一種豬鏈球菌2型10基因缺失株及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬鏈球菌2型10基因缺失株及應(yīng)用，該菌株是在豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株SC的基礎(chǔ)上敲除10個基因得到的，保藏編號為：CCTCC NO:M 2015800。該菌株毒力較親本菌株顯著降低，安全性高，且免疫原性高，注射、滴鼻和口服途徑免疫均能夠保護(hù)免疫小鼠抵抗豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株的攻擊，說明本疫苗可有效激活宿主的粘膜免疫系統(tǒng)和系統(tǒng)性免疫；同時，對不同ST型的豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株也具有交叉保護(hù)力。該疫苗制備方式簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)。同時，由于該突變株的免疫原性與野生強(qiáng)毒株相似，因此可以作為標(biāo)準(zhǔn)品或全菌抗原應(yīng)用到快速試劑盒的研制中。CCTCC NO：M201580020151229
【專利說明】
一種豬鏈球菌2型10基因缺失株及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于家畜傳染病基因工程疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬鏈球菌2型10基 因缺失株及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病原菌，鏈球菌屬，革蘭氏陽性，兼性厭氧，在血 平板上可以產(chǎn)生α或β溶血，該菌能夠生成莢膜，根據(jù)其莢膜抗原的不同，可以分為33個血清 型（1-31,33，1/2型）。而根據(jù)7個管家基因（aroA，cpn60，dpr，gki，mutS，recA, thrA)序列的 差異，可以將其分為不同的基因型（ST型），目前，全世界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了至少704種不同ST型的 豬鏈球菌，眾多的ST型要求豬鏈球菌疫苗具有交叉保護(hù)力。
[0003] 1954年，豬鏈球菌首次作為一種病原菌被報道，其天然宿主是豬，豬鏈球菌在豬群 中的感染以血清2型為主，其次是血清9型和3型。豬感染豬鏈球菌會導(dǎo)致豬鏈球菌病，其癥 狀有腦膜炎，敗血癥，關(guān)節(jié)炎，心內(nèi)膜炎等，豬鏈球菌病給畜牧業(yè)的發(fā)展造成了嚴(yán)重的損失。
[0004] 與此同時，豬鏈球菌作為一種重要的人畜共患病原菌，不僅會造成豬的感染，也會 導(dǎo)致人的發(fā)病，目前全世界報道的人感染豬鏈球菌的案例已經(jīng)到達(dá)1600多例。在人的感染 中，仍然以血清2型為主，其次是血清14型，而基因型則以ST1為主（圖1)。豬鏈球菌感染人的 案例已經(jīng)覆蓋加拿大、美國、阿根廷、法屬圭亞那、法國、德國、意大利、荷蘭、西班牙、英國、 中國、柬埔寨、日本、泰國、越南等15個國家和地區(qū)，其中以亞洲最為嚴(yán)重。
[0005] 中國作為畜牧業(yè)大國，養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá)，從事與豬養(yǎng)殖及相關(guān)產(chǎn)品加工的工作人員 眾多，因此，豬鏈球菌感染的后果也就更加嚴(yán)重。在1998年和2005年，我國的江蘇省和四川 省爆發(fā)了兩次大規(guī)模的豬鏈球菌感染人的疫情，在這兩次大爆發(fā)中，共有229人發(fā)病，52人 死亡。同時，在這兩次疫情中，感染者出現(xiàn)了罕見的中毒樣休克綜合征。除此之外，豬鏈球菌 感染人的病例報道已經(jīng)覆蓋河南，湖北，江西，安徽，廣東，廣西，云南，香港，臺灣等大部分 中南部省份，形勢十分嚴(yán)峻。與其他國家和地區(qū)不同的是，在中國，盡管豬鏈球菌的感染也 是以血清2型為主，但是基因型卻以ST7為主（圖2)。
[0006] 豬鏈球菌感染范圍之所以如此廣泛，與它的感染方式不無關(guān)系。長久以來，豬鏈球 菌作為一種能導(dǎo)致系統(tǒng)性感染病原菌，人們普遍認(rèn)為其感染模式如下:環(huán)境中的豬鏈球菌 會在一定條件下寄居在豬的扁桃體，這個過程并不一定導(dǎo)致發(fā)病，但是在一定條件下，扁桃 體內(nèi)的豬鏈球菌會進(jìn)入血液，進(jìn)而導(dǎo)致豬發(fā)??；而感染人則主要通過傷口直接進(jìn)入血液 (Gottsch alk and Segura,2000)。而近幾年來，隨著研究的深入，人們對于豬鏈球菌的感 染途徑提出了新的見解，認(rèn)為豬鏈球菌不僅有圖所示的經(jīng)扁桃體進(jìn)入血液，還可以通過粘 膜尤其是胃腸道粘膜進(jìn)入血液。其實早在2001年，有研究發(fā)現(xiàn)6份病人的直腸拭子為豬鏈球 菌陽性，調(diào)查發(fā)現(xiàn)患者均曾攝取生豬肉，暗示了豬鏈球菌從胃腸道感染途徑的存在 (Goyette-Desjardins G，2014) ;2004年荷蘭科學(xué)家則發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌可以在豬受到一定壓 力的條件下通過腸道進(jìn)行感染(Bas SwildenS，2004)，但此后關(guān)于豬鏈球菌通過腸道致病 的研究進(jìn)展緩慢，導(dǎo)致人們一定程度上忽略了豬鏈球菌的粘膜感染途徑。近幾年，日本一項 研究表明，酒精可以促進(jìn)豬鏈球菌通過腸道進(jìn)行感染(τ. Nakayama，2013);荷蘭的研究團(tuán)隊 發(fā)現(xiàn)通過口服豬鏈球菌之后，豬出現(xiàn)臨床癥狀，隨后，該團(tuán)隊?wèi)?yīng)用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2和 豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2,系統(tǒng)驗證了不同血清型和基因型的豬鏈球菌對這兩種細(xì)胞的粘 附入侵和穿透能力，同時發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌可以破壞這兩種細(xì)胞的緊密連接，首次從細(xì)胞和分 子水平揭示了豬鏈球菌對于人的腸道致病機(jī)制(Maria Laura Ferrando，2014)。2014年，牛 津大學(xué)臨床研究中心的一項評估報告指出，最易感染豬鏈球菌的人有兩類，第一類是從事 與生豬養(yǎng)殖，豬肉產(chǎn)品加工生產(chǎn)有關(guān)的職業(yè)人群，第二類是吃過被豬鏈球菌污染的食物的 人群，兩類人群的感染風(fēng)險分別是38.1%和37.3%，（Vu Thi Lan Huong，2014)。同年，該研 究中心發(fā)現(xiàn)，越南人喝豬血的習(xí)慣與豬鏈球菌感染存在很大相關(guān)性(Vu Thi Lan Huong， 2014)。同時，也有研究在夏威夷和西班牙分別發(fā)現(xiàn)了由于食用了豬鏈球菌污染的食物而導(dǎo) 致人感染的案例（Suwarat Wongjittraporn MD，2014;L0pez_Mestanza 0,2016)。2016年3 月，Maria Laura Ferrando和Constance Schultsz提出了豬鏈球菌與宿主胃腸道互作的分 子模型，并且正式提出豬鏈球菌應(yīng)該被評估為一種食源性疾病(Maria Laura Ferrando， 2016)。此外，目前多份臨床數(shù)據(jù)顯示豬群的扁桃體中豬鏈球菌陽性率達(dá)到100%，從病豬的 肺部和扁桃體分離到豬鏈球菌。綜上所述，豬鏈球菌可通過粘膜系統(tǒng)感染宿主或者通過某 些機(jī)制暫時寄存于粘膜免疫組織(扁桃體），因此有效激活粘膜免疫系統(tǒng)在預(yù)防豬鏈球菌感 染和降低宿主的陽性攜帶率等方面發(fā)揮重要作用。目前已有的多份疫苗研究和專利成果均 通過注射實現(xiàn)免疫，而通過注射途徑進(jìn)行免疫的方式在激活粘膜免疫系統(tǒng)具有一定的局限 性，甚至不能有效激活粘膜免疫系統(tǒng)，因此亟需開發(fā)一種能有效激活粘膜免疫系統(tǒng)和系統(tǒng) 免疫的疫苗。
[0007] 鑒于豬鏈球菌基因型的多樣性和致病途徑的復(fù)雜性，對于豬鏈球菌疫苗的研制就 不能僅限于以往的注射疫苗，也需要同時開發(fā)能夠激發(fā)多個部位免疫反應(yīng)的口服疫苗，這 種新型的豬鏈球菌口服疫苗應(yīng)該不僅能夠通過注射起作用，更能夠通過口服起作用，并且 具有一定的交叉保護(hù)力，能抵御不同ST型強(qiáng)毒力菌株的攻擊。唯有如此，才能抵御豬鏈球菌 通過血液和粘膜系統(tǒng)等途徑的感染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決豬鏈球菌疫苗的需求，本發(fā)明構(gòu)建了 一株豬鏈球菌2型10基因缺失株，命 名為LSM110D10,是在豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力分離株SC的基礎(chǔ)上，利用同源重組技術(shù)，依次敲除 Sly、ScpA、SsnA、Fhb、SsadS、IgAl、Nudp、Ide Ssuis、endA、Mrp等 10個基因而獲得低毒力，高 安全性、免疫原性好，高保護(hù)力，可以通過口服等多種途徑免疫，且具備交叉保護(hù)力的菌株。 該菌株已于2015年12月29日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：豬鏈球菌 (Streptococcus suis)LSM110D10,保藏編號：CCTCC N0:M2015800,地址：中國武漢武漢大 學(xué)。
[0009] 本發(fā)明第二個目的是在于提供了一種豬鏈球菌2型10基因缺失株在制備治療或預(yù) 防豬鏈球菌2型感染藥物中的應(yīng)用，用該菌株制備的疫苗免疫小鼠后，注射、滴鼻和口服均 具備顯著的保護(hù)力，用以抵御同基因型的強(qiáng)毒力菌株SC19及異基因型的強(qiáng)毒力菌株LSM102 (本發(fā)明或稱ST658)的感染。
[0010]本發(fā)明第三個目的在于為快速檢測豬鏈球菌的提供標(biāo)準(zhǔn)品。目前已有的豬鏈球菌 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒主要以滅活菌體或者莢膜多糖作為包被抗原，通過檢測疑似感染動物 的血清中豬鏈球菌抗體含量，來判斷動物是否曾經(jīng)感染豬鏈球菌。本發(fā)明的10基因缺失突 變株不影響豬鏈球菌莢膜多糖的合成，保持了很高的免疫原性，可以作為標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用到快 速檢測試劑盒的生產(chǎn)中。
[0011] 為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：
[0012] -種豬鏈球菌2型10基因缺失株通過下述方法制備得到：
[0013] 1)設(shè)計引物分別擴(kuò)增豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力分離株SC(發(fā)明人自行分離）的Sly、 3〇卩厶、581^、？1113、383(13、]^六1、仙(^、1(16 3811丨8、611(^、]\1印10個基因的上下同源臂，分別將其 連接到自殺性質(zhì)粒pSET4s上構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒。
[0014] 2)將連接有目的基因上下同源臂的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力分離株 SC中，利用溫度與反向篩選標(biāo)記進(jìn)行篩選，獲得豬鏈球菌2型單基因缺失株。
[0015] 3)再通過電轉(zhuǎn)的方法，向已獲得的豬鏈球菌2型單基因缺失株中轉(zhuǎn)入連接有第二 個基因上下同源臂的重組質(zhì)粒。同樣利用溫度與反向篩選標(biāo)記篩選，獲得豬鏈球菌2型雙基 因缺失株。
[0016] 4)如步驟(2)、（3)所述，再依次缺失剩余基因，直到獲得豬鏈球菌2型Δ Sly Δ ScpA Δ SsnA Δ Fhb Δ SsadS Δ IgAl Δ Nudp Δ Ide Ssuis Δ endA Δ MrplO基因缺失株LSM110D10。該 菌株已于2015年12月29日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：豬鏈球菌 (Streptoco ecus suis)LSM110D10,保藏編號：CCTCC N0:M2015800,地址：中國武漢武漢大 學(xué)。
[0017] LSM110D10在基本生物學(xué)特性上與豬鏈球菌2型一致。
[0018] LSM110D10在制備治療或預(yù)防豬鏈球菌2型感染藥物中的應(yīng)用，包括利用 LSM110D10制備成活疫苗或滅活疫苗，用于口服、滴鼻或是注射，均可達(dá)到治療或預(yù)防豬鏈 球菌2型感染的作用。
[0019] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的效果和優(yōu)點(diǎn)如下：
[0020] 由于LSM110D10毒力顯著下降，可以作為減毒活疫苗使用，不需要滅活，避免了滅 活過程中帶來的免疫原性損傷;作為減毒活疫苗，不需要依賴佐劑便可以起到很好的免疫 效果，節(jié)約了成本，也避免了佐劑使用帶來一定的副作用。同時，用LSM110D10制備的減毒活 疫苗，既可以通過注射途徑也可以通過口服途徑進(jìn)行免疫，且均具有交叉保護(hù)力。由于 LSM110D10的莢膜多糖抗原得以完整保存的優(yōu)點(diǎn)，使其依然可以作為傳統(tǒng)滅活疫苗使用，避 免由于滅活不徹底而導(dǎo)致的疫苗風(fēng)險。
[0021 ]本發(fā)明中的LSM110D10是在豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力株SC的基礎(chǔ)上構(gòu)建的豬鏈球菌2型 10基因缺失菌株，毒力大幅度下降，安全性高，不含有抗性篩選標(biāo)記且遺傳穩(wěn)定，不存在毒 力返強(qiáng)的風(fēng)險。LSM110D10形成莢膜多糖的能力正常，將該菌株制成減毒活疫苗后，免疫原 性高，能夠保護(hù)免疫小鼠抵抗豬鏈球菌2型強(qiáng)毒菌株的攻擊，同時，LSM110D10制備的減毒活 疫苗，可以通過口服途徑免疫激活粘膜免疫系統(tǒng)，并且依然保持了較高的免疫原性。此外， 由于豬鏈球菌有眾多ST型，LSM110D10制備的減毒活疫苗可以保護(hù)小鼠抵御不同ST型強(qiáng)毒 力菌株的攻擊，具有交叉保護(hù)力，為有效控制我國豬鏈球菌病的發(fā)生與流行提供了有效的 防治工具。
【附圖說明】
[0022] 圖1為世界范圍內(nèi)感染人的豬鏈球菌ST型的關(guān)系圖。
[0023] 圓點(diǎn)大小表示案例的多少，由圖可知，世界范圍內(nèi)感染人仍以ST1為核心，ST7數(shù)量 最多，且與ST1親緣關(guān)系很近，都屬于CC1克隆群，此外，ST658也屬于CC1克隆群，以上ST型均 是世界感染人的主流ST型。
[0024]圖2是中國境內(nèi)所有已報道的及豬源豬鏈球菌ST型分布示意圖。
[0025] 由圖可知，在中國，ST7屬于核心位置，且數(shù)量最多，而本實驗所用的親本菌株SC便 是ST7菌株，同時，ST658與其親緣關(guān)系較近，屬于感染的核心菌株，本發(fā)明所構(gòu)建的疫苗對 ST658具有交叉保護(hù)力，具有較大的現(xiàn)實意義。
[0026] 圖3是豬鏈球菌由環(huán)境進(jìn)入機(jī)體致病的示意圖。
[0027] 長久以來，人們傾向于認(rèn)為環(huán)境中的豬鏈球菌進(jìn)入豬體內(nèi)寄居在扁桃體，在一定 條件下通過扁桃體進(jìn)入血液致病，也可以通過傷口感染直接致病，感染人主要是通過后一 種方式。隨著研究的深入，現(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)了豬鏈球菌進(jìn)入機(jī)體的另外一條途徑，便是通過 胃腸道粘膜致病，這兩條途徑的發(fā)現(xiàn)預(yù)示著豬鏈球菌疫苗應(yīng)該具備口服免疫的功效以抵御 食源性感染。
[0028] 圖4為pSET4s載體圖譜。
[0029]該質(zhì)粒具有在革蘭氏陰性菌中起作用的復(fù)制起點(diǎn)ColElori和在革蘭氏陽性菌中 起作用的復(fù)制起點(diǎn)orfC，前者用于質(zhì)粒的構(gòu)建和克隆，后者用于篩選缺失株。同時載體具有 壯觀霉素抗性，可作為篩選標(biāo)記。
[0030] 圖5為本發(fā)明的豬鏈球菌2型10基因缺失株LSM110D10的PCR鑒定結(jié)果示意圖。
[0031] 圖5A中，M1:DNA 11^11?^(01^15000);]\12:0祖1^11?^(01^2000);泳道1、3，用517基因 的外部引物對進(jìn)行擴(kuò)增;泳道2、4,用Sly基因的內(nèi)部引物對進(jìn)行擴(kuò)增;泳道5、7,用ScpA基因 的外部引物對進(jìn)行擴(kuò)增;泳道6、8,用ScpA基因的內(nèi)部引物對進(jìn)行擴(kuò)增;泳道9、11，用SsnA基 因的外部引物對進(jìn)行擴(kuò)增;泳道1〇、12,用SsnA基因的內(nèi)部引物對進(jìn)行擴(kuò)增;泳道13、15,用 Fhb基因的外部引物對進(jìn)行擴(kuò)增；泳道14、16,用Fhb基因的內(nèi)部引物對進(jìn)行擴(kuò)增；泳道17、 19,用SsadS基因的外部引物對進(jìn)行擴(kuò)增;泳道18、20,用SsadS基因的內(nèi)部引物對進(jìn)行擴(kuò)增； 泳道1、2、5、6、9、10、13、14、17、18模板為豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力分離株3(： ;泳道3、4、7、8、11、 12、15、16、19、20模板為10基因缺失株1^]\1110010。圖58中，]\11 :0財11^11?^(01^15000);]\12: DNAmarker (DL2000);泳道1、3，用IgAl基因的外部引物對進(jìn)行擴(kuò)增;泳道2、4，用IgA 1基因的 內(nèi)部引物對進(jìn)行擴(kuò)增；泳道5、7,用Nudp基因的外部引物對進(jìn)行擴(kuò)增；泳道6、8,用Nudp基因 的內(nèi)部引物對進(jìn)行擴(kuò)增;泳道9、11，用Ide Ssuis基因的外部引物對進(jìn)行擴(kuò)增;泳道10、12， 用Ide Ssuis基因的內(nèi)部引物對進(jìn)行擴(kuò)增;泳道13、15,用endA基因的外部引物對進(jìn)行擴(kuò)增； 泳道14、16,用endA基因的內(nèi)部引物對進(jìn)行擴(kuò)增;泳道17、19,用Mrp基因的外部引物對進(jìn)行 擴(kuò)增;泳道18、20，用Mrp基因的內(nèi)部引物對進(jìn)行擴(kuò)增;泳道1、2、5、6、9、10、13、14、17、18模板 為豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力分離株SC;泳道3、4、7、8、11、12、15、16、19、20模板為10基因缺失株 LSM110D10。圖5A和圖5B表明10基因缺失株LSM110D10構(gòu)建成功。
[0032] 圖6A為透射電鏡下豬鏈球菌2型SC菌株示意圖。
[0033]圖6B為本發(fā)明的10基因缺失株LSM110D10的形態(tài)結(jié)構(gòu)圖。
[0034]由圖可知LSM110D10的產(chǎn)生莢膜能力并沒有發(fā)生變化，這是其具有較高的免疫原 性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
[0035]圖7是豬鏈球菌2型SC菌株和本發(fā)明的10基因缺失株LSM110D10的耐藥性測定結(jié)果 示意圖。
[0036]由圖可知兩個菌株最小抑菌濃度均為0.16,表明LSM110D10的耐藥性沒有發(fā)生變 化，可以作為其細(xì)胞壁沒有發(fā)生變化的一個證據(jù)，也是LSM110D10具有較高免疫原性的結(jié)構(gòu) 基礎(chǔ)。
[0037]圖8為本發(fā)明的豬鏈球菌2型10基因缺失株LSM110D10與豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株 SC的生長曲線示意圖。
[0038]以實驗室構(gòu)建的一個8基因缺失株作為對照，由圖可知，經(jīng)過14個小時的測定，三 株菌的生長0D值均可以達(dá)到1.0左右，并且基本穩(wěn)定，且曲線基本一致，LSM110D10生長與親 本菌株SC相比無明顯差異。表3為圖8的數(shù)據(jù)統(tǒng)計。
[0039]圖9是本發(fā)明的LSM110D10與豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株SC的溶血活性測定結(jié)果示意 圖。
[0040] 以未敲除溶血素基因 Sly的一個3缺失突變株作為對照，由圖可知，SC與3缺失0D值 可以達(dá)到0.9左右，而LSM110D10與空白對照組的0D值均在0.1左右，表明LSM110D10的溶血 活性與SC相比顯著下降。
[0041] 圖10是本發(fā)明的LSM110D10與豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株SC的小鼠攻毒實驗結(jié)果示 意圖。
[0042] SC攻毒后小鼠第一天便全部死亡，致死率100%，而LSM110D10攻毒后小鼠兩周后 仍全部存活，致死率為0,表明LSM110D10毒力與SC相比顯著下降。表4為圖10的數(shù)據(jù)統(tǒng)計。 [0043]圖11是本發(fā)明的LSM110D10與豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株SC的豬全血?dú)⒕鷮嶒灲Y(jié)果 示意圖。
[0044]由圖可知在2個小時之內(nèi)，SC呈指數(shù)增長，而LSM110D10呈負(fù)增長，到3個小時增長 也受到明顯抑制，3小時，SC增長了約30倍，而LSM110D10基本沒有增長，表明LSM110D10與SC 相比，在血液中的存活能力顯著下降，這也說明在豬模型中，LSM110D10的毒力與SC相比顯 著下降。
[0045]圖12為本發(fā)明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三種方式免疫小鼠之后，再以SC19 強(qiáng)毒力菌株腹腔攻毒時實驗結(jié)果示意圖。
[0046] 未免疫組小鼠死亡率達(dá)到90 %，而皮下、滴鼻或灌胃三個免疫組小鼠存活率分別 為80%，60%，70%顯著高于未免疫組，表明經(jīng)過三種方式免疫后，LSM110D10均可提供較高 的保護(hù)力以抵御SC19強(qiáng)毒力菌株攻擊。表5為圖12的數(shù)據(jù)統(tǒng)計。
[0047]圖13為本發(fā)明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三種方式免疫小鼠之后，采集小鼠 全血，做SC19強(qiáng)毒力菌株全血?dú)⒕Y(jié)果示意圖。
[0048] 未免疫組增長率約為100%，與未免疫組小鼠相比，經(jīng)三種方式免疫后的小鼠全血 中，SC19增長率分別約為5%，30%，10%，表明免疫后的全血均具有顯著的殺菌能力。
[0049]圖14為本發(fā)明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三種方式免疫小鼠之后，再以 LSM102(ST658)強(qiáng)毒力菌株腹腔攻毒時實驗結(jié)果示意圖。
[0050] 未免疫組小鼠死亡率達(dá)到90%，而免疫組小鼠存活率分別為70%，50%，60%，顯 著高于未免疫組，表明經(jīng)過三種方式免疫后，LSM110D10均可提供較高的交叉保護(hù)力以抵御 ST658型強(qiáng)毒力菌株LSM102的攻擊。表6為圖14的數(shù)據(jù)統(tǒng)計。
[0051]圖15為本發(fā)明的LSM110D10以皮下、滴鼻或灌胃三種方式分別免疫小鼠之后，采集 小鼠全血，做ST658型強(qiáng)毒力菌株LSM102的全血?dú)⒕Y(jié)果示意圖。
[0052] 未免疫組增長率約為100%，與未免疫組小鼠相比，經(jīng)三種方式免疫后的小鼠全血 中，LSM102增長率約為10%，20%，12%，表明免疫后小鼠全血均具有顯著的殺菌能力，顯示 出疫苗具備交叉保護(hù)力。
[0053]圖16為本發(fā)明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三種方式免疫小鼠之后，以滴鼻的 方式攻毒SC19強(qiáng)毒力菌株后，小鼠組織載菌量實驗結(jié)果示意圖。
[0054]圖16六，168，16(：，160分別是取小鼠血、肺、腦、肝所做組織載菌量，由圖可知，經(jīng)三 種方式免疫本發(fā)明的LSM110D10后，相對于未免疫組，皮下、滴鼻或灌胃三種免疫方式免疫 后，小鼠血、肺、腦、肝四個組織中的菌量分別下降了約10倍，10倍，1000倍，10倍。表明小鼠 對于通過鼻腔及呼吸道粘膜入侵的SC19強(qiáng)毒力菌株具有顯著的清除能力。
[0055]圖17為本發(fā)明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三種方式免疫小鼠之后，以灌胃的 方式攻毒SC19強(qiáng)毒力菌株后，小鼠組織載菌量的實驗結(jié)果示意圖。
[0056]圖17A，17B，17C，17D分別是取小鼠血、肺、腦、肝所做組織載菌量，由圖可知，經(jīng)三 種方式免疫本發(fā)明的LSM110D10后，相對于未免疫組，皮下、滴鼻或灌胃三種免疫方式分別 免疫后，小鼠血、肺、腦、肝四個組織中的菌量分別下降了約100倍，10倍，100倍，10倍。表明 小鼠對于通過胃腸道粘膜入侵的SC19強(qiáng)毒力菌株具有顯著的清除能力。
【具體實施方式】
[0057]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，本發(fā)明實施例所述技術(shù)方案，如未 特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù);所述試劑或材料，如未特別說明，均來源于商業(yè)渠道。 [0058] 實施例1:
[0059] 豬鏈球菌10基因缺失株LSM110D10的獲得：
[0060] 根據(jù)GenBank上公布的豬鏈球菌2型05ZYH33株全基因組GB|CP000407.1 |設(shè)計引 物，從豬鏈球菌2型野生菌SC基因組中擴(kuò)增待缺失基因的上游同源臂和下游同源臂，構(gòu)建敲 除載體，用于目的基因的敲除。
【申請人】構(gòu)建和篩選缺失株是利用反向篩選標(biāo)記通過重組質(zhì) 粒與菌株基因組間的兩步單交換同源重組的方法實現(xiàn)的。這種方法可以重復(fù)使用來構(gòu)建多 基因突變株，且不會留下任何篩選標(biāo)記，具體參見DaisukeTakamatsu博士的相關(guān)報道 (DaisukeTetal,2001，45:101-113)〇
[0061] 目的基因敲除后，設(shè)計位于基因兩側(cè)的引物對和位于基因內(nèi)部的引物對，用于篩 選鑒定基因缺失突變株，鑒定結(jié)果見圖5,相關(guān)的鑒定引物如下表所不：
[0062] 表1.各基因內(nèi)部引物及目的片段長度
[0063]
[0065]表2.各基因外部引物及目的片段長度
[0066]
[0067] 該菌株已于2015年12月29日送至中
國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：豬鏈 球菌（Streptococcus suis)LSM110D10，保藏編號：CCTCC NO:M2015800，地址：中國武漢武 漢大學(xué)。
[0068] 實施例2:
[0069] 豬鏈球菌10基因缺失株LSM110D10的特性：
[0070] 1)在電鏡下觀察豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株SC和豬鏈球菌10基因缺失株LSM110D10， 兩者均形成了正常的細(xì)菌形態(tài)，細(xì)胞壁和莢膜，且兩者形態(tài)并無顯著差異，如圖6。
[0071] 2)耐藥性測定。將豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株SC和豬鏈球菌10基因缺失株LSM110D10 分別接種于5mL含有10 %新生牛血清的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 °C培養(yǎng)至對數(shù)期，調(diào)整濃度為 1.2 X 109 CFU/mL，取100yL均勻涂布于MH+10%羊血平板，貼上青霉素 E-test試紙條，小心 趕出氣泡，37°C培養(yǎng)24h后讀數(shù)，結(jié)果如圖7,圖7是豬鏈球菌2型SC菌株和本發(fā)明的10基因缺 失株LSM110D10的耐藥性測定結(jié)果，由圖可知兩個菌株最小抑菌濃度均為0.16,表明 LSM110D10的耐藥性沒有發(fā)生變化，可以作為其細(xì)胞壁沒有發(fā)生變化的一個證據(jù)，也是 LSM110D10具有較高免疫原性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
[0072] 3)生長曲線測定。將豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株SC和豬鏈球菌10基因缺失株 LSM110D10分別接種于5mL含有10%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)，并于培養(yǎng)后 每間隔一小時分別取l〇〇yL菌液測定OD600值，繪制生長曲線，結(jié)果如圖8,圖8為本發(fā)明的豬 鏈球菌2型10基因缺失株LSMIIODIO(IOA)與豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株SC的生長曲線示意 圖，且以實驗室構(gòu)建的一個8基因缺失株8Λ作為對照，由圖可知，經(jīng)過14個小時的測定，三 株菌的生長0D值均可以達(dá)到1.0左右，并且基本穩(wěn)定，且曲線基本一致，LSM110D10生長與親 本菌株相比無明顯差異。表3為圖8的數(shù)據(jù)統(tǒng)計。
[0073] 表 3
[0074]
[0075] 實施例3:
[0076] 豬鏈球菌10基因缺失株LSM110D10的安全性：
[0077] 1)溶血活性測定。將菌株接種于5mL含有10%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對 數(shù)期，調(diào)整濃度至5 X 107CFU/mL，取100yL加入到900yL 5%的新鮮綿羊紅細(xì)胞中，陰性對照 組加100yL PBS緩沖液，37°C培養(yǎng)2h，離心取上清，570nm下測定吸光值，結(jié)果如圖9，圖9是本 發(fā)明的LSM110D10與豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株SC的溶血活性測定結(jié)果，以未敲除溶血素基因 Sly的一個3缺失突變株作為對照，由圖9可知，SC與3缺失0D值可以達(dá)到0.9左右，而 LSM110D10與空白對照組的0D值均在0.1左右，表明LSM110D10的溶血活性與SC相比顯著下 降。
[0078] 2)小鼠攻毒實驗。豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株SC和豬鏈球菌10基因缺失株LSM110D10 培養(yǎng)至對數(shù)期，調(diào)整濃度至2 X 109CFU/mL，取200yL腹腔注射Balb/c雌性6周齡小鼠，每組10 只小鼠，觀察小鼠癥狀，統(tǒng)計死亡數(shù)，結(jié)果如圖10,圖10是本發(fā)明的LSM110D10與豬鏈球菌2 型強(qiáng)毒力菌株SC的小鼠攻毒實驗，SC攻毒后小鼠第一天便全部死亡，致死率100 %，而 LSM110D10攻毒后小鼠兩周后仍全部存活，致死率為0,表明LSM110D10毒力與SC相比顯著下 降。表4為圖10的數(shù)據(jù)統(tǒng)計。
[0079] 表 4
[0080]

[0081 ] 3)豬血全血?dú)⒕?。豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株SC和豬鏈球菌10基因缺失株LSM110D10 培養(yǎng)至對數(shù)期，調(diào)整濃度至5 X 104CFU/mL，取50yL菌液與450yL豬新鮮血液混合，緩慢轉(zhuǎn)動， 置于37°C條件下培養(yǎng)。分別于〇11^11、6〇1^11、12〇1^11、18〇1^11取10(^1^適當(dāng)稀釋后涂平板計數(shù)。 結(jié)果如圖11。圖11是本發(fā)明的LSM110D10與豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株SC的豬全血?dú)⒕鷮嶒灒?由圖可知在2個小時之內(nèi)，SC呈指數(shù)增長，而LSM110D10呈負(fù)增長，到3個小時增長也受到明 顯抑制，3小時，SC增長了約30倍，而LSM110D10基本沒有增長，表明LSM110D10與SC相比，在 血液中的存活能力顯著下降，這也說明在豬模型中，LSM110D10的毒力與SC相比顯著下降。 [0082] 實施例4:
[0083] 豬鏈球菌10基因缺失株LSM110D10的保護(hù)性：
[0084] 1)免疫。豬鏈球菌10基因缺失株LSM110D10培養(yǎng)至對數(shù)期，PBS調(diào)整濃度，小鼠分為 3組，分別采用皮下多點(diǎn)注射，滴鼻，灌胃3種方式進(jìn)行免疫，每組30只小鼠 Balb/c雌性4周齡 小鼠。皮下免疫200yL，濃度為1 X 107CFU/mL;滴鼻免疫20yL，濃度為1 X 108CFU/mL;灌胃免疫 l〇〇yL，濃度為1Χ1080Ρυ/πιΙ^14天后加強(qiáng)免疫，方法同一免，對照組不做處理。
[0085] 2)對SC19的保護(hù)力檢驗。二免14天后，將各免疫組及對照組小鼠再分別分為3組， 分別以豬鏈球菌2型強(qiáng)毒力菌株SC19(Li W，Liu L，Qiu D，Chen H and Zhou R.Identification of Streptococcus suis serotype 2 genes preferential expressed in the natural host. Int JM ed Microb，2010,300:482-488)進(jìn)行腹腔，滴 鼻，灌胃攻毒。各個免疫組包括對照組均取10只小鼠，腹腔攻毒200yL，濃度為2.5 X 109CFU/ mL。各個免疫組包括對照組均取5只小鼠，滴鼻攻毒20yL，濃度為5 X 109CFU/mL。各個免疫組 包括對照組均取5只小鼠，灌胃攻毒100yL，濃度為1 X 109CFU/mL。觀察腹腔攻毒的小鼠臨床 癥狀，并統(tǒng)計死亡數(shù)，滴鼻和灌胃攻毒小鼠，于24h取血，肺，腦，肝，做組織載菌量。相關(guān)結(jié)果 見圖12,圖16和圖17。圖12為本發(fā)明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三種方式免疫小鼠之 后，再以SC19強(qiáng)毒力菌株腹腔攻毒時實驗結(jié)果，未免疫組小鼠死亡率達(dá)到90%，而皮下、滴 鼻、灌胃三個免疫組小鼠存活率分別為80%，60%，70%顯著高于未免疫組，表明經(jīng)過三種 方式免疫后，LSM110D10均可提供較高的保護(hù)力以抵御SC19強(qiáng)毒力菌株攻擊。表5為圖12的 數(shù)據(jù)統(tǒng)計。
[0086] 表 5
[0087]
[0088]圖16為本發(fā)明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三種方式免疫小鼠之后，以滴鼻的 方式攻毒SC19強(qiáng)毒力菌株，然后做組織載菌量實驗結(jié)果。
[0089]圖16A，16B，16C，16D分別是取小鼠血肺腦肝所做組織載菌量，由圖可知，經(jīng)三種方 式免疫本發(fā)明的LSM110D10后，相對于未免疫組，皮下滴鼻灌胃三種免疫方式免疫后，小鼠 血肺腦肝四個組織中的菌量分別下降了約10倍，10倍，1000倍，10倍。表明小鼠對于通過鼻 腔及呼吸道粘膜入侵的SC19強(qiáng)毒力菌株具有顯著的清除能力。
[0090] 圖17為本發(fā)明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三種方式免疫小鼠之后，以灌胃的 方式攻毒SC19強(qiáng)毒力菌株，然后做組織載菌量實驗結(jié)果。
[0091] 圖17A，17B，17C，17D分別是取小鼠血、肺、腦、肝所做組織載菌量，由圖可知，經(jīng)三 種方式免疫本發(fā)明的LSM110D10后，相對于未免疫組，皮下滴鼻灌胃三種免疫方式免疫后， 小鼠血肺腦肝四個組織中的菌量分別下降了約100倍，10倍，100倍，10倍。表明小鼠對于通 過胃腸道粘膜入侵的SC19強(qiáng)毒力菌株具有顯著的清除能力。
[0092] 3)對 ST658 型強(qiáng)毒力菌株 LSM102(MLST 數(shù)據(jù)庫，http: //ssuis .mist · net)的交叉保 護(hù)力檢驗。二免14天后，對各免疫組及對照組小鼠各組10只，用ST658型強(qiáng)毒力菌株LSM102 進(jìn)行腹腔攻毒。腹腔攻毒200yL，濃度為2.5 X 109CFU/mL，觀察小鼠臨床癥狀，并統(tǒng)計死亡 數(shù)。相關(guān)結(jié)果見圖14。圖14為本發(fā)明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三種方式免疫小鼠之 后，再以LSM102(ST658)強(qiáng)毒力菌株腹腔攻毒時實驗結(jié)果，未免疫組小鼠死亡率達(dá)到90%， 而免疫組小鼠存活率分別為70%，50%，60%，顯著高于未免疫組，表明經(jīng)過三種方式免疫 后，LSM110D10均可提供較高的交叉保護(hù)力以抵御ST658型強(qiáng)毒力菌株LSM102的攻擊。表6為 圖14的數(shù)據(jù)統(tǒng)計。
[0093] 表 6
[0094]
[0095] 因為世界范圍內(nèi)豬鏈球菌感染仍以ST1為核心，ST7數(shù)量最多，且與ST1親緣關(guān)系很 近，都屬于CC1克隆群，ST658也屬于CC1克隆群，ST658與主流菌株親緣關(guān)系較近，屬于感染 的核心菌株，本發(fā)明所構(gòu)建的疫苗對ST658具有交叉保護(hù)力，具有較大的現(xiàn)實意義。
[0096] 4)免疫后小鼠全血?dú)⒕芰?。二?4天后，采集免疫組及未免疫組小鼠全血。豬鏈 球菌2型強(qiáng)毒力菌株SC19和ST658型強(qiáng)毒力菌株LSM102培養(yǎng)至對數(shù)期，調(diào)整濃度至5X 104CFU/mL，取50yL菌液分別與450yL小鼠（皮下免疫，滴鼻免疫，灌胃免疫，對照組4組）的新 鮮血液混合，緩慢轉(zhuǎn)動，置于37°C條件下培養(yǎng)。于120min取100yL適當(dāng)稀釋后涂平板計數(shù)。相 關(guān)結(jié)果見圖13和圖15。圖13為本發(fā)明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三種方式免疫小鼠之 后，采集小鼠全血，做SC19強(qiáng)毒力菌株全血?dú)⒕?，未免疫組增長率約為100%，與未免疫組小 鼠相比，經(jīng)三種方式免疫后的小鼠全血中，SC 19增長率分別約為5 %，30 %，10 %，表明免疫 后的全血均具有顯著的殺菌能力。
[0097]圖15為本發(fā)明的LSM110D10以皮下，滴鼻，灌胃三種方式免疫小鼠之后，采集小鼠 全血，做ST658型強(qiáng)毒力菌株LSM102的全血?dú)⒕?，未免疫組增長率約為100%，與未免疫組小 鼠相比，經(jīng)三種方式免疫后的小鼠全血中，LSM102增長率約為10%，20%，12%，表明免疫后 小鼠全血均具有顯著的殺菌能力，顯示出疫苗具備交叉保護(hù)力。
【主權(quán)項】
1. 一種豬鏈球菌2型10基因缺失株，其特征在于：豬鏈球菌（?SirejOiococcus suis) LSM110D10,保藏編號為：CCTCC NO: Μ 2015800。2. 權(quán)利要求1所述的豬鏈球菌2型10基因缺失株在制備治療或預(yù)防豬鏈球菌2型感染藥 物中的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述的豬鏈球菌2型10基因缺失株在制備豬鏈球菌檢測的全菌標(biāo)準(zhǔn)品中 的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K39/09GK106085936SQ201610422135
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月14日 公開號201610422135.6, CN 106085936 A, CN 106085936A, CN 201610422135, CN-A-106085936, CN106085936 A, CN106085936A, CN201610422135, CN201610422135.6
【發(fā)明人】李錦銓, 周洋, 王小紅, 李志偉, 林蠡, 董星星
【申請人】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)