N?異丙基丙烯酰胺(NIPAM)、CMCS及(羧基功能化的)碳納米管的原位自由基交聯聚合反應，制備了不同NIPAM、CMCS及納米管組成比例的半互穿網絡納米雜合水凝膠。由本發(fā)明制備的新型納米雜合水凝膠具有較高的溶脹率、適宜的體積相轉變溫度及pH相轉變點、高的藥物承載量及持續(xù)可控的藥物釋放行為。本發(fā)明水凝膠藥物制劑可以作為一種有前途的親水口服藥物載體，用于口服疫苗、多肽、蛋白質和抗癌藥物的靶向釋放，具有低毒性、可長期治療結腸等癌癥。
【專利說明】
一種半互穿網絡納米雜合水凝膠及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于功能高分子材料及其復合材料技術領域，尤其涉及一種半互穿網絡納 米雜合水凝膠及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 如今，由于環(huán)境問題和飲食不健康等方面的原因，越來越多的人們受到各種疾病， 尤其是癌癥的侵襲。癌癥治療起來不僅困難，而且在治病的過程中患者也要承受治療手段 和治療藥物吸收量少所帶來的巨大痛苦。因此如何更好地讓治療藥物發(fā)揮作用，尤其是使 用藥物載體進行給藥，已越來越受到各方面學者的廣泛關注。可以作為藥物載體的種類很 多，包括水凝膠、脂質體和磁性高分子微球等。在過去50年中，水凝膠由于其特殊的性能已 經受到廣泛的關注，主要原因之一就是其具有極強的儲水能力及靈活性，使它與人體自然 組織十分相似。水凝膠是指可以吸收水分使體積膨脹，并且能保持住所吸收的水分，且具有 三維網狀結構的聚合物?？梢酝ㄟ^將疏水基團和親水基團引入到水凝膠結構中，使親水基 團吸收水，而疏水性質的基團在吸收水之后體積變大的新型高分子聚合物。它們是通常含 羧酸等官能團的一類聚合物，具有可以與細胞組織等相互融合的性質和化學特性。和其他 載體比較，水凝膠和包載的藥品及酶之間彼此的吸引力比較小，而所結合在內部的藥物及 酶的活性也能在一定的時間段里維持不變。所以，水凝膠在生物類制劑，醫(yī)療及環(huán)境等方面 有許多應用，故在全球范圍內，科學研究者長久以來對研究設計水凝膠，一直保持著極大的 興趣。水凝膠之所以能夠在吸收了大量的水之后體積變大，這主要是由于吸附及膨脹、物理 吸附與化學吸附共同作用的結果，絕大多數是物理吸附在起作用，凝膠內部與外部的溶液 濃度差是其吸水體積變大的關鍵。而當外界條件改變時，網狀結構內部的水分流失，體積縮 小，此時水凝膠又會表現出退溶脹的行為，這種現象被稱為體積坍塌或相轉移。目前，水凝 膠的聚合手段包括:物理聚合、化學聚合、輻射聚合等幾大制備手段。物理交聯，顧名思義 是指水凝膠是通過物理作用力如分子纏繞、靜電作用、離子鍵、氫鍵作用、疏水作用等形成 凝膠。形成的凝膠也叫可逆水凝膠，是因為形成的網狀結構是非永久性的，將凝膠加熱后， 水凝膠又會變成溶液狀態(tài)。在使用化學方法合成水凝膠時，大多數情況要使用到交聯劑。但 是這樣又會對凝膠的載藥能力產生極大的影響，尤其是絕大多數交聯劑是有毒有害的物 質，因而所合成的水凝膠在進行下一步反應或使用之前，一定要除去沒有反應而殘留的交 聯劑?？墒牵谑褂梦锢斫宦摲ㄖ苽渌z的過程中，不涉及到交聯劑的使用問題，這樣制 備出來的水凝膠不需要除去多余的化學試劑，從而使其具有低毒、容易降解等優(yōu)點。正是其 如此突出的特點，使其備受生物醫(yī)學、藥學等領域的關注。水凝膠內部的分子鏈之間可以通 過彼此的相互作用形成水凝膠，主要包括有疏水締合作用，將親水單體和疏水單體加入到 水溶液中，其中親水單體作為主鏈，彼此連接在一起，而疏水單體與水溶液中的疏水表面活 性劑的疏水鏈段通過疏水締合作用連在一起，形成混合水凝膠，Jeong等利用疏水締合作用 制備了聚乳酸-聚羥基乙酸聚合物(PLGA);離子間相互作用，指的是帶不同電荷的幾種或多 種電解質彼此之間通過靜電相互作用聚合成膠束的過程；晶體交聯作用，指在溶液中隨著 溫度的變動，聚合物鏈段的運動速度改變，原有的結構遭到損毀，彼此之間交互形成微小的 晶體接點核，從而形成三維網絡結構的膠束;氫鍵交聯作用與晶體交聯相似，也是通過微小 的數個不均一的接點，進一步擴散形成網絡結構，只是這種作用力的分子間的氫鍵，如醇 類，羧酸類等聚合物就可以借助氫鍵交聯制備水凝膠，Yin等制備的水凝膠就是利用此方 法。在外界條件刺激下，分子鏈能夠通過鍵合作用組合成三維結構的行為，叫做化學交聯。 在化學交聯制備水凝膠的過程中要使用交聯劑，交聯劑是一種能在分子間起橋梁作用，從 而能夠讓分子鏈之間相互作用交聯成網絡結構，它是會直接影響聚合物成鍵的物質。采取 化學方法制成的水凝膠的反應原理是由于化學鍵鍵合形成的高分子聚合物，在加熱的過程 中不溶不熔，同時叫做永久性水凝膠。永久性水凝膠主要有單體聚合交聯和聚合物交聯。 可以合成水凝膠的單體的種類有很多根據酸堿性不同，可以分為酸性單體，如巴豆酸、苯乙 烯磺酸鈉等；中性單體，如η-乙烯基吡絡烷酮、丙烯酸胺衍生物等;堿性單體，如乙烯基吡啶 等?？梢杂糜诤铣伤z的單體在使用/不使用交聯劑的情況下，都能夠通過自由基共聚或 均聚等反應合成產物。通過所加交聯劑、引發(fā)劑的不同，進而合成出不同性質的材料。 Takehisa等通過單體聚合的方法制備的溫敏性聚Ν-異丙基丙烯酰胺納米復合凝膠不僅極 大的改善產品的機械性能，更是首次將鋰藻土用于水凝膠制備中。單體聚合法是使用最廣 泛的水凝膠合成方法，與其他方法相比，此方法制備的水凝膠結構更均一，方法更簡便，可 用于大規(guī)模生產。除了可以用單體來制備水凝膠之外，還可以使用聚合物來制備水凝膠，這 種方法在使用時如需用到交聯劑，所使用的交聯劑應具有親水性的官能團。輻射交聯指的 是使用電子束、紫外線或是r-光子等高能射線對大分子共聚物進行輻照，通過活性自由基 引發(fā)分子鏈交聯，從而形成水凝膠的過程。輻射聚合有其自身的優(yōu)勢，可以使不含雙鍵的親 水性物質也能聚合成高分子凝膠，如聚甲基丙烯酸羥乙酯（PHEMA)、聚乙烯基吡咯烷酮 (PVPhLegris等利用輻射交聯聚合的方法合成孔徑比較大的水凝膠聚合物。除此之外，其 他優(yōu)點包括:首先，在反應過程中不需要添加任何的化學試劑，例如引發(fā)劑、交聯劑等，所制 得的產物不需要后續(xù)的除雜過程，水凝膠的純度也比較高;其次，操作簡便，不需要經過高 溫;再次，通過調節(jié)能量及強度還可以實現對水凝膠的形貌和結構的改變;最后，在對產物 的表面進行改性的同時，進而達到對水凝膠的滅菌處理。雖然輻射交聯有以上種種優(yōu)點，但 是由于在制備時，對實驗設備要求嚴格，條件苛刻，所以輻射交聯并沒有被廣泛的應用于各 個領域。水凝膠根據其制備方法的不同，有多種分類方法。首先，依據來源可分為天然水凝 膠和人工合成水凝膠，天然水凝膠由于它的原料來自于自然界，與各生物體相似，所以天然 水凝膠的生物相容性要強于合成水凝膠，更由于原料的來源方便，價格優(yōu)廉，取材方便等特 點，備受社會各界學者的關注。但是天然水凝膠的穩(wěn)定性差，容易降解，機械強度不高等特 點，又進一步限制了其實際應用的可能性，所以學者們把目標轉向了合成水凝膠。人造水 凝膠在制備的過程中，可以通過改變反應條件，添加合適的引發(fā)劑、交聯劑等可以有效的改 變其性能，從而制備出理想的產物。但是合成凝膠由于制備的過程中使用的引發(fā)劑，交聯劑 等，在后續(xù)的反應處理中需要進一步除去，而且合成水凝膠所使用的原料大多來自于石油 行業(yè)，降解性差，從環(huán)保的角度出發(fā)，制備天然與合成相混合的水凝膠也許可以克服彼此的 弊端，發(fā)揮各自的長處，實現有機的結合;其次，按照制備手段的差異能夠分為物理凝膠和 化學凝膠，物理凝膠是指通過彼此之間的物理反應形成的水凝膠，而化學凝膠是指彼此之 間通過化學鍵的鍵合作用，并且運用化學合成的方法合成的水凝膠;再次，根據水凝膠的尺 寸和形狀不同，可以分為宏觀水凝膠和微觀水凝膠。微觀水凝膠的尺寸大小在5wii-50nm之 間的微米級及納米級。當前常用來制備微觀凝膠的方法有:反相懸浮法，指的是在反應過程 中使用溶解有引發(fā)劑的單體的水溶液作為分散相，使用油溶液作為分散介質進行聚合的方 法;反相微乳液聚合，將達到膠束濃度的臨界乳化劑加熱到一定溫度，之后依次加入油狀的 分散介質與水溶性的單體，在反應一段時間之后再加入引發(fā)劑，經過后續(xù)處理最終得到所 需的產物;沉淀聚合，是指將所有的實驗原料如引發(fā)劑、交聯劑、單體等一次性都加入反應 器中，在一段時間之后形成的膠體粒子交聯之后形成凝膠及無皂乳液聚合等;宏觀水凝膠 根據其形狀的不同又可以分為球形、網狀、柱形、海綿狀等。除此之外，還可以分為普通水凝 膠和智能水凝膠。其中智能水凝膠是指在外部的條件產生了一些改變之后，凝膠可以感受 到這些改變，甚至這些改變是微小的，這種變化不只是結構上的，有時連化學性質也會發(fā)生 改變，正是由于其對環(huán)境的敏感性使其成為在所有水凝膠中學者最感興趣的方向之一，尤 其是在傳感器、生物細胞工程、藥物釋放、醫(yī)藥等高端熱門領域。溫度敏感型水凝膠由于其 獨特的特性，在智能水凝膠中被廣大研究者所關注。這類水凝膠的吸水量及體積會隨著溫 度的變化而變化，在達到一定數值后體積會突然發(fā)生變化，這個溫度就是低臨界相轉變溫 度(LCST)。在其共聚物高分子鏈上攜帶有疏水的官能團，是這類凝膠的相同點，如丁基、異 丁基、甲基等。在這個溫度之前凝膠會吸水直至飽和，在這個溫度之后，凝膠又開始失水收 縮，溶脹比下降。這其中一個典型代表物質就是聚N-異丙基丙烯酰胺，它也是在溫度敏感性 水凝膠中研究最為詳細的。目前關于溫敏特性的機理的解釋還只停留在定性研究上，一種 觀點認為:這類凝膠之所以會表現出此類特性，是由于在聚合物中的親水集團與疏水基團 在一定程度上形成了一種動態(tài)平衡，平衡程度的不同將會影響聚合物水凝膠在水中的溶解 性的好壞。當溫度低于LCST時，水分子和親水性基團之間的氫鍵起主導，凝膠在水中呈現出 良好的水化狀態(tài);隨著溫度的升高，水分子間運動加劇，氫鍵被破壞，此時疏水基團與水分 子之間的范德華力也減弱，疏水基團之間的相互作用增強，三維網絡收縮，水分子被擠出凝 膠內部，水凝膠脫水收縮。也有人從熱力學的角度解釋這種現象，如Nemethy-Scheraga的疏 水相互作用理論。該理論認為由吉布斯自由能方程可知，在低溫時，吉布斯自由能變化小于 零，有利于聚合物擴散;在高溫時吉布斯自由能變化大于零，聚合物水凝膠發(fā)生團聚相變。 但是，現在還沒有一個讓人滿意的適用于所有范圍的實驗模型。溫敏性水凝膠一般可分為 兩種，一種根據凝膠在高溫時的體積變化不同，分為熱脹型水凝膠、熱縮型水凝膠，顧名思 義，就是熱脹型凝膠在低臨界相轉變溫度時表現為體積膨脹，凝膠吸水量變大;熱縮型凝膠 在低臨界相轉變溫度時體積收縮，吸水量變小，溶脹比變小。另一種是即成型水凝膠，這類 水凝膠在LCST時會發(fā)生溶液-凝膠的相轉變過程。Xue Yu-hua等人在Nac 1水溶液中，合成了 溫度和pH響應性聚(N-異丙基丙烯酰胺-co-丙烯酸)水凝膠，并討論了 Nacl濃度對水凝膠性 能的影響。研究表明：水凝膠的宏觀形貌表現相同，但是微觀形態(tài)卻大不一樣。Jiemi等設計 和制備一種新的熱敏性水凝膠HTCC-PEG-GP，并進行了一系列的結構表征，進行了載藥實 驗，結果表明：HTCC-PEG-GP配方由于可以提高親水性大分子對藥物的吸收，可以用在鼻腔 給藥系統(tǒng)。Byeongmoon等人制備了一種溫敏性的核殼結構的水凝膠，在37攝氏度水環(huán)境下 進行藥物包載實驗，形成的共聚物有較好的擴散情況。Daoyi等通過自由基聚合將溫敏性 的聚N-異丙基丙烯酰胺成功的引入到甲基丙烯酸丙酯中制備成水凝膠。在一定溫度范圍內 有很好的氧化性，并用其包載Ag離子，結果表明：這類凝膠可以作為食腐動物的氧化劑，以 及在處理被感染的傷口時，由于其有廣譜抗菌作用，而被用作抗生素。光敏感型水凝膠也是 一類智能水凝膠。光能作為一種清潔能源，近年來受到極大的關注，在地球污染日益嚴峻的 今天，綠色能源的使用無疑是緩解和解決問題的關鍵。同樣的對于智能水凝膠的開發(fā)與應 用也有著不可忽視的意義。光敏感型水凝膠，主要是由于凝膠的微觀結構中，帶有可以感受 光變化的基團。當這些基團遇到光線照射時，會引發(fā)光交聯、光異構化或光解離，從而導致 局部溫度升高或分子鏈構型改變，致使凝膠內部發(fā)生溶脹。如今越來越多的人開始意識到 健康的重要性，但是由于環(huán)境和生活習慣等原因，人類還是無法避免癌癥的侵襲;而對于作 為治療癌癥的藥物的載體也越來越受到廣泛的關注；如何實現藥物載體對人體無害、生物 相容性好、無毒副作用的特點是近幾年來研究的重點之一。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種溫度和pH雙敏感聚N-異丙基丙烯酰胺/羧甲基殼聚 糖/碳納米管(PNIPAM/CMCS/MWCNTs)半互穿網絡納米雜合水凝膠及其制備方法和應用，旨 在解決基于聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)均聚物水凝膠體積相轉變溫度(VPTT)比較低及 作為藥物釋放載體靶向性差的問題。
[0004] 為了實現上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案為:半互穿網絡納米雜合水凝膠的 制備方法，其特征在于，所述半互穿網絡納米雜合水凝膠的制備方法為將殼聚糖進行修飾， 制備成水溶性的羧甲基殼聚糖;再經N-異丙基丙烯酰胺、CMCS及碳納米管的原位自由基交 聯聚合反應，制備了不同N-異丙基丙烯酰胺、CMCS及碳納米管組成比例的半互穿網絡納米 雜合水凝膠。
[0005] 進一步，所述半互穿網絡納米雜合水凝膠的制備方法包括以下步驟：
[0006] 步驟一，稱取占 NIPAM和CMCS總質量1 %~10%的未功能化多壁碳納米管或羧基 功能化的多壁碳納米管，分散在1 〇ml去離子水中超聲分散1. Oh;
[0007] 接著，稱取1.4~1.94g N-異丙基丙烯酰胺溶解在10ml去離子水中，待到全部溶解 之后，加入0.6~0.06g羧甲基殼聚糖，PNIPAM與CMCS質量比：97%:3%，95% :5%，90%: 10%，80% :20%，70 % :30%，待兩者完全溶解之后，將混合溶液與上述碳納米管或羧基碳 納米管分散液合并;攪拌20~30分鐘之后加入占單體N-異丙基丙烯酰胺5wt%的N，N-亞甲 基雙丙烯酰胺，40μ1 N，N，g，M-四亞甲基乙二胺，持續(xù)攪拌；
[0008] 步驟二，待到完全溶解后，將占 N-異丙基丙烯酰胺質量2wt%的過硫酸鉀(KPS)加 入到反應混合物中，氮氣鼓泡20分鐘以除去溶解的氧，60°C下快速攪拌2小時，得到有彈性 的水凝膠;將反應之后的交聯產物用水沖洗并切成厚度4毫米的小塊狀，隨后用去離子水浸 泡7天，去除未反應的單體和交聯劑;將合成的水凝膠冷凍干燥機中-50°C冷凍干燥24小時 至恒重。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述半互穿網絡納米雜合水凝膠的制備方法制 備的半互穿網絡納米雜合水凝膠，所述半互穿網絡納米雜合水凝膠由質量比為90% :10% 的N-異丙基丙烯酰胺與羧甲基殼聚糖；占 N-異丙基丙烯酰胺與羧甲基殼聚糖總質量5%的 未功能化多壁碳納米管或羧基功能化的多壁碳納米管、占 N-異丙基丙烯酰胺5wt %的N，N-亞甲基雙丙烯酰胺，40μ1的Ν，Ν，Ν?-四亞甲基乙二胺、占 N-異丙基丙烯酰胺質量2wt%的 過硫酸鉀組成。
[0010]本發(fā)明的另一目的在于提供一種農業(yè)種植保水抗旱系統(tǒng)，所述農業(yè)種植保水抗旱 系統(tǒng)包含所述半互穿網絡納米雜合水凝膠的制備方法制備的半互穿網絡納米雜合水凝膠。 [0011]本發(fā)明的另一目的在于提供一種工業(yè)廢液處理系統(tǒng)，所述工業(yè)廢液處理系統(tǒng)包含 所述半互穿網絡納米雜合水凝膠的制備方法制備的半互穿網絡納米雜合水凝膠。
[0012] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種細胞組織工程，所述細胞組織工程包含所述半互 穿網絡納米雜合水凝膠的制備方法制備的半互穿網絡納米雜合水凝膠。
[0013] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種生物醫(yī)藥，所述生物醫(yī)藥包含半互穿網絡納米雜 合水凝膠的制備方法制備的半互穿網絡納米雜合水凝膠。
[0014] 本發(fā)明提供的聚N-異丙基丙烯酰胺/羧甲基殼聚糖/碳納米管水凝膠，與現有技術 相比，具有以下優(yōu)勢：
[0015] 1、通過N-異丙基丙烯酰胺、殼聚糖與碳納米管或羧基碳納米管的交聯聚合反應， 制備了一系列新型pH敏感與溫度敏感的聚N-異丙基丙烯酰胺/羧甲基殼聚糖/碳納米管 (PNIPAM/CMCS/CNTs (-⑶0H))半互穿網絡水凝膠。利用紅外光譜分析儀(FTIR)、熱分析 (TA)、環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM)對制備的水凝膠的結構、形貌等方面進行了表征;結果表 明：已成功合成聚N-異丙基丙烯酰胺/羧甲基殼聚糖/碳納米管水凝膠，并對所制備的一系 列水凝膠的溶脹性進行了表征，測定了溶脹性隨溫度和pH值變化的規(guī)律并對其進行了動力 學分析。兩種水凝膠都隨著時間的增加，溶脹性呈現增加的趨勢，并最后達到平衡。添加了 羧基碳納米管的水凝膠其溶脹曲線和最大溶脹比要明顯高于使用工業(yè)碳納米管制備的水 凝膠，兩種水凝膠都表現出明顯的pH值響應性與溫度響應性;添加羧基的碳納米管的凝膠 在不同pH值的溶液中的溶脹性要明顯好于使用工業(yè)納米管制備的凝膠。隨著溫度的升高， 溶脹性呈現規(guī)律性變化，并且在35~40°C左右發(fā)生相轉變。
[0016] 2、將使用CNTs-COOH所制備的一系列水凝膠的溶脹性進行了包載鹽酸阿霉素的藥 物試驗，并對其進行了體外藥物釋放研究，主要包括37°C和38°C兩個溫度進行了表征及其 動力學分析。結果表明：帶有不同含量（1 %、2 %、5 % )的羧基的碳納米管制備的PNIPAM/ CMCS/CNTs-COOH水凝膠，隨著納米管含量的增加，藥物的釋放量在不斷增大?？傮w的載藥量 大約在42%左右，并且藥物釋放量較高。同時所制備的聚合物凝膠具有緩慢釋放，定點給藥 的特點。
[0017] 3、用水凝膠做藥物載體時，將不同的藥物與載體復合，使藥物包封在在載體內，在 制定部位前不釋放或緩慢釋放，具有一定的靶向性，從而減少對健康組織的傷害，提高藥物 的利用率。
[0018] 4、使用聚合物水凝膠作為攜帶包覆用于疾病治療的藥物載體是國內外生物醫(yī)藥 等方面研究的重要內容，本發(fā)明制備的溫敏響應性的聚合物作為藥物釋放載體的應用具有 非常重要的理論價值和現實意義。
[0019] 5、使用溫敏性的N-異丙基丙烯酰胺、羧甲基殼聚糖和碳納米管等原料合成了 PNIPAM/CMCS/CNTs和PNIPAM/CMCS/CNTs-⑶0H聚合物凝膠。此聚合物水凝膠的具體組成使 用FT-IR、TA以及ESEM手段進行了檢測。FT-IR和ESEM研究表明，水凝膠具有三維網絡結構， 凝膠大體上呈現規(guī)整的多孔結構。納米管的加入對凝膠的形貌有較大影響，凝膠網絡中接 枝密度增加，凝膠網孔相對來說變小，但仍然保持著三維網狀多孔結構。制備的PNIPAM/ CMCS/CNTs-COOH水凝膠隨MWCNTs-COOH含量的提高微孔密度下降、微孔尺寸提高。
[0020] 6、對制備的 PNIPAM/CMCS/CNTs 和 PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH 聚合物水凝膠進行了室 溫下的溶脹行為測定。溶脹性研究表明，碳納米管的添加對溶脹性會產生影響，會使溶脹性 下降。隨著納米管含量的增加，樣品的溶脹性會呈現先增加后減少的趨勢，碳納米管含量是 5 %時會達到最大溶脹比。MWCNTs-COOH制備的水凝膠溶脹性優(yōu)于工業(yè)級碳納米管制備的水 凝膠。
[0021] 7、對制備的聚合物水凝膠的溫敏性和pH依賴行為進行了研究。結果表明：PNIPAM/ CMCS/CNTs和PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH兩種凝膠都表現出明顯的溫敏性，它們的體積相轉變 溫度即VPTT在35~40°C左右。而兩種水凝膠雖然都表現出明顯的pH值響應性，但是添加羧 基的碳納米管的凝膠無論是在酸性、中性和堿性溶液中的最大溶脹比，還是在不同pH值的 溶液中的規(guī)律性，都要明顯好于使用工業(yè)納米管制備的凝膠，這可能是由于羧基對不同pH 值溶液變化更加敏感有關。
[0022] 8、對制備的PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH聚合物水凝膠進行了包載鹽酸阿霉素的在37 °C和38°C的體外藥物釋放實驗。以鹽酸阿霉素為模擬藥物在凝膠中進行的藥物釋放研究顯 示:帶有不同含量（1 %、2 %、5 % )的羧基的碳納米管制備的PNIPAM/CMCS/CNTs-C00H水凝 膠，隨著納米管含量的增加，藥物的釋放量在不斷的增大。具有緩慢釋放，定點給藥的特點。
[0023] 9、聚合物水凝膠作為藥物載體在生物醫(yī)藥等方面將會有廣泛的應用。本發(fā)明中所 合成的水凝膠，通過對藥物的包載以及控制釋放發(fā)現，其在水溶液中均具有較好相容性。因 此，用它們作為靶向藥物釋放的載體，在未來將會有很好的發(fā)展。
[0024] 本發(fā)明通過優(yōu)化合成戰(zhàn)略與水凝膠配方組成，調控溶脹性能、熱響應溫度、pH響應 轉變點及藥物的承載與釋放，獲得一種具有良好的溶脹平衡、高的鹽酸阿霉素藥物承載量、 持續(xù)可控的藥物釋放行為的水凝膠藥物制劑。由此制備的本發(fā)明溫度和pH雙響應的 PNIPAM/CMCS/MWCNTs半互穿網絡納米雜合水凝膠可以避免口服時被胃酸和酶破壞，提高藥 物在胃中的穩(wěn)定性，降低藥物對胃的毒副效應，有效提高藥物的生物利用度及對腸道疾病 等的治療效率。因此，本發(fā)明溫度和pH雙響應的PNIPAM/CMCS/MWCNTs納米雜合水凝膠藥物 制劑可以作為一種有前途的親水性口服藥物載體，用于口服疫苗、多肽、蛋白質和D0X抗癌 藥物的靶向釋放，具有低毒性、可長期治療結腸等癌癥的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0025] 圖1是本發(fā)明實施例提供的聚N-異丙基丙烯酰胺/羧甲基殼聚糖/碳納米管水凝膠 的制備方法流程圖。
[0026] 圖2是本發(fā)明實施例提供的聚合物凝膠的紅外光譜圖；
[0027] 圖中：（a)PNIPAM水凝膠；（b)PNIPAM/CMCS水凝膠；（c)PNIPAM/CMCS/CNTs水凝膠； (d)純CNTs。
[0028] 圖3是本發(fā)明實施例提供的聚合物凝膠的熱分析圖；
[0029] 圖中：（a)純CNTs; (b)PNIPAM/CMCS水凝膠；（c)PNIPAM/CMCS/CNTs水凝膠（其中 CNTs ,wt% = 5% ) 〇
[0030] 圖4是本發(fā)明實施例提供的聚合物凝膠的ESEM圖；
[0031 ]圖中：（a)PNIPAM水凝膠；（b)PNIPAM/CMCS水凝膠；（c)純CNTs ; (d)PNIPAM/CMCS/ CNTs水凝膠。
[0032] 圖5是本發(fā)明實施例提供的聚合物凝膠在去離子水中室溫下的溶脹圖；
[0033] 圖中：（a)PNIPAM水凝膠；（b)PNIPAM/CMCS水凝膠；（c)PNIPAM/CMCS/CNTs水凝膠。
[0034] 圖6是本發(fā)明實施例提供的室溫下不同碳納米管(CNTs)質量含量的聚合物水凝膠 在室溫下的最大溶脹率圖。
[0035] 圖7是本發(fā)明實施例提供的不同比例的PNIPAM/CMCS水凝膠在室溫下，不同pH值下 的最大溶脹率圖；
[0036] 圖中：（a)97:3;(b)95:5;(c)90:10;(d)80:20;(e)70:30。
[0037] 圖8是本發(fā)明實施例提供的不同比例的PNIPAM/CMCS水凝膠在室溫下，不同pH值下 的最大溶脹率的柱狀圖；
[0038] 圖中：（1)97:3; (2)95:5; (3)90:10; (4)80:20; (5)70:30。
[0039] 圖9是本發(fā)明實施例提供的在室溫下，不同含量碳納米管（1%、2%、5%、7%和 10% )的PNIPAM/CMCS/CNTs水凝膠在不同pH值下的最大溶脹率圖。
[0040] 圖10是本發(fā)明實施例提供的在室溫下，不同含量碳納米管的水凝膠在不同pH值下 的最大溶脹率的柱狀圖；
[0041] 圖中：（1)1% ; (2)2%; (3)5%; (4)7%; (5)10%。
[0042]圖11是本發(fā)明實施例提供的不同比例的PNIPAM/CMCS水凝膠在不同溫度下的最大 溶脹率圖；
[0043] 圖中：（a)9:l;(b)8:2;(c)7:3。
[0044] 圖12是本發(fā)明實施例提供的不同含量碳納米管（2%、5 %和7% )PNIPAM/CMCS/ CNTs水凝膠在不同溫度下的最大溶脹率圖。
[0045] 圖13是本發(fā)明實施例提供的聚合物水凝膠的紅外圖；
[0046] 圖中：（a)PNIPAM/CMCS/CNTs-C00H水凝膠；（b)羧基碳納米管(MWCNT-C00H); (c)N-異丙基丙烯酰胺(NIPAM); (d)羧甲基殼聚糖(CMCS); (e)PNIPAM/CMCS水凝膠。
[0047] 圖14是本發(fā)明實施例提供的聚合物凝膠的熱分析圖；
[0048] 圖中：（a)純CNTs-COOH; (b)PNIPAM/CMCS水凝膠；（c)、（d)、（e)不同比例MWCNTs-C00H制備的 PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH 水凝膠：（c)l % ; (d)2%;(e)5%。
[0049] 圖15是本發(fā)明實施例提供的聚合物凝膠的ESEM圖；
[0050] 圖中：（a)PNIPAM水凝膠；（b)、（c)、（d)不同比例MWCNTs-COOH制備的PNIPAM/CMCS/ CNTs-C00H 水凝膠：（b)l%;(c)2%;(d)5%。
[0051 ]圖16是本發(fā)明實施例提供的PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH聚合物凝膠在室溫下的溶脹 圖。
[0052]圖17是本發(fā)明實施例提供的添加了不同質量分數的羧基碳納米管（1 %、2%和 5% )之后的聚合物凝膠在不同pH下溶脹比圖。
[0053] 圖18是本發(fā)明實施例提供的添加了不同質量分數的羧基碳納米管之后的聚合物 凝膠在不同pH下溶脹比的柱狀圖；
[0054] 圖中：（a)l%;(b)2%;(c)5%。
[0055] 圖19是本發(fā)明實施例提供的添加了不同質量分數帶有羧基的碳納米管（1%、2% 和5% )之后的聚合物凝膠在不同溫度下溶脹比圖。
[0056] 圖20是本發(fā)明實施例提供的PNIPAM/CMCS/MWCNTs-COOH水凝膠的平衡溶脹率 (ESR)隨溫度和pH值(A)以及相轉變溫度隨pH值(B)的變化曲線：（a)MWCNTs-COOH含量： 2wt % ;PNIPAM與CMCS質量比：90:10; (b)MWCNTs-COOH含量：5wt % ;PNIPAM與CMCS質量比：90 :10; (c)MWCNTs-COOH含量:5wt % ;PNIPAM與CMCS質量比：80:20。
[0057]圖21是本發(fā)明實施例提供的鹽酸阿霉素的紫外掃描譜圖。
[0058]圖22是本發(fā)明實施例提供的鹽酸阿霉素標準曲線圖。
[0059]圖23(A)是本發(fā)明實施例提供的不同含量的羧基碳納米管制備的PNIPAM/CMCS/ CNTs-COOH水凝膠在37 °C和38 °C的緩沖溶液中的藥物釋放曲線。圖23 (B)是對本發(fā)明實施 例圖22提供的三種不同含量羧基碳納米管PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH水凝膠在37°C和38°C下 的緩沖溶液中的動力學數據進行曲線模擬得到的線性回歸曲線。
[0060] 圖24是本發(fā)明實施例提供的在37 °C及pH為3.0，6.8和7.4的PBS溶液中，D0X從含有 MWCNTs-COOH質量含量5wt%的D0X@PNIPAM/CMCS/CNTs-C00H水凝膠藥物膠囊中的釋放動力 學曲線(A)及曲線模擬得到的線性回歸曲線(B)。
[0061] 圖25是本發(fā)明實施例提供的半互穿網絡納米雜合水凝膠的制備示意圖。
【具體實施方式】
[0062]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明 進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0063] 本發(fā)明將殼聚糖進行修飾，制備成水溶性的羧甲基殼聚糖，再與經過純化的N-異 丙基丙烯酰胺以及經過處理的碳納米管進行交聯，制備了一系列不同納米管含量的水凝 膠，同時考察了水凝膠隨著時間變化的吸水溶脹規(guī)律；以期制備具有溫敏性及pH響應行為 且適于藥物載體的性能良好的水凝膠。
[0064] 下面結合附圖對本發(fā)明的應用原理作詳細的描述。
[0065] 本發(fā)明實施例的聚N-異丙基丙烯酰胺/羧甲基殼聚糖/碳納米管水凝膠具體包括： N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM)1.8g、2%過硫酸鉀（KPS)0.04g、5%N，N-亞甲基雙丙烯酰胺 (813)0.18、〇1殼聚糖(〇3)0.28(9:1)、碳納米管(〇犯^)0.1(^。
[0066] 如圖1所示，本發(fā)明實施例的聚N-異丙基丙烯酰胺/羧甲基殼聚糖/碳納米管水凝 膠的制備方法包括以下步驟：
[0067] S101:稱取占 NIPAM和CMCS總質量1%~10%的未功能化多壁碳納米管(MWCNTs)或 羧基功能化的多壁碳納米管MWCNTs-COOH)，將其分散在10ml去離子水中超聲分散1 .Oh;
[0068] S102:稱取1.8g N-異丙基丙烯酰胺溶解在一定量的去離子水中，待到全部溶解之 后，加入0.2g羧甲基殼聚糖，待兩者完全溶解之后，將混合溶液與上述碳納米管或羧基碳納 米管分散液合并；攪拌20分鐘之后加入一定量的N，N-亞甲基雙丙烯酰胺及40μ1 N，N，N\ 四亞甲基乙二胺，持續(xù)攪拌；
[0069] S103:待到完全溶解后將過硫酸鉀加入到反應混合物中，氮氣鼓泡20分鐘以除去 溶解的氧，60°C下快速攪拌2小時，得到有彈性的水凝膠;將反應之后的交聯產物用水沖洗 并切成厚度4毫米的小塊狀，隨后用去離子水浸泡7天，去除未反應的單體和交聯劑;將合成 的水凝膠經冷凍干燥機_50°C冷凍干燥24小時至恒重。
[0070]半互穿網絡納米雜合水凝膠的制備示意圖如圖25:
[0071 ]下面結合實驗對本發(fā)明的應用原理作進一步的說明。
[0072] 1.2實驗部分
[0073] 1.2.1 試劑
[0074]表1實驗中所用的試劑和藥品
[0075]
[0076] 1.2.2制備方法
[0077]羧甲基殼聚糖的制備，具體的方法如下：純的殼聚糖10g加入到50mL的NaOH溶液 中，在20攝氏度下過夜堿化。之后將過量的堿溶液除去，將堿化后的甲殼素加入到一個 250mL的反應瓶中，將10g的氯乙酸溶解在40mL的異丙醇中，然后逐滴加入到反應瓶中。接下 來在60攝氏度，劇烈攪拌下回流4小時，抽濾之后，用乙醇調成中性，再用丙酮清洗3次，在35 攝氏度下干燥至恒重。
[0078] 聚(N-異丙基丙烯酰胺)/羧甲基殼聚糖/碳納米管水凝膠的制備。具體方法如下： 稱取一定量的未功能化多壁碳納米管或羧基功能化的多壁碳納米管，將其在去離子水中超 聲分散1.〇h。接著，稱取1.8g N-異丙基丙烯酰胺溶解在一定量的去離子水中，待到全部溶 解之后，加入一定量的羧甲基殼聚糖，待兩者完全溶解之后，將混合溶液與上述碳納米管或 羧基碳納米管分散液合并；攪拌20分鐘之后加入一定量的N，N-亞甲基雙丙烯酰胺及40μ1 Ν，Ν，Υ，Υ-四亞甲基乙二胺，持續(xù)攪拌；
[0079] 待到完全溶解后將過硫酸鉀加入到反應混合物中，氮氣鼓泡20分鐘以除去溶解的 氧，60°C下快速攪拌2小時。將反應之后的交聯產物用水沖洗并切成厚度4毫米的小塊狀，隨 后用去離子水浸泡7天，去除未反應的單體和交聯劑;將合成的水凝膠經冷凍干燥機-50°C 冷凍干燥24小時至恒重。
[0080] 本發(fā)明對于工業(yè)級碳納米管的添加量最大選取到10%，原因是當碳納米管含量加 入量過大時，水凝膠的成型結果不理想。而對于帶有羧基的碳納米管當添加量5%以上時凝 膠的溫度、pH值響應性都有所下降，并且當達到10%之后的成型效果也不理想，因此本發(fā)明 的水凝膠選取下表中的配方比例來進行制備：
[0081] 表2三種凝膠的合成配方
[0082]
[0084]注:去離子水20mL，表格中單位均為克(g)。
[0085]表3三種不同比例凝膠的合成配方 [0086]
[0087]注:去離子水20mL，表格中單位均為克(g)。
[0088] 1.2.3水凝膠的表征與測定
[0089]傅立葉變換紅外光譜儀(FT-IR，德國布魯克，Tensor27)分別對所制備的水凝膠的 結構進行表征分析，使用高溫干燥過的溴化鉀進行壓片法測定水凝膠在4000-400(^-1波長 范圍內的光譜。
[0090] 熱分析系統(tǒng)（TG，美國TA，Q1000DSC+LNCS+FACS Q600SDT)研究樣品的失重情況以 及物理化學變化，測試溫度范圍為:室溫~600°C，溫度精度為+/-0.05°C，溫度準確度為+/-0.1°C，測試條件為氮氣環(huán)境，氮氣流動速率為40mL/min，加熱速率為10°C .mirT1。
[0091] 掃描電鏡（SEM，FEI，Quanta 200)對水凝膠進行表面形貌、斷面形貌進行觀測，其 操作電壓為20kV。將需測試的樣品切成小塊后，平鋪在導電膠上，進行測試。
[0092] 1.3結果討論
[0093] 1 · 3 · 1 PNIPAM/CMCS/CNTs 水凝膠的紅外表征
[0094] 如圖2所示，PNIPAM/CMCS/CNTs水凝膠以及N-異丙基丙烯酰胺、碳納米管和各步聚 合產物的紅外譜圖，a圖中單體聚N-異丙基丙稀酰胺在16580^ 1處的特征吸收峰證明-C = 0 的存在，在1545CHT1處的吸收峰是-NH-的彎曲振動形成的，在3444CHT1處的吸收峰是-NH-的 伸縮振動形成的。以上所有說明PNIPAM的存在。b圖和c圖中PNIPAM/CMCS水凝膠和PNIPAM/ CMCS/CNTs水凝膠在3307cm-1與3539cm-1附近為-NH-和-OH的伸縮振動峰，1658cm- 1屬于-C = 〇的伸縮振動峰，而1545CHT1與1332CHT1處分別為酰胺Π 帶-NH-的面內彎曲振動峰和C-N的 伸縮振動峰;2973CHT1附近為甲基及次甲基的-C-H伸縮振動峰，1461CHT 1處為-C-H的不對稱 彎曲振動峰，而1384CHT1和1369cnf1處為典型的-CH( CH3) 2中雙甲基的對稱振動耦合分裂峰， 足以證明-CH(CH3)2的存在。圖d中碳納米管在1580cm-= 伸縮振動峰，990-680011+1為烯 烴的指紋區(qū)，1153CHT1處的振動峰是碳納米管管壁的振動峰，它說明在碳納米管是具有石墨 結構的，而3458CHT 1處的峰是屬于羥基的振動峰，這些羥基極可能是在原來購買的碳納米管 在制備的過程中引入的。以上特征吸收峰說明初步合成了PNIPAM/CMCS/CNTs水凝膠。
[0095] 1.3.2 PNIPAM/CMCS/CNTs聚合物凝膠的熱分析數據
[0096]如圖3所示，a樣品為碳納米管的熱分析圖，從圖中可以看出碳納米管很穩(wěn)定，到 600°C時碳納米管仍然有約95%的殘余;b樣品在最開始已經有質量損失，到130°C的損失是 由水、溶劑或者是聚合物表面的小分子的消去引起的，170~310°C可能損失的是一部分結 合水，而320°C之后為聚合物分子結構中的支鏈或者是一些在側位的官能團的分解以及 PNIPAM/CMCS骨架或其中的各組分的C-C鍵的斷裂分解反應，直至最后全部分解完全;c樣品 50~130°C的質量損失是由于水凝膠在制備的干燥的過程中吸收了空氣中的水分進而氣化 揮發(fā)掉以及結晶水的消失而產生的。170~340 °C有一個平穩(wěn)期，可能有極少量結合水的損 失，而350°C之后開始可能涉及聚合物接枝鏈或側基的斷裂或分解以及PNIPAM/CMCS骨架 或其中的各組分的C-C鍵的斷裂分解反應，并且由于c樣品是加有碳納米管的水凝膠，
[0097] 所以有約3.7 %的殘余。從以上數據可以看出初步制備了PNIPAM/CMCS和PNIAPM/ CMCS/CNTs 水凝膠。
[0098] 1 · 3 · 3 PNIPAM/CMCS/CNTs聚合物凝膠的掃描數據
[0099] 如圖4所示a圖是純的聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠的掃描圖，結果顯示水凝膠具有 三維網絡結構，其大體上呈現規(guī)整的多孔構型.；b圖是添加了羧甲基殼聚糖之后的水凝膠 掃描圖，在添加了羧甲基殼聚糖之后水凝膠的三維結構仍然是多孔的網狀結構;c圖是純的 碳納米管的掃描電子顯微鏡的圖，圖中顯示其具有一種隨機分布、纏繞分散的狀態(tài);d圖是 添加了碳納米管之后的水凝膠，可以看出碳納米管的加入對凝膠的形貌有較大影響，凝膠 網絡中接枝密度增加，凝膠網孔相對來說變小，但仍然保持著三維網狀多孔結構。
[0100] 1.3.4 PNIPAM/CMCS/CNTs聚合物凝膠在室溫下的溶脹性研究
[0101 ] 1.3.4.1三種不同聚合物水凝膠在室溫下的溶脹度
[0102]如圖5所示，a樣品是聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠在室溫下的溶脹率隨時間的改變 情況，結果顯示隨著時間的變化凝膠急速吸水，溶脹比迅速增大，7個小時以后溶脹基本達 到平衡，已達到最大溶脹比；b樣品是在添加了羧甲基殼聚糖(wt%，PNIPAM:CMCS = 9:l)以 后的溶脹圖，結果表明在添加了羧甲基殼聚糖以后，凝膠也是快速吸水，體積和溶脹性增 大，但幾小時后就達到了平衡;c樣品是在添加了0. lg(CNTs Content 5wt% )納米管之后的 凝膠吸水溶脹圖，可以看出在溶脹剛開始時，凝膠也會吸水，之后達到平衡。雖然羧甲基殼 聚糖和碳納米管的添加使得凝膠的吸水溶脹度降低，但是這使得凝膠具有了 pH值響應性以 及提高了凝膠的載藥釋放能力，使得其在藥物釋放等應用中有其獨特的前景。
[0103] 1.3.4.2碳納米管含量對水凝膠溶脹性的影響
[0104] 如圖6所示，碳納米管(CNTs)質量分數不同的聚合物水凝膠在室溫下的最大溶脹 率，結果顯示隨著添加碳納米管(CNTs)質量分數的增加，溶脹率呈現出先增加后減少的趨 勢。在添加到5 %時達到最大溶脹率，這可能是由于納米管添加到一定含量之后，其吸水性 能就會下降，所以初步說明質量分數5%的碳納米管可能是較佳的選擇。
[0105] 1 · 3 · 5 PNIPAM/CMCS/CNTs聚合物凝膠的pH依賴行為
[0106] 用NIPAM所制備的水凝膠具有溫度響應性，為了制備既具有溫度敏感性又具有pH 敏感性的水凝膠，在本工作中引入羧甲基殼聚糖作為pH敏感單元。圖7為添加了不同比例的 羧甲基殼聚糖后制備的水凝膠在室溫下，隨著pH值的改變溶脹率的改變。從圖7可以明顯的 看到，經過改性的羧甲基殼聚糖中，帶有羧基和一部分氨基，在酸性溶液中，氨基會發(fā)生質 子化，從而增加了其水溶性，溶脹率增大;在堿性溶液中，羧基會發(fā)生電離，形成羧酸鹽，增 加了其水溶性，進而溶脹率增大。在PH7.4的溶液下，水凝膠具有最低的溶脹率。這說明所合 成的PNIAPM/CMCS水凝膠具有良好的pH值響應性，并且羧甲基殼聚糖含量的雖然不同，但是 轉變點位置不變。當CMCS含量降低到一定值之后，水凝膠的pH值響應性變得不再明顯，可能 與水凝膠中CMCS低的含量所帶的兩性基團含量減少有關。從圖7中可以進一步看出，隨N-異 丙基丙烯酰胺的含量增加，水凝膠的溶脹性增加。因此，在同時考慮溶脹性和pH響應性的前 提下，NIPAM: CMCS質量比為90:10的凝膠可能是較佳的選擇。
[0107] 為了進一步確定NIPAM與CMCS的最優(yōu)配比，進行了如下分析：
[0108] 如圖8所示，從柱狀圖中可以明顯看出：PNIPAM/CMCS水凝膠在酸性溶液(pH= 3.0) 和中性條件下(pH=7.4)中聚N-異丙基丙烯酰胺與羧基殼聚糖質量之比為97:3的水凝膠的 最大溶脹比明顯高于其他幾種比例的水凝膠。這可能是由于羧甲基殼聚糖質量越少，對凝 膠的三維網狀結構的影響越少，使得在酸性和中性條件下羧甲基殼聚糖添加量越少，溶脹 性越強;在堿性溶液(pH= 10.8)中，聚N-異丙基丙烯酰胺與羧甲基殼聚糖質量之比為97:3 的水凝膠的最大溶脹比仍然明顯高于其他幾種比例的水凝膠，甚至高于其自身在酸性和中 性溶液中的最大溶脹比。并且也可以看出，當羧甲基殼聚糖減少到一定比例之后，水凝膠雖 然仍然具有pH值響應性，但是其響應性明顯減小。
[0109] 因此結論為所制備的PNIPAM/CMCS水凝膠具有pH值響應性，并且從pH響應性的結 果中，可以得出90:10的比例是較好的聚N-異丙基丙烯酰胺與羧甲基殼聚糖質量比例的結 論。
[0110] 如圖9所示，是添加了不同質量分數碳納米管（1 %、2 %、5 %、7 %、10%)制備的 PNIPAM/CMC/CNTs水凝膠在室溫下，隨著pH值的改變，溶脹率的改變?？梢钥闯鰩追N水凝膠 均具有明顯的pH值響應性。說明在添加碳納米管之后，對水凝膠本身的pH響應性沒有受到 影響。為了更明顯直觀的分析pH響應性，繪制了圖10。
[0111] 如圖10所示，從圖中可以看出：所制備的水凝膠具有明顯的pH值響應性，并且隨著 碳納米管含量的增加，PNIPAM/CMCS/CNTs水凝膠的最大溶脹率先增大，在碳納米管含量為 5 %時達到最大，之后減小。因此初步可以判斷碳納米管含量5 %的PNIPAM/CMCS/CNTs水凝 膠在不同pH值下的最大溶脹率要高于其他幾種比例的水凝膠。
[0112] 1.3.6 PNIPAM/CMCS/CNTs聚合物凝膠的溫度響應性
[0113] 基于上述pH響應性的測定結果，選取三種比例殼聚糖制備的水凝膠進行溫度響應 性測定，如圖11所示。從圖11可以看出：聚N-異丙基丙烯酰胺-羧甲基殼聚糖水凝膠具有明 顯的溫敏性，在低溫是表現出快速吸水，保持水的能力也較強；隨著溫度的升高，在體積相 轉變溫度32°C左右，凝膠出現急劇的相轉變，開始失水，表現出具有退溶脹的行為，體積變 小;再隨著溫度的繼續(xù)升高，凝膠不再失水，體積也保持不變。這主要是由于N-異丙基丙烯 酰胺具有溫度相應性，使得以此為原料制得的水凝膠也表現出明顯的溫敏性。從圖11中還 可以看出，隨著羧甲基殼聚糖含量的增加，水凝膠的溶脹性能逐漸減小。這與低含量NIPAM 水凝膠中更少的交聯網絡有關。
[0114]從上述pH的測定結果中，選取三種添加不同質量分數工業(yè)碳納米管制備的水凝膠 進行溫度響應性測定，如圖12所示。從圖12可以看出：PNIPAM/CMCS/CNTs水凝膠表現出明 顯的溫度響應性，總體趨勢是在低溫時凝膠的溶脹率大，吸水性能強;在32°C左右時達到相 轉變溫度時，凝膠的吸水性能下降，凝膠大量失水體積變小，發(fā)生相轉變;在37°C之后，失水 率達到最大，體積達到最小直至不再變化。并且從圖中可以看出碳納米管含量5 %的 PNIPAM/CMCS/CNTs水凝膠在不同溫度下的最大溶脹率要高于其他的配比。
[0115] 1 · 3 · 7 PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH聚合物凝膠的紅外表征
[0116] 如下圖 13 所示，分別對 MWCNT-⑶ CMCS/CNTs-COOH水凝膠進行了紅外表征。從圖中的特征峰可以看出，在3285CHT1與3513CHT 1 附近為-NH-和-OH的伸縮振動峰，在1660cnf1屬于-C = 0的伸縮振動峰，而1546cnf1處為酰胺 Π 帶-NH-的面內彎曲振動峰;2973CHT1附近為甲基及次甲基的-C-H伸縮振動峰，1460CHT1處 為-C-H的不對稱彎曲振動峰，而1369cnf 1處為-CH3甲基的振動峰，足以證明-CH(CH3) 2的存 在，1170cm-1處為羧基的-C-0伸縮振動峰。對于b圖中在3318cm- 1處為羧基碳納米管上-OH的 伸縮振動峰，1696CHT1處為-C = 0的伸縮振動峰，1168CHT1處為碳納米管管壁的振動峰，以上 特征吸收峰初步說明PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH水凝膠已經生成。
[0117] 1 · 3 · 8 PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH聚合物凝膠的熱分析數據
[0118] 如圖14所示，a、b樣品是純的MWCNTs-COOH和PNIPAM/CMCS水凝膠的熱分析數據圖。 從圖中可以看出，a樣品MWCNTs-C00H比較穩(wěn)定，600 °C有約91 %的剩余;b樣品PNIPAM/CMCS 在600 °C時幾乎全部分解。c、d、e樣品是添加不同比例MWCNTs-⑶0H制備的PNIPAM/CMCS/ CNTs-C00H水凝膠：（c)l%;(d)2%;(e)5%。三種水凝膠的熱分析圖整體趨勢相同，均在一 開始就有質量損失，50~150°C的質量損失是由于水凝膠在制備的干燥的過程中吸收了空 氣中的水分進而氣化揮發(fā)掉以及結晶水的消失而產生的。170~350 °C有一個平穩(wěn)期，可能 有極少量結合水的損失，而350°C之后開始可能涉及聚合物接枝鏈或側基的斷裂或分解以 及PNIPAM/CMCS骨架或其中的各組分的C-C鍵的斷裂分解反應，直至最后c樣品幾乎全部分 解完全，d樣品略有剩余，e樣品剩余約為10%。說明MWCNTs-COOH含量為5%時穩(wěn)定性略好于 1 %、2 %。從以上所有可以看出初步合成PNIAPM/CMCS/CNTs-COOH水凝膠。
[0119] 1 · 3 · 9 PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH聚合物凝膠的掃描數據
[0120] 如圖15所示，添加了不同質量分數的羧基碳納米管與純的聚N-異丙基丙烯酰胺水 凝膠的掃描圖。從圖中可以看出，沒有添加任何其他物質的純的PNIPAM水凝膠的三維網狀 結構疏松，孔徑不完整，具有多孔結構。隨著添加的羧基碳納米管含量的增加，凝膠的三維 網狀多孔結構更加完整，凝膠網絡中接枝密度增加。制備的PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH水凝膠 隨MWCNTs-COOH含量提高微孔密度下降、微孔尺寸提高。
[0121] 1.3.10 PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH聚合物凝膠在室溫下的溶脹行為
[0122] 如圖16所示，添加了不同比例的羧基碳納米管的PNIPAM/CMCS/CNTs-⑶0H水凝膠 在室溫下隨時間變化的溶脹曲線。首先，從圖中可以看出，3種水凝膠的總體趨勢都是隨著 時間的變化，其吸水量不斷增加，體積不斷變大，溶脹比也逐漸增大，大約在6小時左右達到 平衡，體積不再變化，凝膠不再吸水，此時溶脹比達到最大值;其次，從圖中可以知道，隨著 羧基納米管含量的增加，水凝膠的溶脹比逐漸增大，與前面所研究的隨著碳納米管(CNTs) 質量分數的增加，溶脹率呈現增加的趨勢相同。
[0123] 1 · 3 · 11 PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH 聚合物凝膠的 pH 依賴行為
[0124] 如圖17所示，室溫下，為添加了不同質量分數（1 %、2%、5%)羧基碳納米管的 PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH水凝膠的隨pH變化的溶脹比?？梢钥闯鰩追N水凝膠具有明顯的pH 值響應性。說明在添加碳納米管之后，對水凝膠本身的pH響應性沒有產生影響。
[0125] 為了更明顯直觀的分析pH響應性，繪制了圖18:
[0126] 如圖18所示，在酸性條件下即pH = 3.0時，隨著碳納米管含量的增加，PNIPAM/ CMCS/CNTs-COOH水凝膠的最大溶脹率逐漸增加，羧基碳納米管含量在5%達到最大溶脹 率，約為9.21;在中性條件下即pH= 7.4時，隨著碳納米管含量的增加，PNIPAM/CMCS/CNTs-C00H水凝膠的最大溶脹率逐漸增加，羧基碳納米管含量在5 %達到最大溶脹率，約為6.03; 在堿性條件下即pH= 10.8時，隨著碳納米管含量的增加，PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH水凝膠的 最大溶脹率逐漸增加，羧基碳納米管含量在5 %達到最大溶脹率，約為8.67。并且PNIPAM/ CMC/CNTs-C00H水凝膠表現出明顯的pH值響應性。
[0127] 1.3.12 PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH聚合物凝膠的溫度敏感性
[0128] 如圖19所示，添加不同質量分數的羧基碳納米管制得的PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH 水凝膠隨溫度變化的溶脹比。從圖中可以看出，PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH水凝膠表現出明顯 的溫度響應性，總體趨勢是在低溫時凝膠的溶脹率大，吸水性能強;在32°C左右時達到相轉 變溫度，發(fā)生吸水率下降，凝膠大量失水體積變小，發(fā)生相轉變;在37 °C之后，失水率達到最 大，體積達到最小直至不再變化。并且從圖中可以看出隨著羧基碳納米管的添加量的增加， 水凝膠的溶脹行為發(fā)生規(guī)律性的變化，即溶脹比逐漸增大。
[0129] 本發(fā)明分別用工業(yè)級納米管和帶有羧基的碳納米管，制備了 PNIAPM/CMCS/CNTs與 PNIAPM/CMCS/CNTs-⑶0H水凝膠，其結構經過FT-IR，SEM和TA進行了驗證，各項測量結果均 符合預期結構。對所合成的兩種聚合物凝膠的溶脹性能、pH敏感響應性、溫度敏感響應性進 行了研究，兩種水凝膠都隨著時間的增加，溶脹性呈現增加的趨勢，并最后達到平衡，隨著 納米管含量的增加，樣品的溶脹性會呈現先增加后減少的趨勢，碳納米管添加量5%時會達 到最大溶脹比。添加了羧基碳納米管的水凝膠其溶脹曲線和最大溶脹比要略高于使用工業(yè) 碳納米管制備的水凝膠，這可能與羧基的添加增大了其凝膠的親水性有關;兩種水凝膠都 表現出明顯的pH值響應性，并且添加羧基的碳納米管的凝膠在酸性、中性和堿性溶液中的 最大溶脹比，要明顯好于使用工業(yè)納米管制備的凝膠，在不同pH值的溶液中規(guī)律性也更加 明顯，這可能是由于羧基對不同pH值溶液變化更加敏感有關;兩種水凝膠都表現出明顯的 溫度響應性，隨著溫度的升高，呈現規(guī)律性變化，并且均在32°C左右發(fā)生相轉變，兩者的差 異性不是特別明顯。這可能是由于兩者都是用了具有溫度敏感性的N-異丙基丙烯酰胺有 關?？傊砑郁然技{米管制備的PNIAPM/CMCS/CNTs-COOH水凝膠總體性能要優(yōu)于無任何 基團的碳納米管所制備的水凝膠。
[0130] 本發(fā)明水凝膠的熱敏相轉變溫度依賴于環(huán)境pH值，如圖20所示。隨著pH變化，添加 5wt %MWCNTs_C00H 及 PNIAPM/CMCS 質量比為 90:10 的 PNIPAM/CMCS/MWCNTs-COOH 水凝膠的熱 敏相轉變溫度從約36度移向39°C。特別是在pH<6.8的酸性腫瘤和胃中，或在pH>7.4的堿 性腸道中，高于37°C的相轉變溫度有利于可控持續(xù)的藥物釋放。水凝膠的熱敏相轉變溫度 也取決于體系組成。隨著CMCS含量提高，在pH = 4.8到6.8之間，熱敏相轉變溫度輕微提高； pH<4.8時，靜電排斥使熱敏相轉變溫度提高;pH> 6.8時，-⑶0-的離子效應導致水凝膠在 高溫下收縮。因此，相轉變溫度隨著CMCS含量提高而提高。而降低MWCNTs-COOH含量，相轉變 溫度在pH> 6.8時降低;pH< 6.8時提高。因此，本發(fā)明水凝膠表現出pH調制的熱敏性能。通 過將PNIPAM網絡、CMCS和麗CNTs或麗CNTs-⑶0H加以組合，并調制體系組成和它們的比例， 就可以設計開發(fā)出一種具有希望的溫度敏感性及溶脹能力的新穎水凝膠。
[0131] 下面結合PNIPAM/CMCS/CNTs水凝膠對鹽酸阿霉素的藥物釋放行為作新的說明
[0132] 2.2實驗部分
[0133] 2.2.1實驗原材料、試劑及其處理
[0134] 2.2.1.1鹽酸阿霉素(D0X)對照品儲存液的制備及最大吸收峰的測定
[0135] 精確稱取鹽酸阿霉素（98%，阿拉丁試劑有限公司）5mg，置于10mL的容量瓶中定 容，制的500ug/ml的對照品儲存液。用紫外分光光度計，測試D0X對照品儲存液，測得鹽酸阿 霉素在200-800nm波長范圍內有明顯的紫外吸收，取最大吸收峰480nm作為特征吸收波長， 圖21。
[0136] 2.2.1.2標準曲線的繪制
[0137] 用微量進樣器分別精確移取D0X對照品儲備液2、5、10、15、25uL容量瓶中，分別稀 釋至刻度。配制0.02、0.05、0.10、0.15、0.25耶/1111濃度的鹽酸阿霉素，在?!17.4的緩沖溶液 中。采用紫外分光光度計在480nm處測定吸光度Abs，以溶液的濃度c對吸光度A作圖，得到鹽 酸阿霉素的標準工作曲線，圖22。每隔一段時間取釋放介質，測定取出樣在480nm處的吸光 度，用濃度校正法定量計算鹽酸阿霉素溶液的濃度。其校正方程方程為:Abs=Kl · C+K0。
[0138] 2.2.1.3包載鹽酸阿霉素的過程
[0139] 分別選取PNIPAM水凝膠、PNIPAM/CMCS水凝膠(PNIPAM:CMCS為9:1)、使用不同含量 MWCNTs-COOH制備的PNIPAM/CMCS/CNTs-⑶0H水凝膠，各20mg左右的干凝膠塊，置于2mg/mL 的鹽酸阿霉素的水溶液中，室溫下浸泡3天。將已吸附鹽酸阿霉素的凝膠塊在真空狀態(tài)下干 燥至衡重，最后得到含有鹽酸阿霉素的干凝膠塊。載藥凝膠的包封率(LC)和藥物負載效率 (EE)的計算公式如下所示：
[0140] 包封率(wt% )=(水凝膠中所包附的藥物質量/起始加入的共聚物質量）X 100% 公式(3_1)
[0141] 藥物負載效率(wt% )=(水凝膠中所包附的藥物質量/起始加入的藥物質量）X 100% 公式(3-2)
[0142] 2.2.1.4藥物釋放過程
[0143] 紫外分析:采用紫外-可見分光光度計(U-3900/3900H，Titachi Corp.，Japan)定 量測量一定間隔藥物釋放的濃度。
[0144] 體外藥物釋放是通過模擬人體生理環(huán)境條件(不同溫度下pH = 7.4的介質溶液中） 進行研究的。具體過程為:稱取一定量含有鹽酸阿霉素的干凝膠，置于37°C和38°C的100mL 的pH=7.4的緩沖溶液作為釋放環(huán)境，100次/min的恒溫震蕩器中。每隔一段時間取4mL釋放 溶液，同時加入4mL的新鮮的pH = 7.4的緩沖溶液以保持體積不變。以沒有載藥的水凝膠作 為空白對照，在同樣的時間間隔取樣。用紫外分光光度計在最大吸收峰480nm處的吸光度來 定量樣品濃度，空白樣品用來扣除降解產物對于紫外測試的影響。
[0145] 藥物的累積釋放量通過下面關系式來計算：
[0146] 藥物積累釋放量％=1*/%\100 公式(3-3)
[0147] 式中Mt代表在t時刻從水凝膠中釋放出來的藥物量，Mo為聚合物水凝膠的載藥量， 是通過載藥后凝膠的總質量減去未包藥之前的凝膠的質量得到的。
[0148] 2.3.1水凝膠的包封率和載藥量
[0149] 如表4所示，在添加了羧基納米管之后制備的水凝膠的LC和EE值隨著羧基碳納米 管含量的增加而增加，LC值分別是20.61 %、21.28%和22.02 %，EE值分別是41.21%、 42.57 %和44.05 %，說明添加羧基碳納米管可以增大其載藥量。
[0150] 表4載藥凝膠的包封率和載藥量
[0151]
[0152] 2.3.2水凝膠的藥物釋放研究
[0153] 如圖23(A)所示，在37°C不同含量的羧基碳納米管制備的PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH 水凝膠，（1)藥物釋放量在40%左右；（2)藥物釋放量在45%左右；（3)藥物釋放量在50%左 右。在38°C不同含量的羧基碳納米管制備的PNIPAM/CMC/CNTs-COOH水凝膠，（1)藥物釋放量 在60%左右；（2)藥物釋放量在62%左右；（3)藥物釋放量在82%左右?？梢钥闯鲭S著納米管 含量的增加，藥物的釋放量在不斷的增大，這可能是由于碳納米管的添加，會改變凝膠三維 網絡結構的孔徑大小和密度，進而使得載藥量不同，并且也會影響釋放過程中藥物的釋放 量，同時藥物的釋放過程還有許多其他條件相關。并且從釋放曲線中，可以看出，釋放的過 程是一個緩慢釋放的過程，而對于載藥的載體來說是否能夠在到達病變部位之前保持藥 物不泄露，對致病的效果影響尤其重要。進而可以得出PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH水凝膠可以 包載鹽酸阿霉素抗癌藥物，并且緩慢釋放。
[0154] 如圖 23 (A)所示，PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH 水凝膠在 37 °C 和 38 °C 的pH7 · 4 緩沖溶液 中的釋放量。對于溫度敏感性的水凝膠，在其溫度高于LCST時，主要是采取收縮釋放模式對 藥物進行釋放的。38°C是病變癌癥部位的溫度，而37°C是人體的正常溫度。從圖中可以看出 所制備的PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH水凝膠能達到緩慢釋放的目的，同時在38°C的藥物釋放 要高于37°C的釋放量，這有利于藥物的定點給藥。
[0155] D0X的釋放也依賴于釋放介質的pH值。D0X在37 °C及pH為3.0,6.8和7.4的roS溶液 中，從含有MWCNTs-COOH質量含量5wt %的D0X@PNIPAM/CMCS/CNTs-C00H水凝膠藥物膠囊中 的釋放結果如圖24(A)所示。在pH = 3.0和7.4的介質中，水凝膠的相轉變溫度高于37°C，而 且pH = 3.0時的轉變溫度高于pH = 7.4時的轉變溫度；而在pH = 6.8時，相轉變溫度低于37 °C。因此，水凝膠的收縮隨著pH從3.0到7.4,再到6.8而提高，從而使更多的藥物釋放出來。 相應地，D0X的釋放速率隨pH從3.0到7.4再到6.8而提高?？紤]到人體胃的pH大約為1-3，腸 道中為7.4，腫瘤細胞為5.7-7.2，本發(fā)明溫度和pH雙響應的水凝膠可以提高藥物在胃中的 穩(wěn)定性，避免口服時藥物受到胃酸及酶的進攻而破壞，減小藥物對胃的毒性效應，有效地提 高藥物在腸道中的生物利用度和治療效率。
[0156] 2.3.3聚合物凝膠的動力學分析
[0157] 為了更好的研究鹽酸阿霉素的釋放行為，根據上述藥物釋放數據采用Ritger-Peppas模型模擬D0X的傳輸機制。
[0158] Mt/M~=ktn 公式（3-4)
[0159] ln(Mt/M〇〇) = ln(k)+n ln(t) 公式(3-5)
[0160] 式中Mt和Μ~分別對應于t時刻的釋放量和藥物總量，k是一個反應藥物釋放率的 動力學常數，通過二元回歸方程最小二乘法計算得到，η是一個釋放機制函數中的指數，當η <0.5時，主要以擴散釋放為主，當0.5<η<1時，擴散較為無規(guī)則，當η=1時，主要是通過 Fi ckian擴散控制釋放，當η = 0.5時，釋放過程為零級釋放。
[0161] 線性回歸模擬結果如圖23(B)，24(Β)和表5所示，是不同羧基碳納米管含量的 PNIPAM/CMCS/MWCNTs-COOH水凝膠的動力學圖。由公式3-4和3-5可知，本發(fā)明水凝膠藥物制 劑樣品的η值從0.3808到0.4636，均小于0.5，表明阿霉素在不同配方的聚合物中的釋放機 制是基本相同，遵循Ficken擴散定律。而鹽酸阿霉素的快速釋放與不同溫度下載藥凝膠具 有較高動力學常數k密切相關。
[0162] 表5帶有羧基水凝膠的鹽酸阿霉素釋放的回歸方程和動力學參數
[0163]
[0164] 本發(fā)明將用帶羧基碳納米管制備的PNIPM/CMCS/CNTs-COOH水凝膠進行包載鹽酸 阿霉素的藥物包載試驗，并對其在PH7.4的緩沖溶液中，不同溫度進行了體外藥物釋放研究 及其動力學分析，得到如下結論：帶有不同含量（1%、2%、5%)的羧基的碳納米管制備的 PNIPAM/CMCS/CNTs-COOH水凝膠，隨著納米管含量的增加，藥物的釋放量在不斷的增大，在 38°C的藥物釋放量要明顯高于37°C的釋放量，并且都能達到緩慢釋放的目的。且能做到定 點釋放。這可能是由于碳納米管會改變凝膠三維網絡結構的孔徑大小和密度，進而使得包 載藥量不同，并且也會影響釋放過程中藥物的釋放量，同時藥物的釋放過程還有許多其他 條件相關。總體的載藥量大約在42%左右，并且藥物釋放量較高?？傮w的動力學數據表明， 阿霉素在不同配方的聚合物中的釋放機制是基本相同，遵循Ficken擴散定律。聚合物水凝 膠在37 °C和38 °C時，η值均小于0.5，表明鹽酸阿霉素的釋放機制是Fi ckian擴散，而鹽酸阿 霉素的快速釋放與不同溫度下載藥凝膠具有較高動力學常數k密切相關。
[0165] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種半互穿網絡納米雜合水凝膠的制備方法，其特征在于，所述半互穿網絡納米雜 合水凝膠的制備方法為將殼聚糖進行修飾，制備成水溶性的羧甲基殼聚糖;再經N-異丙基 丙烯酰胺、CMCS及碳納米管的原位自由基交聯聚合反應，制備了不同N-異丙基丙烯酰胺、 CMCS及碳納米管組成比例的半互穿網絡納米雜合水凝膠。2. 如權利要求1所述的半互穿網絡納米雜合水凝膠的制備方法，其特征在于，所述半互 穿網絡納米雜合水凝膠的制備方法包括以下步驟： 步驟一，稱取占 NIPAM和CMCS總質量1 %~10%的未功能化多壁碳納米管或羧基功能化 的多壁碳納米管，分散在1 〇ml去離子水中超聲分散1. Oh; 稱取1.4~1.94g N-異丙基丙烯酰胺溶解在10ml去離子水中，待到全部溶解之后，加入 0.6~0.06g羧甲基殼聚糖，PNIPAM與CMCS質量比：97% :3%，95% :5%，90% :10%，80%: 20%，70 % :30%，待兩者完全溶解之后，將混合溶液與上述碳納米管或羧基碳納米管分散 液合并;攪拌20~30分鐘之后加入占單體N-異丙基丙烯酰胺5wt%的N，N-亞甲基雙丙烯酰 胺，40μ1 N，N，Y，Y-四亞甲基乙二胺，持續(xù)攪拌； 步驟二，待到完全溶解后，將占 N-異丙基丙烯酰胺質量2wt%的過硫酸鉀(KPS)加入到 反應混合物中，氮氣鼓泡20分鐘以除去溶解的氧，60°C下快速攪拌2小時，得到有彈性的水 凝膠;將反應之后的交聯產物用水沖洗并切成厚度4毫米的小塊狀，隨后用去離子水浸泡7 天，去除未反應的單體和交聯劑;將合成的水凝膠冷凍干燥機中-50 °C冷凍干燥24小時至恒 重。3. -種如權利要求1所述半互穿網絡納米雜合水凝膠的制備方法制備的半互穿網絡納 米雜合水凝膠，其特征在于，所述半互穿網絡納米雜合水凝膠由質量比為90% :10%的N-異 丙基丙烯酰胺與羧甲基殼聚糖；占 N-異丙基丙烯酰胺與羧甲基殼聚糖總質量5%的未功能 化多壁碳納米管或羧基功能化的多壁碳納米管、占 N-異丙基丙烯酰胺5wt%的N，N-亞甲基 雙丙烯酰胺，40μ1的Ν，Ν，Ν?-四亞甲基乙二胺、占 N-異丙基丙烯酰胺質量2wt%的過硫酸 鉀組成。4. 一種農業(yè)種植保水抗旱系統(tǒng)，其特征在于，所述農業(yè)種植保水抗旱系統(tǒng)包含權利要 求1和2所述半互穿網絡納米雜合水凝膠的制備方法制備的半互穿網絡納米雜合水凝膠。5. -種工業(yè)廢液處理系統(tǒng)，其特征在于，所述工業(yè)廢液處理系統(tǒng)包含權利要求1和2所 述半互穿網絡納米雜合水凝膠的制備方法制備的半互穿網絡納米雜合水凝膠。6. -種細胞組織工程，其特征在于，所述細胞組織工程包含權利要求1和2所述半互穿 網絡納米雜合水凝膠的制備方法制備的半互穿網絡納米雜合水凝膠。7. -種生物醫(yī)藥，其特征在于，所述生物醫(yī)藥包含權利要求1和2所述半互穿網絡納米 雜合水凝膠的制備方法制備的半互穿網絡納米雜合水凝膠。
【文檔編號】A61K47/34GK106084278SQ201610247993
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年4月20日 公開號201610247993.1, CN 106084278 A, CN 106084278A, CN 201610247993, CN-A-106084278, CN106084278 A, CN106084278A, CN201610247993, CN201610247993.1
【發(fā)明人】羅延齡, 張雪銀, 付婧玉, 徐峰
【申請人】陜西師范大學