一種利用重組鈍齒棒桿菌高效合成l?茶氨酸的方法
【專利摘要】一種利用重組鈍齒棒桿菌高效合成L?茶氨酸的方法，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明首先驗(yàn)證了枯草芽孢桿菌來(lái)源的GGT信號(hào)肽可以實(shí)現(xiàn)GGT在C.glutamicum體系中分泌表達(dá)。同時(shí)重組菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19?tacM?ggt的胞外酶活約為C.glutamicum SDNN403/pXMJ19?ggt的2倍，這說(shuō)明tacM啟動(dòng)子更有利于GGT酶活的合成。采用底物流加策略高產(chǎn)L?茶氨酸，轉(zhuǎn)化體系包含：終濃度為0.8U/mL的GGT，pH 10，37℃，從0h開始每隔兩個(gè)小時(shí)補(bǔ)加22mmol/L的L?谷氨酰胺，66mmol/L的乙胺。批次流加在12h時(shí)達(dá)到最大茶氨酸產(chǎn)量118mmol，轉(zhuǎn)化率為92.8％。本文首次實(shí)現(xiàn)B.subtilis來(lái)源的γ?谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因(ggt)在C.glutamicum SDNN403中分泌表達(dá)，通過(guò)分批流加底物獲得目前報(bào)道的利用重組C.glutamicum合成L?茶氨酸的最高產(chǎn)量。
【專利說(shuō)明】
一種利用重組鈍齒棒桿菌高效合成L-茶氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 一種利用重組鈍齒棒桿菌表達(dá)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶蛋白，然后利用該蛋白酶催化L-谷氨酰胺和乙胺生成L-茶氨酸的方法，屬于基因工程和酶工程領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] L-茶氨酸，化學(xué)名稱為Ν-乙基-γ-L-谷氨酰胺，是一種幾乎只存在于茶類植物中 的游離氨基酸，決定茶葉的風(fēng)味和品質(zhì)。茶氨酸具有多種重要的生理功能:放松減壓作用； 降血壓作用;抑制咖啡因引起的興奮反應(yīng);提高學(xué)習(xí)能力;抗腫瘤;控制體重等。早在1985年 美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)已經(jīng)認(rèn)證L-茶氨酸為一般公認(rèn)安全的物質(zhì)(GRAS)，在食品中 使用沒有特定用量限制。鑒于茶氨酸上述諸多生理功效及其絕對(duì)安全性，其作為一種食品 組分及飲品添加劑的需求量日益增加。進(jìn)入21世紀(jì)，酶法轉(zhuǎn)化合成以其優(yōu)越性日益受到青 睞，因此研究人員重心也集中于酶法合成L-茶氨酸，可用于合成茶氨酸的酶包括谷氨酰胺 合成酶，谷氨酰胺酶和γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。谷氨酰胺合成酶受ATP供應(yīng)限制，谷氨酰胺酶產(chǎn)物 對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率低，γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶脫穎而出。
[0003] γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶分布廣泛，負(fù)責(zé)催化谷胱甘肽及其類似物的γ-谷氨酰鍵的斷 裂，并將生成的γ-谷氨酰基團(tuán)轉(zhuǎn)移給水(此時(shí)即為水解反應(yīng))或者其他氨基酸(轉(zhuǎn)肽反應(yīng)）。 利用GGT的轉(zhuǎn)肽功能，選定L-谷氨酰胺和乙胺作為供體和受體時(shí)，即可實(shí)現(xiàn)酶法生成L-茶氨 酸。
[0004] 酶法催化中生產(chǎn)菌株的選育至關(guān)重要。目前γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的表達(dá)多選用大腸 桿菌體系，江南大學(xué)吳敬教授課題組利用大腸桿菌的分泌型質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)了 GGT蛋白的胞外分 泌，該酶催化200mmol/L L-谷氨酰胺和2.2mol/L乙胺可生成156mmol/L茶氨酸，但是該大腸 桿菌宿主表達(dá)體系仍存在一定的安全隱患。本課題組前期成功在B.subtilis中實(shí)現(xiàn)了該蛋 白的過(guò)量表達(dá)，胞外獲得可觀的蛋白酶含量。上述研究為我們實(shí)驗(yàn)提出了要求和思路:生產(chǎn) 菌株的絕對(duì)安全性和目的蛋白能否在宿主菌中實(shí)現(xiàn)胞外分泌。鈍齒棒桿菌SDNN403是經(jīng)過(guò) 多級(jí)誘變篩選獲得、適用于多種氨基酸高產(chǎn)的安全菌株，具備高效表達(dá)外源蛋白的潛力，目 前尚未有利用重組鈍齒棒桿菌生產(chǎn)茶氨酸的報(bào)導(dǎo)。同時(shí)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)B.subtilis的胞外蛋白 基因能利用自身的信號(hào)肽在芽孢桿菌宿主系統(tǒng)中有效分泌表達(dá)，B. subti 1 is來(lái)源的GGT有 望在Corynebacterium glutamicum中實(shí)現(xiàn)分泌表達(dá)。因此本論文選用鈍齒棒桿菌做為宿主 菌，在克隆枯草芽孢桿菌γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因時(shí)選擇性的保留該基因的信號(hào)肽片段，研究 該信號(hào)肽片段是否可在宿主菌中發(fā)揮引導(dǎo)分泌功能，以及該重組菌的目的蛋白表達(dá)情況及 所表達(dá)蛋白酶的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)能力。
[0005] 本實(shí)驗(yàn)利用PXMJ19質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)了 B.subtilis 168來(lái)源的γ-glutamyltranspeptidase基因在C. crenatum SDNN403的表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)GGT蛋白的信號(hào)肽 片段可以在鈍齒棒桿菌中被識(shí)別，從而引導(dǎo)該目的蛋白分泌到胞外，該分泌作用使得酶活 提高4倍，這就為鈍齒棒桿菌中外源蛋白的分泌提供一條可選用的信號(hào)肽序列。
[0006] 利用該胞外蛋白酶液轉(zhuǎn)化L-谷氨酰胺和乙胺生成茶氨酸，并對(duì)受體、供體的添加 比例及最適添加酶量進(jìn)行了優(yōu)化，在上述基礎(chǔ)上在12h的轉(zhuǎn)化進(jìn)程中流加雙底物，獲得最大 的茶氨酸產(chǎn)量118mmol/L，轉(zhuǎn)化率為92.8%。這是目前報(bào)道的利用重組C.glutamicum合成L- 茶氨酸的最高產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一株重組鈍齒棒桿菌用于酶法催化合成茶氨酸，同時(shí)驗(yàn)證 γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶蛋白的信號(hào)肽序列在宿主菌中的引導(dǎo)分泌作用，以期實(shí)現(xiàn)目的蛋白的分 泌表達(dá)。隨后將該重組菌的胞外蛋白酶用于轉(zhuǎn)化L-茶氨酸，并對(duì)茶氨酸的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu) 化。為鈍齒棒桿菌作為宿主表達(dá)外源蛋白及茶氨酸的生產(chǎn)均提供了有益的指導(dǎo)。
[0008] 本發(fā)明所述的重組菌是在研究室保藏的鈍齒棒桿菌的表達(dá)B.subtilis JNA(保藏 號(hào)CCTCC M209309;專利申請(qǐng)公布號(hào)CN 101864381 A)來(lái)源的 γ-glutamyltranspeptidase 蛋白得到的，該鈍齒棒桿菌是本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)傳統(tǒng)誘變育種手段得到的一株鈍齒棒桿菌 Corynebacterium crenatum SDNN403(保藏編號(hào)CGMCC0890,專利號(hào)為：ZL 03112896.3)。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案：
[0010] 1.重組質(zhì)粒pXMJ19_tacM的構(gòu)建
[0011] Nco I F 5'-CATGCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTT-3'（Nco I F)
[0012] tacM-R 5'-CCGCTCACAATTCCACACATGGTACCACACGATGATTAAT T-3'
[0013] Nde I R 5'-GGAATTCCATATGTTCGGGTTATGTGGCCCCCGTG-3'（Nde I)
[0014] tacM-F 5'-ATATTCTGAA ATGAGCTGTT GACAATTAAT CATCGTGTGG TACCAT-3'
[0015] 以PXMJ19載體為模板，選用PrimerSTAR HS高保真酶，利用兩對(duì)引物Nde I R、 TacM-F和Nco I F、tacM_R分別擴(kuò)增出tac-lacIq-Nde I片段和Nco I-oripUC-tac片段，基 因片段大小分別約為2 7 0 0 b p和2 1 0 0 b p，其中兩片段重疊部分序列為 ATTAATCATCGTGTGGTACCAT(下劃線部分為tac啟動(dòng)子所發(fā)生突變的部位及其突變后的序 列）。膠回收上述兩個(gè)DNA片段，準(zhǔn)備進(jìn)行下一輪PCLPCR體系包含dNTP、Pfu酶及其buffer， 再加入上述兩PCR產(chǎn)物使其互為模板及引物(總量設(shè)置為lyL，可根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度調(diào)整其用 量比例），較低的退火溫度下（50-55°C )延伸3-5個(gè)循環(huán)后，向體系中加入兩端引物NC01F， NdelR，擴(kuò)增出啟動(dòng)子突變的NCOl-tacM-Ndel片段，片段加 A尾巴處理后連接到pMD18-T載體 上轉(zhuǎn)化大腸桿菌。提取得到的重組T載體酶切處理后連接至相同酶切處理收集到的pXMJ19 的小片段上(約1788bp)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒單雙酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證成功后即為 改造成功的pXMJ19-tacM載體。
[0016] 2 · ggt基因的克隆及表達(dá)載體 pXMJ19-ggt、pXMJ19-tacM-ggt，pXMJ19-A spggt 的 構(gòu)建
[0017] 根據(jù)NCBI公布的枯草芽孢桿菌的全基因組核酸序列中g(shù)gt的基因序列設(shè)計(jì)引物， 并在上游和下游引物的5'端分別加上Bam H I、Eco R1酶切位點(diǎn)(加下劃線）。
[0018] ggt-F 5，-CGC GGATCC AAAGGAGGGAAATCATGAAAAGAA CGTGGAACGT CT-3，
[0019] ggt-F15 '-CGCGGATCCAAAGGAGGGAAATCATGAAAAAACCGCCCAAAAGCTACGA-3，
[0020] ggt-R 5 '-CCGGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTACGTTTTAAATTAATGCCG-3，
[0021] FI:切除ggt基因自身信號(hào)肽(84bp)剩余片段，驗(yàn)證該信號(hào)肽的功能。
[0022] 提取B.subtilis 168的基因組作為模板，以ggt-F(Fl)/ggt-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 獲得目的基因片段ggt、Asp ggUPCR總反應(yīng)體系為50yL，包含lng的質(zhì)粒模板，200ymol/L dNTP，20ymol/L引物和lyL的Ex Taq DNA聚合酶。程序設(shè)定為95°C預(yù)變性5min;循環(huán)擴(kuò)增程 序?yàn)?5°C變性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸105sec(根據(jù)實(shí)際情況，時(shí)間設(shè)定為lkb/ 1^1〇,35個(gè)循環(huán);72°(：延伸1〇1^11。？0?反應(yīng)產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離，目的條帶切 割后，用膠回收試劑盒(Takara)回收，回收的基因片段與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109， 經(jīng)過(guò)氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，重組質(zhì)粒命名為下-ggt，T-Asp ggt，DNA測(cè)序由上海生工生物有限公司完成。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒丁-ggt，T-Asp ggt，用Bam Η I和Eco R I雙酶切后連接到經(jīng)過(guò)相同酶切處理的pXMJ19和 pXMJ19_tacM上，構(gòu)建表達(dá)載體pXMJ19_ggt、pXMJ19_tacM_ggt、pXMJ19_Asp ggt。3GGT在鈍 齒棒桿菌SDNN403中的表達(dá)
[0023 ]將構(gòu)建好的表達(dá)載體 pXMJ 19-ggt、pXMJ 19-tacM-gg t、pXMJ 19-Aspggt 電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn) 化至C.glutamicum SDNN403感受態(tài)中，在氯霉素抗性平板上篩選陽(yáng)性重組子，提取質(zhì)粒進(jìn) 行酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確即為構(gòu)建成功的重組菌C · glutamicum SDNN403/pXMJ19_ggt、 C.glutamicum SDNN403/pXMJ19_tacM-ggt、C.glutamicum SDNN403/pXMJ19_Asp ggt。上 述菌株分別接種至含有10yg/mL氯霉素的LBG液體培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)過(guò)夜，次日以10%的接 種量轉(zhuǎn)接至25mL的鈍齒發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加 IPTG終濃度為0.8mM進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，完整培 養(yǎng)周期為96h。培養(yǎng)結(jié)束后8000rpm離心20min，收集上清液即為胞外酶液，4°C保存。細(xì)胞沉 淀用pH 8.0的Tris-HCl緩沖液洗滌3次，重懸浮于該緩沖液中，超聲波破碎儀破碎細(xì)胞。 lOOOOrpm離心30min去除沉淀細(xì)胞碎片，上清即為胞內(nèi)蛋白液，置于4°C保存。均用于后續(xù) GGT的酶活測(cè)定。
[0024] 4GGI1酶活力的測(cè)定
[0025] GGT轉(zhuǎn)肽酶活的測(cè)定原理是利用酶的轉(zhuǎn)肽功能，催化底物γ -L-谷氨酰對(duì)硝基苯胺 (γ-GpNA)的γ -谷氨?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)移到受體雙甘二肽，隨之生成的對(duì)硝基苯胺在410nm處有特 殊吸收，通過(guò)測(cè)定該反應(yīng)生成的對(duì)硝基苯胺的濃度來(lái)衡量GGI1酶活力。
[0026] lmL反應(yīng)體系中包含：50mmol/L硼酸-NaOH緩沖液(pH 10·0)，2·5mmol/L γ -GpNA， 60mmol/L雙甘二肽，20yL適當(dāng)稀釋的酶液。37°C反應(yīng)10min后，添加125μΙ^度為3.5mol/L的 醋酸終止反應(yīng)。以不添加雙甘二肽受體的反應(yīng)液作為對(duì)照，其他處理均和實(shí)驗(yàn)組相同， 410nm處測(cè)定吸光度差值。酶活單位定義為：lmin內(nèi)經(jīng)由轉(zhuǎn)肽反應(yīng)催化生成Ιμπιο?對(duì)硝基苯 胺(p-Nitrophenylamine)所需酶量即為一個(gè)酶活單位(U)。
[0027] 5L-茶氨酸的酶法生產(chǎn)
[0028] L-茶氨酸的轉(zhuǎn)化體系:供體L-谷氨酰胺，受體乙胺，GGT蛋白酶;反應(yīng)條件為pH 10， 37 °C下反應(yīng)一定時(shí)間，添加10 %的TCA終止反應(yīng)。
[0029] 6L-茶氨酸含量的測(cè)定方法
[0030]采用高效液相色譜(HPLC)來(lái)測(cè)定L-茶氨酸的含量。反應(yīng)液離心，經(jīng)0.24μπι濾膜過(guò) 濾后上樣。
[0031] 0ΡΑ柱前自動(dòng)衍生。HPLC條件：Angilent 1260;色譜柱：Hypersil 0DS C18(4.0mm X 125mm)。流動(dòng)相A，流動(dòng)相B;流動(dòng)相梯度程序:保留時(shí)間為0、27.5、31.5、34、35、40min時(shí)， A/B分別為92:8、40:60、0:100、0:100、92:8、92:8;流速:1 · OmL/min;檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器;檢 測(cè)波長(zhǎng):338nm;柱溫:40°C。本發(fā)明的有益效果:通過(guò)基因工程手段擴(kuò)增本實(shí)驗(yàn)已有的具有 γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活力的枯草芽孢桿菌的該酶基因，借助本實(shí)驗(yàn)室已有的成熟的枯草表達(dá) 體系，實(shí)現(xiàn)了 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因在模式菌株B.subtilis 168中的過(guò)量表達(dá)。將該菌株以 1%接種量接種于50mL的優(yōu)化培養(yǎng)基中，60h后離心收集上清，按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活，結(jié)果顯 示酶活為原始菌株的20倍。將上清酶液純化后用于茶氨酸轉(zhuǎn)化，以80mM L-谷氨酰胺為供 體，640mM乙胺作為受體，GGT添加量為0.6units/ml，在pH 10溫度37°C條件下反應(yīng)5小時(shí)，L-茶氨酸生成量為68.7mM，相應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為86%。
[0032]本發(fā)明的有益成果：本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了 B.subtilis 168來(lái)源的γ-glutamyltranspeptidase基因在C. glutamicum SDNN403的表達(dá)。C. glutamicum SDNN403是 一株適合于氨基酸生產(chǎn)的安全菌株，其細(xì)胞培養(yǎng)可以達(dá)到的高密度水平也使其具備作為宿 主菌表達(dá)外源蛋白的潛能，因此該表達(dá)系統(tǒng)不但可以滿足工業(yè)生產(chǎn)的安全性，而且可以滿 足工業(yè)生產(chǎn)的強(qiáng)度。同時(shí)發(fā)現(xiàn)GGT蛋白的信號(hào)肽片段可以在鈍齒棒桿菌中被識(shí)別，從而引導(dǎo) 該目的蛋白分泌到胞外，該分泌作用使得酶活提高4倍，這就為鈍齒棒桿菌中外源蛋白的分 泌提供一條可選用的信號(hào)肽序列。
[0033]利用該胞外蛋白酶液轉(zhuǎn)化L-谷氨酰胺和乙胺生成茶氨酸，并對(duì)受體、供體的添加 比例及最適添加酶量進(jìn)行了優(yōu)化，在上述基礎(chǔ)上在12h的轉(zhuǎn)化進(jìn)程中流加雙底物，獲得最大 的茶氨酸產(chǎn)量118mmol/L，轉(zhuǎn)化率為92.8%。這是目前報(bào)道的利用重組C.glutamicum合成L- 茶氨酸的最高產(chǎn)量。
【附圖說(shuō)明】
[0034]無(wú)
[0035]具體實(shí)施方法
[0036] 下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
[0037] 實(shí)施例1: γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因的克隆及其表達(dá)載體的構(gòu)建
[0038] 以pXMJ19載體為模板，選用PrimerSTAR HS高保真酶，利用兩對(duì)引物Nde I R、 TacM-F和Nco I F、tacM_R分別擴(kuò)增出tac-lacIq-Nde I片段和Nco I-oripUC-tac片段，基 因片段大小分別約為2 7 0 0 b p和2 1 0 0 b p，其中兩片段重疊部分序列為 ATTAATCATCGTGTGGTACCAT(下劃線部分為tac啟動(dòng)子所發(fā)生突變的部位及其突變后的序 列）。膠回收上述兩個(gè)DNA片段，準(zhǔn)備進(jìn)行下一輪PCLPCR體系包含dNTP、Pfu酶及其buffer， 再加入上述兩PCR產(chǎn)物使其互為模板及引物(總量設(shè)置為lyL，可根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度調(diào)整其用 量比例），較低的退火溫度下（50-55°C )延伸3-5個(gè)循環(huán)后，向體系中加入兩端引物NC01F， NdelR，擴(kuò)增出啟動(dòng)子突變的NCOl-tacM-Ndel片段，片段加 A尾巴處理后連接到pMD18-T載體 上轉(zhuǎn)化大腸桿菌。提取得到的重組T載體酶切處理后連接至相同酶切處理收集到的pXMJ19 的小片段上(約1788bp)，獲得pXMJl9-tacM載體。
[0039] 提取B.subtilis 168的基因組為模板，ggt-Fl、ggt-F/ggt-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增出目的基因片段Asp ggt(切除信號(hào)肽的片段基因，大小為1680bp)和ggt(完整基因， 大小為176仙？）。？0?產(chǎn)物連接T載體，轉(zhuǎn)化至E.coli JM109感受態(tài)，獲得的T連載體分別經(jīng) Bam Η I和Eco R I雙酶切驗(yàn)證:pMD18-T_Asp ggt質(zhì)粒酶切得到Asp ggt基因片段，大小 為1698 bp(其中包含18bp His編碼序列）及線性化的pMD18-T質(zhì)粒，大小為2692 bp;pMD18-T-ggt得到大小為1782bp的ggt基因片段(亦包含His編碼序列）以線性化的pMD18-T質(zhì)粒，理 論值和實(shí)際值相符。
[0040] T連載體上切下來(lái)目的基因片段，連接經(jīng)相同酶切處理的PXMJ19和pXMJ19-tacM載 體，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)中，得到重組表達(dá)載體pXMJ19_Asp ggt、pXMJ19-ggt、 pXMJ19-tacM，單、雙酶切驗(yàn)證。表明外源基因 Asp ggt、ggt已經(jīng)正確連接到表達(dá)載體 PXMJ19和pXMJ19-tacM〇
[0041 ] 實(shí)施例2:C.glutamicum SDNN403重組菌的構(gòu)建及GGT蛋白表達(dá)情況分析
[0042]將重組質(zhì)粒pXMJ19_Asp ggt、pXMJ19_ggt、pXMJ19_tacM轉(zhuǎn)化至C · glutamicum SDNN403感受態(tài)，質(zhì)粒驗(yàn)證篩選得到陽(yáng)性重組子C· glutamicum SDNN403/pXMJ19_Asp ggt， C· glutamicum SDNN403/pXMJ19_ggt，C · glutamicum SDNN403/pXMJ19_tacM-ggt。將其接種 于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30°C條件下培養(yǎng)過(guò)夜，次日以10%的接種量轉(zhuǎn)接至高產(chǎn)精氨酸培養(yǎng)基中 培養(yǎng)，對(duì)數(shù)中期添加 IPTG至終濃度為0.8mM進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)96h。培養(yǎng)結(jié)束后離收集上清 液即為胞外酶液，4°C保存。細(xì)胞沉淀破碎后亦留作后續(xù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：重組菌 C.glutamicum SDNN403/pXMJ19_Asp ggt 只觀察到胞內(nèi)蛋白條帶，C.glutamicum SDNN403/pXMJ19_ggt和C· glutamicum SDNN403/pXMJ19_tacM-ggt胞內(nèi)、外均觀察到明顯條 帶?？傻贸鼋Y(jié)論：（1)GGT蛋白是由兩個(gè)亞基構(gòu)成的二聚體，大小分別為42KD，22KD;(2)是在 GGT蛋白信號(hào)肽的引導(dǎo)下，蛋白在C. glutami cum SDNN403中實(shí)現(xiàn)分泌。該現(xiàn)象與有關(guān)報(bào)道稱 在芽孢桿菌宿主系統(tǒng)中，革蘭氏陽(yáng)性菌的胞外蛋白基因一般都能利用自身的啟動(dòng)子和信號(hào) 肽有效分泌表達(dá)一致。
[0043]實(shí)施例3:重組菌株GGI1酶活力測(cè)定
[0044] 重組菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19_Asp ggt、C.glutamicum SDNN403/ pXMJ19_ggt和C·glutamicum SDNN403/pXMJ19_tacM-ggt在精氨酸高產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)束 后，分別測(cè)定胞內(nèi)破碎上清液及發(fā)酵上清中GGT的酶活力，結(jié)果如表1所示。因胞內(nèi)、胞外的 蛋白含量不具備可比性，故此處只考慮絕對(duì)酶活單位。重組菌C. glutamicum SDNN403/ pXMJ19_Asp ggt中只檢測(cè)到胞內(nèi)GGT酶活0.99U/mL。重組菌C. glutamicum SDNN403/ pXMJ19-ggt中胞內(nèi)外均檢測(cè)到酶活，分別為0·27U/mL，4·69U/mL，C·glutamicum SDNN403/ pXMJ19-tacM-ggt中胞內(nèi)外均檢測(cè)到酶活，分別為0.32U/mL，10.31U/mL。從該酶活數(shù)據(jù)可以 看出（表1 )，重組菌C.glutamicum SDNN403/pXMJ19_ggt和C.glutamicum SDNN403/pXMJ19_ tacM-ggt中，胞外酶活水平為胞內(nèi)水平的接近20倍，說(shuō)明此時(shí)蛋白絕大多數(shù)都分泌到了胞 外。同時(shí)重組菌C·glutamicum SDNN403/pXMJl9-tacM-ggt的胞外酶活約為C·glutamicum SDNN403/pXMJ 19-ggt的2倍。這說(shuō)明tacM啟動(dòng)子更有利于GGI1酶活的合成。
[0045] 表1重組菌GGI1酶活測(cè)定
[0046]
[0047]實(shí)施例4:乙胺濃度對(duì)GGT合成茶氨酸的影響
[0048]幾乎所有GGT蛋白酶催化生產(chǎn)L-茶氨酸的最適條件均為溫度37°C，pH 10.0,而供 體L-谷氨酰胺和乙胺用量間比例及酶的添加量多有不同，因此主要研究這兩個(gè)變量對(duì)GGT 合成茶氨酸的影響。在該轉(zhuǎn)肽酶的催化過(guò)程中，除了主轉(zhuǎn)肽反應(yīng)生成目的產(chǎn)物L(fēng)-茶氨酸外， 還存在多種副反應(yīng)甚至多級(jí)反應(yīng)，其中以水解副反應(yīng)生成L-谷氨酸和自轉(zhuǎn)肽反應(yīng)生成L-谷 氨酰-谷氨酰胺為主。催化過(guò)程中谷氨酰胺或作為底物殘留，或被酶催化生成產(chǎn)物;酶催化 產(chǎn)物又可分為主產(chǎn)物L(fēng)-茶氨酸和副產(chǎn)物;三者(谷氨酰胺殘留，L-茶氨酸，副產(chǎn)物)總物質(zhì)量 之和理論上應(yīng)和初始谷氨酰胺添加量相等。因此在底物L(fēng)-谷氨酰胺添加量固定的情況下， 前兩者之和(谷氨酰胺殘留量，主產(chǎn)物L(fēng)-茶氨酸)越大，第三者（副產(chǎn)物)越小，反之亦然，因 此我們可以通過(guò)檢測(cè)底物殘留量和茶氨酸生成量判斷副產(chǎn)物總體水平。過(guò)程中要保證受體 量大于供體，因此從乙胺用量從40mmol/L到120mmol/L，保證反應(yīng)體系的其他條件:22mmol/ L的L-谷氨酰胺，pH 10,37°C，反應(yīng)時(shí)間5h不變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：乙胺濃度較低時(shí)，酶對(duì)L-谷 氨酰胺的利用率處于較高水平(底物殘留少），但是L-茶氨酸和L-谷氨酰胺殘留量之和小， 說(shuō)明此時(shí)副產(chǎn)物生成多，水分子的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)使得水解副產(chǎn)物L(fēng)-谷氨酸含量應(yīng)在實(shí)驗(yàn)組中處 于最高水平。隨著乙胺含量的增加，66mmol/L時(shí)獲得最高的茶氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。乙胺濃度 再增加時(shí)，谷氨酰胺殘留開始顯著增加。因?yàn)槭荏w乙胺的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，副產(chǎn)物的量并未增加。 由此推測(cè)，高濃度的乙胺對(duì)酶存在抑制作用。
[0049] 實(shí)施例5:酶添加量對(duì)GGT合成茶氨酸的影響
[0050] 酶的添加量對(duì)反應(yīng)具有重要影響，但同樣由于多種副反應(yīng)的存在，單純的提高酶 量可能會(huì)催生更多的副產(chǎn)物的生成。因此研究酶的最適添加量，選用優(yōu)化得到的乙胺濃度 60mmo 1/L，其他條件如上保持不變。酶量較少(0.02U/mL)時(shí)，酶對(duì)底物的利用率有限，底物 L-谷氨酰胺殘留量多，產(chǎn)物L(fēng)-茶氨酸量和副產(chǎn)物量均較少。隨著酶量的增加，對(duì)底物的利用 率逐漸增強(qiáng)，而L-谷氨酰胺殘留量和L-茶氨酸生成量之和卻在逐漸減少，說(shuō)明此時(shí)副產(chǎn)物 的生成量呈增加趨勢(shì)。酶最適添加量為〇. 〇6U/mL，此時(shí)茶氨酸產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率均最高。
[0051 ]實(shí)施例6:雙底物流加的批次轉(zhuǎn)化方法高產(chǎn)L-茶氨酸
[0052]在上面條件優(yōu)化過(guò)程中可以看出，反應(yīng)過(guò)程中必須嚴(yán)格控制供體、受體比例及酶 的添加量。高濃度的乙胺并不利于酶的轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，供體谷氨酰胺又存在溶解度的限制，因此 可以通過(guò)同時(shí)流加兩個(gè)底物的補(bǔ)料策略來(lái)實(shí)現(xiàn)放大轉(zhuǎn)化體系。將一個(gè)較長(zhǎng)時(shí)間的過(guò)程分成 若干個(gè)階段，降低一次性加入L-谷氨酰胺和乙胺的量，不僅有助于L-谷氨酰胺的溶解，同 時(shí)可以更好的控制堿性乙胺所引起的pH變化問題?？紤]到酶的穩(wěn)定性及產(chǎn)物、底物抑制效 應(yīng)的存在，適當(dāng)擴(kuò)大酶的添加量(3倍）。初始轉(zhuǎn)化體系體積為40mL，包含22mmol/L的L-谷氨 酰胺，66mmol/L的乙胺，終濃度為0.8U/mL的GGT;轉(zhuǎn)化條件pH 10，37°C ;每隔兩個(gè)小時(shí)補(bǔ)加 22mmol/L的L-谷氨酰胺，66mmol/L的乙胺;補(bǔ)料前取樣，補(bǔ)料后調(diào)節(jié)pH，茶氨酸產(chǎn)量不再增 加時(shí)停止反應(yīng)。在反應(yīng)進(jìn)行到1211時(shí)獲得最大的茶氨酸產(chǎn)量118_ 〇1/1，轉(zhuǎn)化率為92.8%。該 L-茶氨酸產(chǎn)量及底物轉(zhuǎn)化率相較一次性加入具有明顯優(yōu)勢(shì)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高效分泌合成γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的重組鈍齒棒桿菌，其特征是:將SEQ ID NO: 1 所示ggt基因克隆至pXMJ 19-tacM載體上并轉(zhuǎn)化至鈍齒棒桿菌中獲得。2. 將權(quán)利要求1重組鈍齒棒桿菌生產(chǎn)的γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶用于茶氨酸的生產(chǎn)，其特征在 于:反應(yīng)體系為:適量的L-谷氨酰胺，適量的乙胺，適量的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶酶液，pH 10,反 應(yīng)溫度37°C，每隔兩個(gè)小時(shí)補(bǔ)加15-30mmol/L的L-谷氨酰胺，50-70mmol/L的乙胺;補(bǔ)料前取 樣，補(bǔ)料后調(diào)節(jié)pH至10,茶氨酸產(chǎn)量不再增加時(shí)停止反應(yīng)。3. 權(quán)利要求2所述反應(yīng)體系中，L-谷氨酰胺添加量?jī)?yōu)選22mmol/L，乙胺添加量?jī)?yōu)選 66mmol/L，γ -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶添加量?jī)?yōu)選0.8U/mL。
【文檔編號(hào)】C12R1/15GK106085938SQ201610454875
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月22日
【發(fā)明人】饒志明, 楊套偉, 和斐, 張顯, 徐美娟
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)