快速解除丙酸積累的復(fù)合菌及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了提供快速解除丙酸積累的復(fù)合菌的制備方法，該方法包括如下步驟：1)以右旋糖酐廢水厭氧消化器出水為原始接種物，以丙酸鈉作為碳源，進(jìn)行接種培養(yǎng)至培養(yǎng)物中丙酸降解率達(dá)到50?80％，甲烷含量為30?50％；2)將步驟1)所得物轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，并按每ml步驟1)所得物中的培養(yǎng)液，加入如下細(xì)菌：Pelotomaculum schinkii 2.5?5×107個(gè)、Pelotomaculum propionicicum1?2.5×107個(gè)、Syntrophobacter wolinii 1?3×106個(gè)、Methanospirillum hungatei 0.4?1.4×107個(gè)、Methanoculleus palmolei 0.5?1.4×107個(gè)、Methanoculleus bourgensis 0.5?1.4×107個(gè)、Methanosarcina barkeri0.5?2.5×107個(gè)、Methanosarcina mazei 1?3×107個(gè)；將步驟2)所得物進(jìn)行密封培養(yǎng)，即得所述快速解除丙酸積累的復(fù)合菌。本發(fā)明還提供了上述復(fù)合菌在厭氧消化技術(shù)中，特別在沼氣發(fā)酵的應(yīng)用。本發(fā)明所得復(fù)合菌能快速高效的解除丙酸的積累，大幅提升厭氧消化的效率和穩(wěn)定性。
【專利說(shuō)明】
快速解除丙酸積累的復(fù)合菌及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及快速解除丙酸積累的復(fù)合菌及其制備方法和 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 厭氧消化技術(shù)常用于處理有機(jī)廢物(如城市污水、工業(yè)廢水和農(nóng)業(yè)廢料）。在厭氧 消化技術(shù)中，有機(jī)酸(丙酸、丁酸和乙酸)積累常常導(dǎo)致有機(jī)負(fù)荷過(guò)高和酸化現(xiàn)象，造成厭氧 消化工藝運(yùn)行效率低、穩(wěn)定性差，嚴(yán)重影響了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。
[0003] 丙酸是有機(jī)廢棄物厭氧轉(zhuǎn)化過(guò)程中的一種重要中間產(chǎn)物。丙酸比其它揮發(fā)性脂肪 酸更加難以降解，原因在于丙酸的降解需要更多的能量和更低的氫分壓。這使得丙酸的降 解成為影響厭氧消化的效率和穩(wěn)定性至關(guān)重要的問(wèn)題。因此，獲得高效水解丙酸的菌系，快 速解除丙酸積累，對(duì)提高厭氧消化運(yùn)行效率和穩(wěn)定性具有重要的意義。
[0004]然而，目前所知具有丙酸氧化能力的細(xì)菌只有為數(shù)不多幾類，如Pelotomaculum和 Methanospirillum。然而，現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)丙酸實(shí)現(xiàn)完全水解通常需要三個(gè)月以上，即使在 2013年實(shí)現(xiàn)了對(duì)水解周期的縮短，但對(duì)高濃度丙酸卻無(wú)法實(shí)現(xiàn)很好的水解。
[0005] 因此，亟待尋找能夠快速且高效水解丙酸的菌系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的之一在于提供快速解除丙酸積累的復(fù)合菌的 制備方法，該方法包括如下步驟：
[0007] 1)以右旋糖酐廢水厭氧消化器出水為原始接種物，以丙酸鈉作為碳源，進(jìn)行接種 培養(yǎng)至培養(yǎng)物中丙酸降解率達(dá)到50-80%，甲烷含量為30-50% ;
[0008] 2)將步驟1)所得物轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，并按每ml步驟1)所得物中的細(xì)胞，加 入如下細(xì)菌：
[0009]
[0010] 3)將步驟2)所得物進(jìn)行密封培養(yǎng)，即得所述快速解除丙酸積累的復(fù)合菌。
[0011] 丙酸的厭氧氧化反應(yīng)是一個(gè)吸熱反應(yīng)（吉布斯自由能AG>0)，不能自發(fā)發(fā)生。但 是，當(dāng)其與氫營(yíng)養(yǎng)型的產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)時(shí)，氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌將其產(chǎn)生的氫氣轉(zhuǎn)化為甲烷， 降低反應(yīng)體系中的氫分壓，此時(shí)AG〈0,丙酸的厭氧氧化過(guò)程可以自發(fā)進(jìn)行，這一過(guò)程也可 稱為丙酸的互營(yíng)氧化。
[0012] 然而，雖然研究人員對(duì)上述原理已然知曉，但如何穩(wěn)定而高效的解除丙酸積累，是 一直尚未攻克的難題。
[0013] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)的摸索發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將上述細(xì)菌進(jìn)行互配時(shí)，可以顯著 的促進(jìn)丙酸的積累的解除。如本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例所示，由本發(fā)明制備方法所得復(fù)合菌可 以在啟動(dòng)后11天內(nèi)便可完全的水解濃度高達(dá)15000m g//L的丙酸鈉。原因可能在于本發(fā)明復(fù) 合菌系對(duì)包含丁酸和乙酸在內(nèi)的有機(jī)酸均有較好的水解功能，從而維持了厭氧發(fā)酵的正常 運(yùn)行。但盡管有如此推測(cè)，本發(fā)明所得的效果依然令人驚訝。
[0014] 優(yōu)選的，在步驟1)接種時(shí)，接種量為1-20 %，培養(yǎng)條件為于25-55°C、pH= 6.0-9.0 下密封培養(yǎng)。
[0015] 本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)大量的生理生化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在上述培養(yǎng)條件下所得的效果較 好。
[0016] 優(yōu)選的，步驟1)中，丙酸鈉的添加量為1000-15000mg/L。
[0017] 優(yōu)選的，步驟1)和步驟2)中所用培養(yǎng)基，按每升培養(yǎng)基計(jì)，包括lg NH4Cl，lg酵母 粉，lg胰蛋白胨，〇.5g半胱氨酸鹽酸鹽，50ml大量元素溶液，10ml微量元素溶液，10ml維生素 141，10mg 刃天青；所述大量元素每升包括 6g KH2P〇4，12g NaCl，2g MgCl2.6H20，1.6g CaCl2 · 2H20;所述微量元素溶液每升包括12.8g氨基三乙酸，1.35g FeCl3 · 6H20,0.1g MnCl2 · 4H20,0.1g C0CI2 · 6H20,0. lg ZnCl2,0.025g CuCl2 · 2H20,0 . Olg H3B03,0.024g Na2Mo〇4 · 2H20，lg NaCl，0.12g NiCh · 6H20,0.026g Na2Se03 · 5H20。
[0018] 優(yōu)選的，步驟3)中培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度為25-55°C，pH為6.0-9.0。
[0019] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述方法制備得到的復(fù)合菌。
[0020] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述復(fù)合菌在厭氧消化上的應(yīng)用，特別是在沼氣發(fā) 酵上的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明所得復(fù)合菌能快速高效的解除丙酸的積累，可以在8天 內(nèi)完全水解濃度為3000mg/L的丙酸鈉，對(duì)于濃度高達(dá)15000mg/L的丙酸鈉也可以在11天內(nèi) 完全水解;本發(fā)明所得復(fù)合菌解除了發(fā)酵酸化帶來(lái)的不利影響，使得厭氧消化的效率和穩(wěn) 定性大為提升。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為本發(fā)明復(fù)合菌對(duì)丙酸的水解能力圖；
[0023]圖2為復(fù)合菌群對(duì)pH的適應(yīng)能力圖；
[0024]圖3為復(fù)合菌群對(duì)丙酸鈉的代謝能力圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只是用 于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練 人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 [0026]下述實(shí)施例中所用的BCTY培養(yǎng)基的配方為:按每升培養(yǎng)基計(jì)，由lg NH4Cl，lg酵母 粉，lg胰蛋白胨，〇.5g半胱氨酸鹽酸鹽，50ml大量元素溶液，10ml微量元素溶液，10ml維生素 141，10mg 刃天青；所述大量元素每升包括 6g KH2P〇4，12g NaCl，2g MgCl2.6H20，1.6g CaCl2 · 2H20;所述微量元素溶液每升包括12.8g氨基三乙酸，1.35g FeCl3 · 6H20,0.1g MnCl2 · 4H20,0.1g C0CI2 · 6H20,0. lg ZnCl2,0.025g CuCl2 · 2H20,0 . Olg H3B03,0.024g Na2Mo〇4 · 2H20，lg NaCl，0.12g NiCh · 6H20,0.026g Na2Se03 · 5H20組成。
[0027] 實(shí)施例1
[0028] 配制厭氧的BCTY培養(yǎng)液，加入終濃度為3000mg/L的丙酸鈉，分裝150ml于250ml厭 氧瓶中，接種10% (V/ν)右旋糖酐廢水厭氧消化器出水，密封，40°C靜止培養(yǎng)。待丙酸降解率 達(dá)到80%，甲烷含量為50%左右，按照以下三種方案添加功能菌株(個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)液）：
[0029] 方案一 ：Pelotomaculum schinkii 2 · 5 X 107，Pelotomaculum propionicicum 1 X 107，Syntrophobacter wolinii 1 X 106，Methanospiri 1 lum hungate i 4X106， Methanoculleuspalmolei 5X 106，Methanoculleus bourgensis 5X 106，Methanosarcina barkeri 5X 106，Methanosarcina mazei 1X107。
[0030] 方案二：Pelotomaculum schinkii 4 X 107，Pelotomaculum propionicicum 1.5 X 107，Syntrophobacter wolinii 3 X 106，Methanospiri 1 lum hungatei 1.4X107， Methanoculleuspalmolei 1X 107，Methanoculleus bourgensis 1X 107，Methanosarcina barkeri 1 ·5X 107，Methanosarcina mazei 2X107。
[0031] 方案三：Pelotomaculum schinkii 5 X 107，Pelotomaculum propionicicum 2.5 X 107，Syntrophobacter wolinii 3 X 106，Methanospiri 1 lum hungatei 1.4X107， Methanoculleuspalmolei 1 · 4 X 107，Methanocul leus bourgensis 1.4X107， Methanosarcina barkeri 2·5X107，Methanosarcina mazei 3 X107；
[0032] 密封，40°C靜止培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)丙酸降濃度和甲烷產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖1。實(shí)施例2復(fù)合菌群 對(duì)pH的適應(yīng)能力
[0033] 配制厭氧的BCTY培養(yǎng)液，加入終濃度為3000mg/L的丙酸鈉，分裝150ml于250ml厭 氧瓶中，接種20% (V/V)右旋糖酐廢水厭氧消化器出水，密封，20°C靜止培養(yǎng)。待丙酸降解率 達(dá)到70 %，甲烷含量為40 %左右，按照以下方案添加功能菌株（個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)液）： Pelotomaculum schinki i 5 X 107，Pelotomaculumpropionicicum 2.5Χ107， Syntrophobacter wolinii 3 X 106，Methanospiri 1 lum hungate i 1.4X107， Me thanocul 1 euspalmo 1 e i 1 · 4 X 107，Methanocul leus bourgensis 1.4X107， Methanosarcina barkeri 2 · 5 X 107，Methanosarcina mazei 3X107。
[0034] 密封，20°C靜止培養(yǎng)，獲得水解丙酸產(chǎn)甲烷復(fù)合菌群。將獲得的菌群分別接種于pH 6.0，pH 7.0，pH 8.0，pH 9.0的新鮮BCTY培養(yǎng)基中，接種量20%(V/V)，丙酸終濃度為 3000mg/L，監(jiān)測(cè)丙酸濃度和甲烷產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)圖2。
[0035]實(shí)施例3復(fù)合菌群對(duì)丙酸鈉的代謝能力
[0036] 配制厭氧的BCTY培養(yǎng)液，加入終濃度為10000mg/L的丙酸鈉，分裝150ml于250ml厭 氧瓶中，接種1%(v/v)右旋糖酐廢水厭氧消化器出水，密封，55°C靜止培養(yǎng)。待丙酸降解率 達(dá)到50 %，甲烷含量為30 %左右，按照以下方案添加功能菌株（個(gè)細(xì)胞/ml培養(yǎng)液）： Pelotomaculum schinki i 5 X 107，Pelotomaculumpropionicicum 2.5Χ107， Syntrophobacter wolinii 3 X 106，Methanospiri 1 lum hungate i 1.4X107， Me thanocul 1 euspalmo 1 e i 1 · 4 X 107，Methanocul leus bourgensis 1.4X107， Methanosarcina barkeri 2.5X 107,Methanosarcina mazei 3X107。
[0037] 密封，55°C靜止培養(yǎng)，獲得水解丙酸產(chǎn)甲烷復(fù)合菌群。將獲得的菌群接種于pH 7.0 的新鮮BCTY培養(yǎng)基中，接種量1 % (V/V)，丙酸終濃度分別為lg/L，3g/L，5g/L，7g/L，10g/L， 15g/L，20g/L，30g/L，密封，40 °C靜止培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液中的丙酸相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)圖3。
[0038] 丙酸相對(duì)含量=監(jiān)測(cè)時(shí)發(fā)酵液中的丙酸濃度(mg/L)/培養(yǎng)液中的初始丙酸濃度 (mg/L) X100%〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 快速解除丙酸積累的復(fù)合菌的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟： 1) 以右旋糖酐廢水厭氧消化器出水為原始接種物，以丙酸鈉作為碳源，進(jìn)行接種培養(yǎng) 至培養(yǎng)物中丙酸降解率達(dá)到50-80%，甲烷含量為30-50% ; 2) 將步驟1)所得物轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)，并按每ml步驟1)培養(yǎng)液，加入如下細(xì)菌： Pelotomaculum schinkii 2·5_5 X107個(gè) Pelotomaculum propionicicum 1-2.5X107個(gè) Syntrophobacter wolinii 1-3 X106個(gè) Methanospirilium hungatei 0.4-1·4X107個(gè) Methanoculleuspalmolei 0.5-1 ·4Χ 107 個(gè) Methanoculleus bourgensis 0.5-1.4X107個(gè) Methanosarcina barkeri 0 ·5_2·5 X107個(gè) Methanosarcina mazei 1-3X107個(gè)； 3) 將步驟2)所得物進(jìn)行密封培養(yǎng)，即得所述快速解除丙酸積累的復(fù)合菌。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟1)接種時(shí)，接種量為1-20 %，培養(yǎng)條 件為于25-55°C、pH=6.0-9.0下密封培養(yǎng)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)中，丙酸鈉的添加量為1500-10000mg/L〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)和步驟2)中所用培養(yǎng)基，按每升培 養(yǎng)基計(jì)，包括lg NH4C1，lg酵母粉，lg胰蛋白胨，0.5g半胱氨酸鹽酸鹽，50ml大量元素溶液， 10ml微量元素溶液，10ml維生素141，10mg刃天青；所述大量元素每升包括6g KH2PO4,12g NaCl，2g MgCl2 · 6H20，1.6g CaCl2 · 2H20;所述微量元素溶液每升包括12.8g氨基三乙酸， 1.35g FeCb · 6H20,0.1g MnCl2 · 4H20,0.1g C0CI2 · 6H20,0.1g ZnCl2,0.025g CuCl2 · 2H20,0.01g H3B03,0.024g Na2Mo04 · 2H20,lg NaCl,0.12g N1CI2 · 6H20,0.026g Na2Se03 · 5H20〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟3)中培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為25-55 Γ，ρΗ*6·0-9·0。6. 權(quán)利要求1-5所述方法制備得到的復(fù)合菌。7. 權(quán)利要求6所述的復(fù)合菌在厭氧消化上的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用為在沼氣發(fā)酵上的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK106085926SQ201610725109
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月25日
【發(fā)明人】馬詩(shī)淳, 黃艷, 凡慧, 鄧宇, 施國(guó)中, 張敏, 王春芳, 尹小波
【申請(qǐng)人】農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所