一種重組VEGF與GnRH融合蛋白的基因工程菌的構(gòu)建的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，本發(fā)明公開提供了關(guān)于一種重組VEGF與GnRH的大腸桿菌菌株及制備方法。本發(fā)明提供的大腸桿菌菌株BL21(DE3)/VGD，CCTCC NO：M2016132。該工程菌含有重組質(zhì)粒pET32a?VEGF?M2?GnRH3?hinge?MVP?NRLLLTG，質(zhì)粒上有重組突變VEGF基因，該基因具有SEQ ID NO.1所示的基因序列。BL21(DE3)/VGD菌株經(jīng)乳糖誘導(dǎo)，可高效表達(dá)重組蛋白VEGF I?M2?GnRH3?hinge?MVP?NRLLLTG。該重組蛋白預(yù)期可以提高機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，打破免疫耐受，達(dá)到識(shí)別和殺滅腫瘤細(xì)胞的目的，對(duì)于抗腫瘤治療具有很好的臨床應(yīng)用前景。CCTCC NO：M201613220150321
【專利說明】
一種重組VEGF與GnRH融合蛋白的基因工程菌的構(gòu)建
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 在基因工程領(lǐng)域，本發(fā)明公開了一種新型融合蛋白重組工程菌及其構(gòu)建方法，以 及該融合蛋白的純化。
【背景技術(shù)】
[0002] 重組質(zhì)粒是指在基因工程的領(lǐng)域，將目的基因和載體結(jié)合成一個(gè)具有自我復(fù)制能 力的DNA分子，繼而轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染入宿主菌株或細(xì)胞，篩選出含目的基因的重組子。
[0003] 基因工程(Genetic engineering):是以分子遺傳學(xué)為理論基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和 微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來源的基因按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分 子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性、獲得新品種、生產(chǎn)新產(chǎn)品，通過基因工程 技術(shù)可構(gòu)建和表達(dá)具有多種功能的新型目的蛋白。
[0004] 腫瘤疫苗按抗原成分的類型可分為腫瘤細(xì)胞型疫苗、腫瘤抗原多肽及蛋白疫苗、 DNA疫苗和樹突狀細(xì)胞疫苗等。無論何種類型的腫瘤疫苗，其研制的關(guān)鍵都在于選擇合適的 針對(duì)腫瘤的靶抗原和提高免疫原性。
[0005] 腫瘤細(xì)胞會(huì)表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原，針對(duì)這些抗原發(fā)展起來的腫瘤 特異性免疫治療，是腫瘤生物治療的重要方法。
[0006] 腫瘤相關(guān)抗原（Tumor-associated antigen，TAA):指并非某一種腫瘤所特有，在 其他腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞上也存在的抗原分子。正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞僅在增殖中有量的差 異，因此稱為相關(guān)抗原。
[0007] 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor)，即VEGF，是內(nèi)皮特 異性的有絲分裂原，能增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的生存能力，促進(jìn)有絲分裂，誘導(dǎo)毛細(xì)血管新生、增加 微血管通透性使腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞移行和抑制凋亡等多種功能。大多數(shù)腫瘤細(xì)胞均 高水平表達(dá)VEGF，而正常組織中僅腎、卵巢等少數(shù)臟器有較高水平的表達(dá)，因此VEGF是抗腫 瘤血管治療理想的靶部位。
[0008]目前應(yīng)用單克隆抗體、小分子抑制物、可溶性受體等方法通過阻斷其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通 路或耗竭腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生VEGF，抑制腫瘤血管生成，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用。以腫瘤 血管生成為靶點(diǎn)的靶向治療，主要集中在抗VEGF治療上。目前針對(duì)VEGF途徑的基因療法，在 腫瘤的治療中前景比較樂觀。VEGFm突變體I是本實(shí)驗(yàn)室用破傷風(fēng)毒素兩個(gè)強(qiáng)T輔助表位 618-627和831-838替換hVEGFm的1-8和115-121兩個(gè)肽段。結(jié)果說明在保持半胱氨酸原有 二聚體結(jié)構(gòu)的前提下，破傷風(fēng)毒素兩個(gè)強(qiáng)T輔助表位hVEGF非關(guān)鍵殘基置換后，可有效提高 VEGF的免疫原性。
[0009] 促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone，GnRH)由下丘腦特定神 經(jīng)元細(xì)胞合成，并以脈沖方式通過垂體門脈循環(huán)分泌到垂體前葉，與垂體細(xì)胞膜上高親和 力的GnRH受體(GnRHR)特異地結(jié)合，引發(fā)FSH和LH的合成與釋放，從而促進(jìn)性腺中類固醇激 素的合成。通過誘導(dǎo)高滴度的抗GnRH-I抗體來中和機(jī)體內(nèi)的GnRH-I，可抑制其與垂體上I型 GnRHR的結(jié)合，導(dǎo)致LH和FSH等促性腺激素釋放水平明顯下降，下調(diào)類固醇類激素的合成，降 低對(duì)腫瘤細(xì)胞的供應(yīng)，對(duì)激素依賴性腫瘤有良好的治療效果。同時(shí)GnRH可通過抑制V EGF等 的表達(dá)下調(diào)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管再生作用以及調(diào)控或作用于生長(zhǎng)因子，如在前列腺癌細(xì)胞 中GnRH-A具有抗EGF/TGFa系統(tǒng)作用，降低細(xì)胞分裂;也可能涉及細(xì)胞凋亡的誘發(fā)或者抑制 細(xì)胞內(nèi)諸如P13/PKB等信號(hào)通道。因此GnRH及其受體是腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。
[0010] GnRH-I是一種小分子半抗原，免疫原性很弱，單獨(dú)將其作為疫苗很難引起免疫應(yīng) 答，因此本實(shí)驗(yàn)室利用輔助T表位來提高GnRH-I的免疫原性。研究表明，麻疹病毒融合蛋白 序列中的288-302氨基酸片段是一個(gè)典型的T表位(SEIKGVIVRLEGVAK，下文均簡(jiǎn)稱MVP)，可 用于人用疫苗而且不會(huì)產(chǎn)生明顯的針對(duì)該T表位的抗體。有研究表明，含有多拷貝線性連接 的自身肽序列蛋白的免疫原性可以得到極大的提高，因而，本實(shí)驗(yàn)室將編碼三段首尾相連 的GnRH-I的核苷酸片段克隆入高效表達(dá)載體。還有研究表明，半抗原的二聚體能產(chǎn)生很強(qiáng) 的免疫原性。人IgGl鉸鏈區(qū)（hinge region)寡肽片段226-232/226'-232'（CPPCPAP/ CPPCPAP)是天然免疫蛋白的樞軸。本實(shí)驗(yàn)將與DnaK多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域有著高度親和力的多肽 片段NRLLLTG融合在先前所構(gòu)建的GnRH-I多肽疫苗融合蛋白的C-端。因此，本設(shè)計(jì)是在編碼 GnRH-I重復(fù)序列和MVP的核苷酸序列之間引入該寡肽片段的相應(yīng)核苷酸序列，希望GnRH-I 能藉此形成二聚體，增強(qiáng)免疫原性。
[0011]由于單獨(dú)用VEGF或GnRH免疫原性相對(duì)較低，且從多個(gè)位點(diǎn)共同作用于腫瘤已經(jīng)成 為趨勢(shì)。本發(fā)明將VEGFmI_M2基因同GnRH基因連接起來，組建pET32a-VEGF I-M2-GnRH3-hinge-MVP-Dnak binding site重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，將其作為疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生 主動(dòng)免疫，打破免疫耐受，產(chǎn)生針對(duì)VEGF和GnRH特異性肽段的抗體，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明公開一種表達(dá)重組VEGF融合蛋白的基因工程菌。
[0013] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供該重組菌的制備方法，方法簡(jiǎn)便，易于操作。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是公開該重組蛋白的純化方法。
[0015] 在本發(fā)明的第一個(gè)方面，該大腸桿菌菌株命名為Escherichia coli BL21(DE3)/ VGD: pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，菌株已提交中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保 藏地址：中國(guó)、武漢、武漢大學(xué)。保藏日期：2015年3月21日，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2016132， 分類命名為Escherichia coli BL21/pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，其細(xì)胞 中含有重組質(zhì)粒pET32a-VEGF-M2-GnRH 3-hinge-MVP-NRLLLTG，質(zhì)粒中含有SEQ ID NO. 1 所示 的重組突變VEGF基因序列。
[0016] 在本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了該重組質(zhì)粒的制備方法，其技術(shù)路線詳述如下：
[0017] 1 ·重組質(zhì)粒pET32a-VEGF I-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG及相應(yīng)基因工程菌的構(gòu) 建
[0018] 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已有的關(guān)于重組質(zhì)粒pET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NR LLLTG和pET28a-VEGF I-M2的序列信息，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5和01igo7來設(shè)計(jì)引物 VI、V2。上游引物VI中引入Nco I，下游引物V2中引入BamH頂每切位點(diǎn)以及GSGSG連接肽序 列。采用PCR技術(shù)從pET28a-VEGF I-M2質(zhì)粒中克隆得到基因 VEGF I-M2-GSGSG。通過Nco I和 BamH I雙酶切、T4連接酶連接和轉(zhuǎn)化技術(shù)將PCR的產(chǎn)物VEGF I-M2-GSGSG插入pEDGD質(zhì)粒載 體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)中，得到中間轉(zhuǎn)化子pET28a-VEGF-M 2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，再通過 N co I和Hind III雙酶切、T4連接酶連接，將目的基因插入pET32a組成重組質(zhì)粒pE T32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli BL21獲得需要的重 組基因的工程菌。
[0019] 2.融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
[0020] 將重組工程菌進(jìn)行活化，接種至含氨芐霉素的LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜，按1:100 轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)至A600值為0.5-0.8時(shí)，加入乳糖(終濃度7mM)進(jìn)行誘導(dǎo) 表達(dá)，7h后離心收取菌體沉淀，進(jìn)行15%SDS-PAGE分析，觀察目的蛋白條帶位置和表達(dá)量。
[0021] 3.融合蛋白的分離純化
[0022] 收集菌體，每克濕菌體加入10mL菌體裂解緩沖液溶解，菌體超聲裂解后，離心收集 上清。經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀，篩選出目的蛋白主要沉降時(shí)的硫酸銨飽和濃度并收集此時(shí)的沉 淀。將沉淀復(fù)融于離子交換液中，4°C攪拌至充分溶解，離心收集上清。上清裝于8000-14000KDa的透析袋中，對(duì)離子交換液于4°C充分透析，離心棄沉淀，上清液過陰離子交換柱 DEAE-cellulose做進(jìn)一步純化，用濃度梯度為0-1M NaCl層析緩沖液梯度洗脫，收集洗脫 峰，檢測(cè)合并目的蛋白峰組分，蒸餾水充分透析后凍干保存。
【附圖說明】
[0023] 圖1重組質(zhì)粒構(gòu)建原理示意圖。
[0024] 圖2 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物VEGFmI-M2-GSGSG基因的結(jié)果。
[0025] Lanel :Protein Marker，Lane2:VEGFmIHVl2-GSGSG基因
[0026] 圖3質(zhì)粒pET28a-VEGFmI-M2_GSGSG基因的正向測(cè)序圖
[0027] 圖4 重組質(zhì)粒pET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG(pED⑶）基因的正向 測(cè)序圖。
[0028] 圖5 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG目的基因的結(jié) 果。
[0029] Lane 1: Protein Marker，Lane2:重組質(zhì)粒，Lane3:單酶切驗(yàn)證，Lane4:雙酶切得到 V⑶基因
[0030] 圖 6 重組質(zhì)粒 pET28a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG(pEDVG2)的基因正向測(cè) 序圖。
[0031] 圖7 0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG基因的結(jié)果。
[0032] Lane 1: Prote in Marker，Lane2:重組質(zhì)粒，Lane3:單酶切驗(yàn)證，Lane4:雙酶切得到 V⑶基因
[0033] 圖8 重組質(zhì)粒pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG(pET32a-VG)的基因正 向測(cè)序圖。
[0034]圖9 15%SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組菌經(jīng)乳糖誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的誘導(dǎo)曲線。
[0035] Lanel :Protein Marker，Lane2:誘導(dǎo)前的全菌蛋白樣品，Lane3_10:誘導(dǎo)后l_8h每 個(gè)小時(shí)的全菌蛋白樣品
[0036] 圖10 15%SDS-PAGE電泳檢測(cè)融合蛋白破碎后圖。
[0037] Lanel: Protein Marker，Lane2 :誘導(dǎo)前全菌蛋白，Lane3 :誘導(dǎo)后6h全菌蛋白， Lane4:超聲破碎后離心上清，Lane5:超聲破碎后沉淀 [0038]圖11 15%SDS_PAGE電泳檢測(cè)硫酸銨飽和濃度的選擇
[0039] 1^1161:?1'(^6；[11]\^^61'，1^1162:誘導(dǎo)前全菌蛋白，1^1163:0~5%硫酸銨飽和濃度 透，Lane4:5 %~10 %硫酸銨飽和濃度，Lane5:10 %~20 %硫酸銨飽和濃度，Lane6:20 %~ 30 %硫酸銨飽和濃度，Lane7:30 %~40 %硫酸銨飽和濃度，Lane8:40 %~50 %硫酸銨飽和 濃度，Lane9:50 %~60 %硫酸銨飽和濃度
【具體實(shí)施方式】
[0040] 材料
[0041 ] (1)菌株
[0042]載體PET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，Escherichia coli B L21 (DE3)，菌株pET28a-VEGFmI_M2均為本實(shí)驗(yàn)室保存。
[0043] (2)工具酶和試劑
[0044]分子克隆工具酶為Fermentas公司產(chǎn)品；質(zhì)粒抽提試劑盒為上海捷瑞生物科技有 限公司;產(chǎn)物純化試劑盒以及PCR膠回收試劑盒為上海生工生物科技有限公司的產(chǎn)品。 [0045] (3)培養(yǎng)基
[0046] LB培養(yǎng)基，配方見參考文獻(xiàn)Sambrook J，F(xiàn)ristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory Manual 2nd ed.NY：Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989〇
[0047] 本說明書所提及的方法中質(zhì)粒提取、PCR反應(yīng)、內(nèi)切酶酶切、PCR產(chǎn)物的回收、連接 酶連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌，這些都是基因工程研究領(lǐng)域的常規(guī)操作方法，具體參見Sambrook J，F(xiàn)ristshE F，Maniatis T.Molecular Cloning；A Laboratory M anual 2nd ed.NY：CoId Spring Harbor Laboratory Press，1989，pp·16_340〇
[0048] 實(shí)施例 1 pET28a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG 基因的克隆
[0049] 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的關(guān)于pET28a-VEGFmI_M2的序列信息，利用引物設(shè)計(jì)軟件 卩1'；[11161'、01180分別設(shè)計(jì)兩對(duì)引物￥1、￥2:
[0050] VI：57-CATGCCATGGACATCATCGACGACTTCACTA-37 [0051 ] V2：57-CGGGATCCACCGCTGCCGCTACCCTTGTTGT-37
[0052] 上游引物VI中引入酶切位點(diǎn)Nco I，下游V2中引入酶切位點(diǎn)BamH I以及柔性肽 GSGSG。用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pET28a-VEGFmI_M2和質(zhì)粒pET28a-(ansB-C)-GnRH 3-hinge-MVP-NRLLLTG。利用引物V1、V2克隆VEGFmI-M2-GSGSG基因，PCR反應(yīng)體系見表1，反應(yīng) 參數(shù)見表2。
[0053]表 1 VEGF I-M2-GSGSG PCR反應(yīng)體系
[0054]
[0055] 表2 VEGF I-M2-GSGSG PCR反應(yīng)參數(shù)
[0056]
[0057] 0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物(參見說明書附圖2)，條帶位置與預(yù)期的534bp 一致。
[0058] 通過切膠回收獲得目的片段VEGFmI-M2-GSGSG，將目的片段和pET28a-(ansB-C)- GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG載體質(zhì)粒分別經(jīng)Nco I、BamH I雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系見表3、 表4。
[0059] 表3 VEGF I-M2-GSGSG基因雙酶切反應(yīng)體系
[0060]
[0061]
[0062]表4 pET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG雙酶切反應(yīng)體系
[0063]
[0064] 酶切產(chǎn)物通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，瓊脂糖凝膠電泳分別回收目的基因片段 與載體基因片段后用E. co 1 i DNA連接酶4 °C連接，用冷CaCl2法制備大腸桿菌BL21的感受態(tài) 細(xì)胞，將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后涂布到含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 °C過夜培養(yǎng) 后挑取單菌落，將單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，分別通過PCR、單酶 切和雙酶切等方法初篩陽性克隆，并送至生工測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)軟件比對(duì)后 完全正確(參見說明書附圖4)。
[0065] 通過切膠回收獲得目的片段，將目的片段VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NR LLLTG和 pET32a載體質(zhì)粒分別經(jīng)Nco I、Hind III雙酶切，雙酶切反應(yīng)體系見表3、表4。
[0066] 表3 VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG基因雙酶切反應(yīng)體系
[0067]
[0068] 表4空載體pET32a雙酶切反應(yīng)體系
[0069]
[0070] 酶切產(chǎn)物通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，瓊脂糖凝膠電泳分別回收目的基因片段 與載體基因片段后用E. co 1 i DNA連接酶4 °C連接，用冷CaCl2法制備大腸桿菌BL21的感受態(tài) 細(xì)胞，將酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后涂布到含氨芐霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 °C過夜培養(yǎng) 后挑取單菌落，將單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，通過PCR、單酶切和 雙酶切等方法初篩陽性克隆，并送至生工測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)軟件比對(duì)后完全 正確(參見說明書附圖8)。
[0071] 實(shí)施例2 VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG基因在大腸桿菌中的表達(dá)及培養(yǎng)
[0072] 重組菌以1 %接種量在液體LB培養(yǎng)基試管中37°C振蕩培養(yǎng)過夜，再以1 %的接種量 轉(zhuǎn)接搖瓶大批培養(yǎng)，培養(yǎng)4h后加入終濃度為5mM乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)6h后收集菌體，留樣進(jìn) 行SDS-PAGE分析。融合蛋白在誘導(dǎo)后6h達(dá)到穩(wěn)定的最大表達(dá)量，通過Bandscan軟件分析融 合蛋白的表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白量的65% (參見說明書附圖9)。
[0073] 實(shí)施例3融合蛋白的初步分離純化
[0074] 挑選高表達(dá)量菌株，接種于LB培養(yǎng)基中，37 °C過夜培養(yǎng);過夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入LB培養(yǎng) 基，37 °C擴(kuò)大培養(yǎng)，選取最優(yōu)發(fā)酵條件獲得發(fā)酵菌體。5000r/min離心15min，上清及沉淀均 留樣。將沉淀用配制好的菌體裂解液（10mL/g菌體)溶解，超聲裂解菌體。12000r/min離心 20min，收集上清及沉淀均留樣標(biāo)記。SDS-PAG E電泳結(jié)果顯示目的蛋白主要存在于菌體上 清中，故可判斷融合蛋白為可溶性表達(dá)(參見說明書附圖10)。
[0075] 實(shí)施例4可溶性目的蛋白的硫酸銨分級(jí)沉淀
[0076] 取重組菌裂解液離心后上清于冰浴中邊攪拌邊加入研細(xì)的硫酸銨粉末至相應(yīng)飽 和度(飽和度分別為5 %，10 %，20 %，30 %，40 %，50 %，60% )，加入速度應(yīng)緩慢，以液體中不 出現(xiàn)硫酸銨固體為宜。達(dá)到相應(yīng)飽和度后4°C靜置lh，供蛋白質(zhì)充分沉淀，12000r/min離心 20min，每一級(jí)飽和度各取上清和沉淀制備樣品，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，根據(jù)蛋白條帶分析目 的蛋白集中沉淀的硫酸銨飽和度。選擇目的蛋白集中沉淀的硫酸銨飽和濃度時(shí)收集沉淀復(fù) 融于離子交換液中，（25mM Tris · HCl，pH8.0)中，復(fù)溶時(shí)須加入1%(v/v)β-巰基乙醇。將復(fù) 溶的蛋白溶液于4°C對(duì)離子交換緩沖液透析過夜，再于4°C，12000r/min離心20min，棄沉淀， 上清用DEAE-52陰離子交換樹脂進(jìn)行進(jìn)一步分離純化。
[0077]實(shí)施例5 DEAE-52陰離子交換層析
[0078] 本實(shí)驗(yàn)采用的DEAE52是弱酸型陰離子交換劑，將DEAE-52用NaOH、HCl和NaOH分別 處理后用蒸餾水將其洗至中性，再將DEAE-52裝入層析柱中，層析柱上端進(jìn)液口連接恒流 栗，下出口連接核酸蛋白檢測(cè)儀，利用離子交換緩沖液(pH8.0,20mM Tris · HC1)進(jìn)行層析 柱的平衡，平衡完畢后以lmL/min的速度進(jìn)行蛋白溶液的上樣操作，上樣后重復(fù)平衡操作， 再用NaCl(O-lM)進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰留樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
[0079]實(shí)施例6脫鹽凍干
[0080]收集蛋白純度較高的洗脫液，4 °C對(duì)R0水透析過夜，將透析后的洗脫液在凍干機(jī)中 凍干，刮取蛋白干粉冷凍保存。
[0081]除上述事實(shí)外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式，凡采用等同替換或等效變換性的 技術(shù)方案，均落于本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種生產(chǎn)重組蛋白VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG的大腸桿菌菌株，其特征在于 大腸桿菌菌株Escherichia coli.BL21(DE3)/VGD，保藏編號(hào)：CCTCC N0:M2016132。2. 根據(jù)權(quán)利要求書1所述的該大腸桿菌菌株BL21 (DE3)/VGD，其特征在于:大腸桿菌細(xì) 胞中含有重組質(zhì)粒 pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG。3. 根據(jù)權(quán)利要求書2所述的該大腸桿菌菌株BL21(DE3)/V⑶中重組質(zhì)粒pET32a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，其特征在于：含有重組的VEGF-M2-GnRH 3-hinge-MVP-NRLLLTG，可表達(dá)融合蛋白，其具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。4. 一種制備權(quán)利要求書1所述的該大腸桿菌菌株的方法，它包括以下步驟： (I)用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒 pET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG 和 pET28a-VEGF I-M2,通過PCR方法擴(kuò)增出目的片段VEGF I-M2-GSGSG。 (Π )用限制性內(nèi)切酶Nco I、BamH I切割VEGF I-M2-GSGSG和pET28a-(ansB-C)-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG質(zhì)粒，用E. coli DNA連接酶4°C連接過夜，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，獲得 含質(zhì)粒 pET28a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG 的菌株。 (ΠI)用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒pET28a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG和質(zhì)粒 pET32a，用限制性內(nèi)切酶Nco I、Hind III切割質(zhì)粒pET28a-VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG和質(zhì)粒pET32a，用E.coli DNA連接酶4°C連接過夜，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，獲得 BL21(DE3)/VGD 菌株。 (IV)鑒定重組質(zhì)粒:使用PCR法、和單酶切、雙酶切方法進(jìn)行驗(yàn)證，將重組菌株進(jìn)行測(cè)序 驗(yàn)證。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種新型融合蛋白VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，其特 征在于：該基因表達(dá)的融合蛋白實(shí)際分子量約為27kDa，其N端為VEGF I和M2(Hsp70(407-426)的兩段串聯(lián)重復(fù)序列），C端為三段串聯(lián)重復(fù)的GnRH序列及IgG的鉸鏈區(qū)及麻疹病毒融 合蛋白序列中的288-302氨基酸片段MVP，N端和C端之間利用GSGSG柔性肽連接。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG肽的重組方法，其特征在 于:包含抗腫瘤疫苗的抗原表位VEGF、GnRH，及分子內(nèi)佐劑M 2，具有更強(qiáng)的抗腫瘤功能。7. -種VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG肽的制備方法，其特征在于，該方法包含步 驟： (I) 根據(jù)權(quán)利要求4所述步驟構(gòu)建宿主菌 (II) 通過乳糖誘導(dǎo)，超聲破碎，硫酸銨分級(jí)沉淀來初步獲得重組蛋白 (III) 通過DEAE-52離子交換層析分離出VEGF-M2-GnRH3-hinge-MVP-NRLLLTG，該融合蛋 白純度可達(dá)SDS-PAGE電泳純。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK106085932SQ201610343170
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年5月19日
【發(fā)明人】曹榮月, 葉佳, 井亮亮, 李巖, 李曼曼, 苗梓韜, 劉淑君
【申請(qǐng)人】中國(guó)藥科大學(xué)