一種促進琥珀酸積累的方法
一種促進琥珀酸積累的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進琥珀酸積累的方法，屬于遺傳工程和發(fā)酵工程領域。本發(fā)明以可積累琥珀酸且副產物乙醇減少的菌株MPΔSdh2為出發(fā)菌株，通過過量表達源于米根霉的丙酮酸羧化酶基因RoPYC后，可積累琥珀酸0.72±0.02g/L，進一步引入SpMAE1后，琥珀酸產量略有下降，但可積累丙酮酸8.31±0.41g/L，較對照提高了55.04％；在此基礎上，而添加最適量的生物素(96μg/L)，菌株MPΔS+pY15TEF1?RoPYC+pYX212?SpMAE1可積累琥珀酸2.66±0.03g/L，較不添加生物素時提高了211.70％。本發(fā)明為提高琥珀酸積累提供了一個有效的方法，具有很好的工業(yè)應用價值和前景。
【專利說明】
_種促進號拍酸積累的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種促進琥珀酸積累的方法，屬于遺傳工程和發(fā)酵工程領域。
【背景技術】
[0002] 琥?白酸（succinic acid)是一種四碳二元酸，學名為丁二酸(butanedioic acid)。 琥珀酸具有30多種重要衍生物化學制品：四氫呋喃、1，4-丁二醇、γ-丁內酯、馬來酸和反丁 烯二酸等，具有巨大的市場空間。在食品行業(yè)，主要用作酸味劑、調味劑等;在醫(yī)藥行業(yè)，可 用于合成鎮(zhèn)靜劑、pH調節(jié)劑、避孕藥、抗癌藥物等;在化學行業(yè)，主要用作離子螯合劑、表面 活性劑、清潔劑添加劑、起泡劑和潤滑劑等。值得一提的是，琥珀酸作為生物可降解塑料聚 丁二酸丁二醇酯（可完全降解）的主要原料，具有廣泛的應用前景。鑒于上述琥珀酸的重要 應用價值及諸多優(yōu)勢，美國能源部于2004年專門成立了 1，4_二羧酸組，研究琥珀酸、蘋果酸 和延胡索酸的生產工藝和應用。
[0003] 目前，琥珀酸的生產方法主要有化學合成法和微生物發(fā)酵法。與化學合成法相比， 微生物發(fā)酵法具有很多優(yōu)勢：原料來源廣，成本低，可再生;反應條件溫和，能耗小，環(huán)境友 好。因此，微生物發(fā)酵法生產琥珀酸備受人們的關注，近年來，微生物法生產琥珀酸的研究 進展迅速。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為一種真核模式微生物，因具有:遺傳 信息豐富，代謝改造操作方便;營養(yǎng)需求簡單，分離提取工藝成本低廉;在低pH條件下(甚至 pH〈3.0)生長良好;能夠耐受高濃度的底物;被FDA認證為GRAS(General RegardedAs Safe) 微生物，發(fā)酵產品具有安全性等優(yōu)點而成為發(fā)酵生產羧酸（乳酸、丙酮酸、蘋果酸、延胡索 酸、琥珀酸、酮戊二酸等）的潛在最適微生物。然而，利用釀酒酵母發(fā)酵生產琥珀酸面臨以 下問題：（1)在高濃度糖及通風的條件分批發(fā)酵產生大量的乙醇，對于以羧酸為目標產物來 說，乙醇的大量積累使得碳流大量的損失；（2)琥珀酸是TCA循環(huán)中的中間代謝產物，釀酒酵 母本身不具有過量積累琥珀酸的代謝途徑，需要構建琥珀酸的合成途徑，但琥珀酸有比較 高的還原勢，若通過TCA還原途徑積累琥珀酸，需要兩個還原氫，比較難積累；（3)實現(xiàn)減少 乙醇產生，丙酮酸得到積累后，如何使得丙酮酸進一步轉化為目標產物琥珀酸，需要增強丙 酮酸羧化反應，使之轉化為草酰乙酸，進入TCA循環(huán)，進而轉化為琥珀酸；（4)琥珀酸在胞內 過量合成時，需要及時將胞內的琥珀酸轉運到胞外，才能實現(xiàn)琥珀酸的高效生產。
【發(fā)明內容】
[0004] 本發(fā)明要解決的第一個技術問題是提供一種琥珀酸產量提高的釀酒酵母基因工 程菌，為代謝工程改造釀酒酵母高效生產琥珀酸打下基礎。
[0005] 所述基因工程菌是以一株產琥珀酸且副產物乙醇減少的菌株ΜΡΔ Sdh2為出發(fā)菌 株，過量表達源于米根霉的丙酮酸羧化酶基因 RoPYC及源于粟酒裂殖酵母的蘋果酸轉運酶 基因 SpMAEl。
[0006] 所述釀酒酵母ΜΡΔ Sdh2是以釀酒酵母為出發(fā)菌株，用蘋果酸脫氫酶基因替換了乙 醇代謝途徑中的丙酮酸脫羧酶基因 PDC1，在此基礎上，敲除了琥珀酸代謝途徑中的琥珀酸 脫氫酶基因 SDH2;所述蘋果酸脫氫酶基因來源于米根霉，所述琥珀酸脫氫酶基因 SDH2的核 苷酸序列如Gene ID: 1360234所示。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述丙酮酸羧化酶基因 RoPYC的序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述蘋果酸轉運酶基因 SpMAEl的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述釀酒酵母ΜΡΔ Sdh2是以釀酒酵母CEN.PK2-1C為 出發(fā)菌株。
[0010] 本發(fā)明要解決的第二個技術問題是提供構建所述釀酒酵母基因工程菌的的方法， 將序列如SEQ ID NO. 1的RoPYC基因和SEQ ID N0.2所示SpMAEl基因，分別在釀酒酵母ΜΡΔ Sdh2中過量表達，構建得到琥珀酸產量提高的釀酒酵母基因工程菌。所述蘋果酸脫氫酶基 因來源于米根霉，所述琥珀酸脫氫酶基因 SDH2的核苷酸序列如Gene ID: 1360234所示。所述 RoPYC基因以質粒pY5TEFl為表達載體，所述SpMAE 1基因以質粒pYX212為表達載體。
[0011] 所述釀酒酵母MPASdh2是以釀酒酵母為出發(fā)菌株，用蘋果酸脫氫酶基因替換了乙 醇代謝途徑中的丙酮酸脫羧酶基因 PDC1，在此基礎上，敲除了琥珀酸代謝途徑中的琥珀酸 脫氫酶基因 SDH2;所述蘋果酸脫氫酶基因來源于米根霉，所述琥珀酸脫氫酶基因 SDH2的核 苷酸序列如Gene ID: 1360234所示。
[0012] 本發(fā)明所要解決的第三個技術問題是提供一種應用所述釀酒酵母基因工程菌發(fā) 酵生產琥珀酸的方法。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法包括以下步驟:將30°C、220rpm下培養(yǎng)24h 的基因工程菌種子以5%的接種量轉入發(fā)酵培養(yǎng)基于30°C、220rpm條件下培養(yǎng)96h。
[0014] 種子培養(yǎng)基為Yro培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。
[0015] 發(fā)酵培養(yǎng)基：無氨基酵母氮源1.78凡、（順4)230458/1、葡萄糖2(^/1，添加碳酸鈣 5g/L。并添加96yg/L生物素。
[0016] 采用釀酒酵母CEN.PK2-1C為底盤微生物時，發(fā)酵培養(yǎng)基中還需添加亮氨酸100mg/ L、色氨酸20mg/L、組氨酸20mg/L、尿啼啶20mg/L。
[0017] 本發(fā)明用可積累琥珀酸且副產物乙醇減少的菌株ΜΡΔ Sdh2為出發(fā)菌株，通過過量 表達源于米根霉的丙酮酸羧化酶基因 RoPYC及源于粟酒裂殖酵母的蘋果酸轉運酶基因 SpMAEl，琥珀酸產量可積累琥珀酸0.72 ±0.02g/L，進一步引入SpMAEl后，琥珀酸產量略有 下降，但可積累丙酮酸8.31 ±0.41 g/L，較對照提高了55.04% ;在此基礎上，添加最適量的 生物素（16yg/L)，菌株ΜΡ Δ S+pY15TEFl-RoPYC琥珀酸產量達到1 · 29 ± 0 · 01g/L，較不添加時 提高了47·03%。而添加最適量的的生物素（96μg/L)，菌株MPΔS+pY15TEFl-RoPYC+pYX212-SpMAEl可積累琥珀酸2.66±0.03g/L，較不添加生物素時提高了211.70%。本發(fā)明為提高琥 珀酸積累提供了一個有效的方法，為構建工程酵母高效生產琥珀酸創(chuàng)造了條件，具有很好 的工業(yè)應用價值和前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1重組質粒pYX212-SpMAEl的構建。
[0019] 圖2轉運蛋白SpMAEl的過量表達對琥珀酸發(fā)酵的影響。(a)琥珀酸；（b)丙酮酸。
[0020] 圖3生物素的添加對菌株MPAS+pY15TEFl-RoPYC琥珀酸發(fā)酵的影響。（a)菌體生 長；（b)琥珀酸；（c)丙酮酸；（d)副產物乙醇。
[0021] 圖4生物素的添加對菌株ΜΡ Δ S+pY15TEFl-RoPYC+pYX212-SpMAEl琥珀酸發(fā)酵的影 響。(a)菌體生長;（b)葡萄糖利用；（c)琥珀酸；（d)副產物丙酮酸。
[0022] 圖5 roci的替換表達敲除盒，大小為2724bp
[0023] 圖6 SDH2敲除盒，大小為1544bp。
【具體實施方式】
[0024]高效液相色譜測定乙醇、殘?zhí)呛康姆椒?發(fā)酵液中乙醇和殘?zhí)呛康臏y定采用 高效液相色譜儀(HPLC)檢測。發(fā)酵液經處理且上清液經0.22μπι微孔濾膜過濾后，利用RID (示差折光檢測器)進行檢測，液相色譜方法如下:色譜柱:BIO-RAD有機酸柱;柱溫:35°C ;流 動相：0.0275%(v/v)稀硫酸，經0.2 2μηι濾膜過濾并除氣；流速：0.6mL/mi η;檢測時間： 25min;進樣量：20yL。
[0025]生物量的測定方法(Bio-Rid核酸儀）：取一定量的菌懸液置于1.5mL EP中，加適量 的0.1M的稀鹽酸溶解菌懸液中的碳酸鈣并同時稀釋到合適倍數(shù)，渦旋混勻，用Bio-Rid核酸 儀，于600nm處比色測0D值。
[0026] 琥珀酸、丙酮酸的測定方法(HPLC法）：將每個時間點的發(fā)酵液12000rpm離心2min， 取上清500yL，用三氯乙酸等倍處理，于4°C放置3h以上，沉降蛋白。然后用0.22μπι的親水膜 過濾后，得到的樣品進行HPLC分析。高效液相色譜儀為美國Waters公司產品，型號為1515， 色譜柱為Aminex HPX-87H column(Bio-Rad)。乙醇用RID檢測器。
[0027]種子培養(yǎng)基組成:葡萄糖2%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，去離子水定容，pH自然， 高壓滅菌（115°C，20min)。
[0028] 發(fā)酵培養(yǎng)基組成:無氨基酵母氮源3.4g/L，硫酸銨5g/L，葡萄糖40g/L，按要求分別 添加亮氨酸l〇〇mg/L、色氨酸20mg/L、組氨酸20mg/L、尿啼啶20mg/L。添加碳酸^Sg/L，裝液 量為40mL/250mL。并添加96yg/L生物素。
[0029] 實施例1琥珀酸產量提高的釀酒酵母工程菌的構建
[0030] 在可積累琥珀酸且副產物乙醇減少的菌株ΜΡ Δ Sdh2為出發(fā)菌株，通過過量表達源 于米根霉的丙酮酸羧化酶基因 RoPYC及源于粟酒裂殖酵母的蘋果酸轉運酶基因 SpMAEl。
[0031] 1、菌株和質粒
[0032]底盤微生物釀酒酵母（S·cerevisiae)CEN·PK2-lC購自歐洲EUR0SCARF(http:// web · uni-frankfurt · de/fbl5/mikro/euroscarf/data/cen · html)，其基因型為MATa; ura3_ 52; trpl-289; leu2-3，112 ;his3 Δ 1 ;MAL2-8G; SUC2。出發(fā)菌株ΜΡ Δ Sdh2，是在底盤微生物 中，通過將源于米根霉的蘋果酸脫氫酶基因 RoMDH替換丙酮酸脫氫酶基因 H)C1，并敲除琥珀 酸脫氫酶基因 SDH2而得到。質粒pY5TEFl參見Xu，G.Q.，Zou，W.，Chen，X.L.，et al.Fumaric acid production in Saccharomyces cerevisiae by in silico aided metabolic engineering.Plos 〇116,2012,7(12)，質粒卩￥}(212參見211&〇，}(.，2〇11，!1.{11，<1.，6七 al.Nitrogen regulation involved in the accumulation ofurea in Saccharomyces cerevisiae.Yeast,2013,30(11),437-447.〇 [0033] 2、質粒的構建
[0034]重組質粒pY15TEFl_RoPYC的構建方法參見文獻"Xu，G.Q.，Zou，W.，Chen，X.L.，et al.Fumaric acid production in Saccharomyces cerevisiae by in silico aided metabolic engineering.Plos 0ne，2012,7(12) ·"。重組質粒pYX212_SpMAEl的構建方法如 下：提取S.pombe的基因組，以引物EcoRI-F和SalI-R進行PCR擴增，獲得序列如SEQ ID NO. 2 所示，用酶進行雙酶切，然后與經同樣雙酶切的質粒PYX212進行連接，連接產物轉化感受態(tài) 大腸桿菌，并涂布到加有氨芐青霉素的LB平板，獲得的轉化子經菌落PCR驗證正確后(如圖 la所示）。進一步提取質粒，用酶進行雙酶切驗證，其核酸電泳圖（如圖lb所示）。所用到的引 物序列如表1:
[0035]表1.擴增基因 SpMAE 1所用到的引物
[0036]
[0037] 3、轉化
[0038] 用LiAc方法將重組質粒pY15TEFl-RoPYC和pYX212-SpMAEl轉化釀酒酵母工程菌MP Δ Sdh2中，涂布SD-Leu-Ura平板，得到的陽性轉化子提質粒進行酶切驗證，正確的轉化子保 菌，即為同時過量表達RoPYC和SpMAEl的工程菌。
[0039]實施例2發(fā)酵法產琥珀酸
[0040] 將30°C、220rpm下培養(yǎng)24h的基因工程菌種子以起始0D6Q() = 0.2的接種量轉入發(fā)酵 培養(yǎng)基于30°C、220rpm條件下培養(yǎng)96h，發(fā)酵開始時，添加96yg/L生物素。每隔一定的時間段 取樣測0D，同時取樣lmL離心保存用來測琥珀酸和乙醇等的含量。
[0041 ] 菌株ΜΡ Δ Sdh2可積累琥珀酸，基因 RoPYC引入后，可積累琥珀酸0.72 ± 0.02g/L，進 一步引入SpMAE 1后，琥珀酸產量略有下降，但可積累丙酮酸8.31 ± 0.41 g/L，較實施例3的重 組菌提高了55.04% ;在此基礎上，添加最適量的生物素（16yg/L)，菌株ΜΡ Δ S+pY15TEFl-RoPYC琥珀酸產量達到1.29±0.01 g/L，較不添加時提高了47.03%。而添加最適量的的生物 素（96yg/L)，菌株ΜΡ Δ S+pY15TEFl-RoPYC+pYX212-SpMAEl可積累琥珀酸2·66±0 ·03g/L，較 不添加生物素時提高了 211.70 %。
[0042] 實施例3低產乙醇及積累琥珀酸釀酒酵母工程菌的構建
[0043] 在野生型基礎上用源于米根霉的蘋果酸脫氫酶基因 RoMDH替換了丙酮酸脫羧酶基 因 roci。在此基礎上，敲除琥珀酸代謝途徑中的關鍵酶基因 SDH2。
[0044] 1、菌株和質粒
[0045] 釀酒酵母（S · cerevisiae)CEN. PK2-1C購自歐洲EUROSCARF(http://web·uni-frankfurt · de/fbl5/mikro/euroscarf/data/cen · html)，其基因型為MATa; ura3_52; trpl-289;leu2-3，112;his3A 1;MAL2-8G;SUC2。敲除盒模板 pUG27 質粒(包含 HIS3 標記基因 ）、Cre 表達質粒pSH47(用來標記回收）的構建方法參見文獻"Guldener U，Heck S，F(xiàn)ielder T，et al.A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast [J].Nucleic Acids Res，1996,24(13):2519_2524"*"GuoqiangXu，QiangHua，et al.Regulation of thiamine synthesis in Saccharomyces cerevisiae for improved pyruvate production·Yeast，2012，29:209-217" 〇
[0046] 2、基因敲除盒的構建
[0047] 以質粒ST+RoMDH+TDHt+HIS為模板，以MP-F、MP-R引物進行PCR擴增，獲得序列如 SEQ ID勵.11所示的用1^替換^)(：1的!115敲除盒，其部分序列與待敲除基因1^1編碼區(qū)上 下游同源的DNA片段，其核酸電泳圖如圖5泳道1和2所示。以質粒pUG27為模板，以SDH2-F、 SDH2-R引物進行PCR擴增，獲得SDH2的敲除盒，其核酸電泳圖如圖6泳道1所示。所用到的引 物序列如表2:
[0048] 表2.用RoMDH替換敲除H)C1基因及敲除SDH2所用到的引物
[0049]
[0050] 3、轉化
[00511用LiAc方法將PDC1替換敲除盒轉化釀酒酵母CEN.PK2-1C，涂布SD-HIS平板，得到 的陽性轉化子提基因組進行PCR驗證，正確的轉化子保菌，即為pdcl單基因缺失株CEN.PK2-1CMP。并用質粒pSH47將HIS標記去除。在此基礎上，將SDH2基因敲除盒轉化到釀酒酵母 CEN. PK2-1CMP，涂布SD-HIS平板，得到的陽性轉化子提基因組進行PCR驗證，正確的轉化子 保菌，即為sdh2基因缺失株。通過改造代謝途徑，得到可減少乙醇積累的釀酒酵母工程菌。 [0052] 將30°C、220rpm下培養(yǎng)24h的基因工程菌種子以起始0D6Q() = 0.2的接種量轉入發(fā)酵 培養(yǎng)基于30°C、220rpm條件下培養(yǎng)96h，每隔一定的時間段取樣測0D，同時取樣lmL離心保存 用來測乙醇和琥泊酸的產量。對照菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C在36h時積 累乙醇達13.55±1.0628/1，用1?〇10!1替換?0(：1后，乙醇產量下降到11.09±0.5398/1，較改 造前下降了 18.15%。在此基礎上，SDH2敲除后，琥珀酸產量達到0.698±0.0285g/L，而敲除 前，酵母菌株是不積累琥珀酸的。
[0053]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一株產琥珀酸的基因工程菌，其特征在于，以一株產琥珀酸且副產物乙醇減少的菌 株MPASdh2為出發(fā)菌株，過量表達源于米根霉的丙酮酸羧化酶基因 RoPYC及源于粟酒裂殖 酵母的蘋果酸轉運酶基因 SpMAEl。2. 根據(jù)權利要求1所述的一株產琥珀酸的基因工程菌，其特征在于，所述丙酮酸羧化酶 基因 RoPYC的序列如SEQ ID N0.1所示。3. 根據(jù)權利要求1所述的一株產琥珀酸的基因工程菌，其特征在于，所述蘋果酸轉運酶 基因 SpMAEl的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4. 根據(jù)權利要求1所述的一株產琥珀酸的基因工程菌，其特征在于，所述釀酒酵母ΜΡΔ Sdh2是以釀酒酵母為出發(fā)菌株，用蘋果酸脫氫酶基因替換了乙醇代謝途徑中的丙酮酸脫羧 酶基因 H)C1，并敲除了琥珀酸代謝途徑中的琥珀酸脫氫酶基因 SDH2;所述蘋果酸脫氫酶基 因來源于米根霉，所述琥珀酸脫氫酶基因 SDH2的核苷酸序列如Gene ID: 1360234所示。5. 根據(jù)權利要求4所述的一株產琥珀酸的基因工程菌，其特征在于，所述釀酒酵母為釀 酒酵母 CEN.PK2-1C。6. -種構建權利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，將序列如SEQ ID NO. 1的 RoPYC基因和SEQ ID NO. 2所示SpMAEl基因，分別在釀酒酵母ΜΡΔ Sdh2中過量表達，所述釀 酒酵母MPASdh2是以釀酒酵母為出發(fā)菌株，用蘋果酸脫氫酶基因替換了乙醇代謝途徑中的 丙酮酸脫羧酶基因 H)C1，并敲除了琥珀酸代謝途徑中的琥珀酸脫氫酶基因 SDH2。7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述蘋果酸脫氫酶基因來源于米根霉，所 述琥珀酸脫氫酶基因 SDH2的核苷酸序列如Gene ID: 1360234所示。8. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述RoPYC基因以質粒pY5TEFl為表達載 體，所述SpMAE 1基因以質粒pYX212為表達載體。9. 一種應用權利要求1所述基因工程菌生產琥珀酸的方法，其特征在于，將30°C、 220rpm下培養(yǎng)24h的基因工程菌種子以5%的接種量轉入發(fā)酵培養(yǎng)基于30°C、220rpm條件下 培養(yǎng)96h;發(fā)酵培養(yǎng)基：無氨基酵母氮源1.7g/L、（NH4)2S〇45g/L、葡萄糖20g/L，添加碳酸|丐 5g/L，生物素 96yg/L。10. 權利要求1-4任一所述基因工程菌在構建羧酸高產菌株中的應用。
【文檔編號】C12P7/46GK106085940SQ201610465898
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】徐國強, 蔣伶活, 李佳雨, 蘇珂, 劉維瑾, 范歐洋, 趙禎
【申請人】江南大學
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進琥珀酸積累的方法，屬于遺傳工程和發(fā)酵工程領域。本發(fā)明以可積累琥珀酸且副產物乙醇減少的菌株MPΔSdh2為出發(fā)菌株，通過過量表達源于米根霉的丙酮酸羧化酶基因RoPYC后，可積累琥珀酸0.72±0.02g/L，進一步引入SpMAE1后，琥珀酸產量略有下降，但可積累丙酮酸8.31±0.41g/L，較對照提高了55.04％；在此基礎上，而添加最適量的生物素(96μg/L)，菌株MPΔS+pY15TEF1?RoPYC+pYX212?SpMAE1可積累琥珀酸2.66±0.03g/L，較不添加生物素時提高了211.70％。本發(fā)明為提高琥珀酸積累提供了一個有效的方法，具有很好的工業(yè)應用價值和前景。
【專利說明】
_種促進號拍酸積累的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種促進琥珀酸積累的方法，屬于遺傳工程和發(fā)酵工程領域。
【背景技術】
[0002] 琥?白酸（succinic acid)是一種四碳二元酸，學名為丁二酸(butanedioic acid)。 琥珀酸具有30多種重要衍生物化學制品：四氫呋喃、1，4-丁二醇、γ-丁內酯、馬來酸和反丁 烯二酸等，具有巨大的市場空間。在食品行業(yè)，主要用作酸味劑、調味劑等;在醫(yī)藥行業(yè)，可 用于合成鎮(zhèn)靜劑、pH調節(jié)劑、避孕藥、抗癌藥物等;在化學行業(yè)，主要用作離子螯合劑、表面 活性劑、清潔劑添加劑、起泡劑和潤滑劑等。值得一提的是，琥珀酸作為生物可降解塑料聚 丁二酸丁二醇酯（可完全降解）的主要原料，具有廣泛的應用前景。鑒于上述琥珀酸的重要 應用價值及諸多優(yōu)勢，美國能源部于2004年專門成立了 1，4_二羧酸組，研究琥珀酸、蘋果酸 和延胡索酸的生產工藝和應用。
[0003] 目前，琥珀酸的生產方法主要有化學合成法和微生物發(fā)酵法。與化學合成法相比， 微生物發(fā)酵法具有很多優(yōu)勢：原料來源廣，成本低，可再生;反應條件溫和，能耗小，環(huán)境友 好。因此，微生物發(fā)酵法生產琥珀酸備受人們的關注，近年來，微生物法生產琥珀酸的研究 進展迅速。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作為一種真核模式微生物，因具有:遺傳 信息豐富，代謝改造操作方便;營養(yǎng)需求簡單，分離提取工藝成本低廉;在低pH條件下(甚至 pH〈3.0)生長良好;能夠耐受高濃度的底物;被FDA認證為GRAS(General RegardedAs Safe) 微生物，發(fā)酵產品具有安全性等優(yōu)點而成為發(fā)酵生產羧酸（乳酸、丙酮酸、蘋果酸、延胡索 酸、琥珀酸、酮戊二酸等）的潛在最適微生物。然而，利用釀酒酵母發(fā)酵生產琥珀酸面臨以 下問題：（1)在高濃度糖及通風的條件分批發(fā)酵產生大量的乙醇，對于以羧酸為目標產物來 說，乙醇的大量積累使得碳流大量的損失；（2)琥珀酸是TCA循環(huán)中的中間代謝產物，釀酒酵 母本身不具有過量積累琥珀酸的代謝途徑，需要構建琥珀酸的合成途徑，但琥珀酸有比較 高的還原勢，若通過TCA還原途徑積累琥珀酸，需要兩個還原氫，比較難積累；（3)實現(xiàn)減少 乙醇產生，丙酮酸得到積累后，如何使得丙酮酸進一步轉化為目標產物琥珀酸，需要增強丙 酮酸羧化反應，使之轉化為草酰乙酸，進入TCA循環(huán)，進而轉化為琥珀酸；（4)琥珀酸在胞內 過量合成時，需要及時將胞內的琥珀酸轉運到胞外，才能實現(xiàn)琥珀酸的高效生產。
【發(fā)明內容】
[0004] 本發(fā)明要解決的第一個技術問題是提供一種琥珀酸產量提高的釀酒酵母基因工 程菌，為代謝工程改造釀酒酵母高效生產琥珀酸打下基礎。
[0005] 所述基因工程菌是以一株產琥珀酸且副產物乙醇減少的菌株ΜΡΔ Sdh2為出發(fā)菌 株，過量表達源于米根霉的丙酮酸羧化酶基因 RoPYC及源于粟酒裂殖酵母的蘋果酸轉運酶 基因 SpMAEl。
[0006] 所述釀酒酵母ΜΡΔ Sdh2是以釀酒酵母為出發(fā)菌株，用蘋果酸脫氫酶基因替換了乙 醇代謝途徑中的丙酮酸脫羧酶基因 PDC1，在此基礎上，敲除了琥珀酸代謝途徑中的琥珀酸 脫氫酶基因 SDH2;所述蘋果酸脫氫酶基因來源于米根霉，所述琥珀酸脫氫酶基因 SDH2的核 苷酸序列如Gene ID: 1360234所示。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述丙酮酸羧化酶基因 RoPYC的序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述蘋果酸轉運酶基因 SpMAEl的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述釀酒酵母ΜΡΔ Sdh2是以釀酒酵母CEN.PK2-1C為 出發(fā)菌株。
[0010] 本發(fā)明要解決的第二個技術問題是提供構建所述釀酒酵母基因工程菌的的方法， 將序列如SEQ ID NO. 1的RoPYC基因和SEQ ID N0.2所示SpMAEl基因，分別在釀酒酵母ΜΡΔ Sdh2中過量表達，構建得到琥珀酸產量提高的釀酒酵母基因工程菌。所述蘋果酸脫氫酶基 因來源于米根霉，所述琥珀酸脫氫酶基因 SDH2的核苷酸序列如Gene ID: 1360234所示。所述 RoPYC基因以質粒pY5TEFl為表達載體，所述SpMAE 1基因以質粒pYX212為表達載體。
[0011] 所述釀酒酵母MPASdh2是以釀酒酵母為出發(fā)菌株，用蘋果酸脫氫酶基因替換了乙 醇代謝途徑中的丙酮酸脫羧酶基因 PDC1，在此基礎上，敲除了琥珀酸代謝途徑中的琥珀酸 脫氫酶基因 SDH2;所述蘋果酸脫氫酶基因來源于米根霉，所述琥珀酸脫氫酶基因 SDH2的核 苷酸序列如Gene ID: 1360234所示。
[0012] 本發(fā)明所要解決的第三個技術問題是提供一種應用所述釀酒酵母基因工程菌發(fā) 酵生產琥珀酸的方法。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法包括以下步驟:將30°C、220rpm下培養(yǎng)24h 的基因工程菌種子以5%的接種量轉入發(fā)酵培養(yǎng)基于30°C、220rpm條件下培養(yǎng)96h。
[0014] 種子培養(yǎng)基為Yro培養(yǎng)基:葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L。
[0015] 發(fā)酵培養(yǎng)基：無氨基酵母氮源1.78凡、（順4)230458/1、葡萄糖2(^/1，添加碳酸鈣 5g/L。并添加96yg/L生物素。
[0016] 采用釀酒酵母CEN.PK2-1C為底盤微生物時，發(fā)酵培養(yǎng)基中還需添加亮氨酸100mg/ L、色氨酸20mg/L、組氨酸20mg/L、尿啼啶20mg/L。
[0017] 本發(fā)明用可積累琥珀酸且副產物乙醇減少的菌株ΜΡΔ Sdh2為出發(fā)菌株，通過過量 表達源于米根霉的丙酮酸羧化酶基因 RoPYC及源于粟酒裂殖酵母的蘋果酸轉運酶基因 SpMAEl，琥珀酸產量可積累琥珀酸0.72 ±0.02g/L，進一步引入SpMAEl后，琥珀酸產量略有 下降，但可積累丙酮酸8.31 ±0.41 g/L，較對照提高了55.04% ;在此基礎上，添加最適量的 生物素（16yg/L)，菌株ΜΡ Δ S+pY15TEFl-RoPYC琥珀酸產量達到1 · 29 ± 0 · 01g/L，較不添加時 提高了47·03%。而添加最適量的的生物素（96μg/L)，菌株MPΔS+pY15TEFl-RoPYC+pYX212-SpMAEl可積累琥珀酸2.66±0.03g/L，較不添加生物素時提高了211.70%。本發(fā)明為提高琥 珀酸積累提供了一個有效的方法，為構建工程酵母高效生產琥珀酸創(chuàng)造了條件，具有很好 的工業(yè)應用價值和前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1重組質粒pYX212-SpMAEl的構建。
[0019] 圖2轉運蛋白SpMAEl的過量表達對琥珀酸發(fā)酵的影響。(a)琥珀酸；（b)丙酮酸。
[0020] 圖3生物素的添加對菌株MPAS+pY15TEFl-RoPYC琥珀酸發(fā)酵的影響。（a)菌體生 長；（b)琥珀酸；（c)丙酮酸；（d)副產物乙醇。
[0021] 圖4生物素的添加對菌株ΜΡ Δ S+pY15TEFl-RoPYC+pYX212-SpMAEl琥珀酸發(fā)酵的影 響。(a)菌體生長;（b)葡萄糖利用；（c)琥珀酸；（d)副產物丙酮酸。
[0022] 圖5 roci的替換表達敲除盒，大小為2724bp
[0023] 圖6 SDH2敲除盒，大小為1544bp。
【具體實施方式】
[0024]高效液相色譜測定乙醇、殘?zhí)呛康姆椒?發(fā)酵液中乙醇和殘?zhí)呛康臏y定采用 高效液相色譜儀(HPLC)檢測。發(fā)酵液經處理且上清液經0.22μπι微孔濾膜過濾后，利用RID (示差折光檢測器)進行檢測，液相色譜方法如下:色譜柱:BIO-RAD有機酸柱;柱溫:35°C ;流 動相：0.0275%(v/v)稀硫酸，經0.2 2μηι濾膜過濾并除氣；流速：0.6mL/mi η;檢測時間： 25min;進樣量：20yL。
[0025]生物量的測定方法(Bio-Rid核酸儀）：取一定量的菌懸液置于1.5mL EP中，加適量 的0.1M的稀鹽酸溶解菌懸液中的碳酸鈣并同時稀釋到合適倍數(shù)，渦旋混勻，用Bio-Rid核酸 儀，于600nm處比色測0D值。
[0026] 琥珀酸、丙酮酸的測定方法(HPLC法）：將每個時間點的發(fā)酵液12000rpm離心2min， 取上清500yL，用三氯乙酸等倍處理，于4°C放置3h以上，沉降蛋白。然后用0.22μπι的親水膜 過濾后，得到的樣品進行HPLC分析。高效液相色譜儀為美國Waters公司產品，型號為1515， 色譜柱為Aminex HPX-87H column(Bio-Rad)。乙醇用RID檢測器。
[0027]種子培養(yǎng)基組成:葡萄糖2%，酵母提取物1%，蛋白胨2%，去離子水定容，pH自然， 高壓滅菌（115°C，20min)。
[0028] 發(fā)酵培養(yǎng)基組成:無氨基酵母氮源3.4g/L，硫酸銨5g/L，葡萄糖40g/L，按要求分別 添加亮氨酸l〇〇mg/L、色氨酸20mg/L、組氨酸20mg/L、尿啼啶20mg/L。添加碳酸^Sg/L，裝液 量為40mL/250mL。并添加96yg/L生物素。
[0029] 實施例1琥珀酸產量提高的釀酒酵母工程菌的構建
[0030] 在可積累琥珀酸且副產物乙醇減少的菌株ΜΡ Δ Sdh2為出發(fā)菌株，通過過量表達源 于米根霉的丙酮酸羧化酶基因 RoPYC及源于粟酒裂殖酵母的蘋果酸轉運酶基因 SpMAEl。
[0031] 1、菌株和質粒
[0032]底盤微生物釀酒酵母（S·cerevisiae)CEN·PK2-lC購自歐洲EUR0SCARF(http:// web · uni-frankfurt · de/fbl5/mikro/euroscarf/data/cen · html)，其基因型為MATa; ura3_ 52; trpl-289; leu2-3，112 ;his3 Δ 1 ;MAL2-8G; SUC2。出發(fā)菌株ΜΡ Δ Sdh2，是在底盤微生物 中，通過將源于米根霉的蘋果酸脫氫酶基因 RoMDH替換丙酮酸脫氫酶基因 H)C1，并敲除琥珀 酸脫氫酶基因 SDH2而得到。質粒pY5TEFl參見Xu，G.Q.，Zou，W.，Chen，X.L.，et al.Fumaric acid production in Saccharomyces cerevisiae by in silico aided metabolic engineering.Plos 〇116,2012,7(12)，質粒卩￥}(212參見211&〇，}(.，2〇11，!1.{11，<1.，6七 al.Nitrogen regulation involved in the accumulation ofurea in Saccharomyces cerevisiae.Yeast,2013,30(11),437-447.〇 [0033] 2、質粒的構建
[0034]重組質粒pY15TEFl_RoPYC的構建方法參見文獻"Xu，G.Q.，Zou，W.，Chen，X.L.，et al.Fumaric acid production in Saccharomyces cerevisiae by in silico aided metabolic engineering.Plos 0ne，2012,7(12) ·"。重組質粒pYX212_SpMAEl的構建方法如 下：提取S.pombe的基因組，以引物EcoRI-F和SalI-R進行PCR擴增，獲得序列如SEQ ID NO. 2 所示，用酶進行雙酶切，然后與經同樣雙酶切的質粒PYX212進行連接，連接產物轉化感受態(tài) 大腸桿菌，并涂布到加有氨芐青霉素的LB平板，獲得的轉化子經菌落PCR驗證正確后(如圖 la所示）。進一步提取質粒，用酶進行雙酶切驗證，其核酸電泳圖（如圖lb所示）。所用到的引 物序列如表1:
[0035]表1.擴增基因 SpMAE 1所用到的引物
[0036]
[0037] 3、轉化
[0038] 用LiAc方法將重組質粒pY15TEFl-RoPYC和pYX212-SpMAEl轉化釀酒酵母工程菌MP Δ Sdh2中，涂布SD-Leu-Ura平板，得到的陽性轉化子提質粒進行酶切驗證，正確的轉化子保 菌，即為同時過量表達RoPYC和SpMAEl的工程菌。
[0039]實施例2發(fā)酵法產琥珀酸
[0040] 將30°C、220rpm下培養(yǎng)24h的基因工程菌種子以起始0D6Q() = 0.2的接種量轉入發(fā)酵 培養(yǎng)基于30°C、220rpm條件下培養(yǎng)96h，發(fā)酵開始時，添加96yg/L生物素。每隔一定的時間段 取樣測0D，同時取樣lmL離心保存用來測琥珀酸和乙醇等的含量。
[0041 ] 菌株ΜΡ Δ Sdh2可積累琥珀酸，基因 RoPYC引入后，可積累琥珀酸0.72 ± 0.02g/L，進 一步引入SpMAE 1后，琥珀酸產量略有下降，但可積累丙酮酸8.31 ± 0.41 g/L，較實施例3的重 組菌提高了55.04% ;在此基礎上，添加最適量的生物素（16yg/L)，菌株ΜΡ Δ S+pY15TEFl-RoPYC琥珀酸產量達到1.29±0.01 g/L，較不添加時提高了47.03%。而添加最適量的的生物 素（96yg/L)，菌株ΜΡ Δ S+pY15TEFl-RoPYC+pYX212-SpMAEl可積累琥珀酸2·66±0 ·03g/L，較 不添加生物素時提高了 211.70 %。
[0042] 實施例3低產乙醇及積累琥珀酸釀酒酵母工程菌的構建
[0043] 在野生型基礎上用源于米根霉的蘋果酸脫氫酶基因 RoMDH替換了丙酮酸脫羧酶基 因 roci。在此基礎上，敲除琥珀酸代謝途徑中的關鍵酶基因 SDH2。
[0044] 1、菌株和質粒
[0045] 釀酒酵母（S · cerevisiae)CEN. PK2-1C購自歐洲EUROSCARF(http://web·uni-frankfurt · de/fbl5/mikro/euroscarf/data/cen · html)，其基因型為MATa; ura3_52; trpl-289;leu2-3，112;his3A 1;MAL2-8G;SUC2。敲除盒模板 pUG27 質粒(包含 HIS3 標記基因 ）、Cre 表達質粒pSH47(用來標記回收）的構建方法參見文獻"Guldener U，Heck S，F(xiàn)ielder T，et al.A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast [J].Nucleic Acids Res，1996,24(13):2519_2524"*"GuoqiangXu，QiangHua，et al.Regulation of thiamine synthesis in Saccharomyces cerevisiae for improved pyruvate production·Yeast，2012，29:209-217" 〇
[0046] 2、基因敲除盒的構建
[0047] 以質粒ST+RoMDH+TDHt+HIS為模板，以MP-F、MP-R引物進行PCR擴增，獲得序列如 SEQ ID勵.11所示的用1^替換^)(：1的!115敲除盒，其部分序列與待敲除基因1^1編碼區(qū)上 下游同源的DNA片段，其核酸電泳圖如圖5泳道1和2所示。以質粒pUG27為模板，以SDH2-F、 SDH2-R引物進行PCR擴增，獲得SDH2的敲除盒，其核酸電泳圖如圖6泳道1所示。所用到的引 物序列如表2:
[0048] 表2.用RoMDH替換敲除H)C1基因及敲除SDH2所用到的引物
[0049]
[0050] 3、轉化
[00511用LiAc方法將PDC1替換敲除盒轉化釀酒酵母CEN.PK2-1C，涂布SD-HIS平板，得到 的陽性轉化子提基因組進行PCR驗證，正確的轉化子保菌，即為pdcl單基因缺失株CEN.PK2-1CMP。并用質粒pSH47將HIS標記去除。在此基礎上，將SDH2基因敲除盒轉化到釀酒酵母 CEN. PK2-1CMP，涂布SD-HIS平板，得到的陽性轉化子提基因組進行PCR驗證，正確的轉化子 保菌，即為sdh2基因缺失株。通過改造代謝途徑，得到可減少乙醇積累的釀酒酵母工程菌。 [0052] 將30°C、220rpm下培養(yǎng)24h的基因工程菌種子以起始0D6Q() = 0.2的接種量轉入發(fā)酵 培養(yǎng)基于30°C、220rpm條件下培養(yǎng)96h，每隔一定的時間段取樣測0D，同時取樣lmL離心保存 用來測乙醇和琥泊酸的產量。對照菌株Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1C在36h時積 累乙醇達13.55±1.0628/1，用1?〇10!1替換?0(：1后，乙醇產量下降到11.09±0.5398/1，較改 造前下降了 18.15%。在此基礎上，SDH2敲除后，琥珀酸產量達到0.698±0.0285g/L，而敲除 前，酵母菌株是不積累琥珀酸的。
[0053]雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范 圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一株產琥珀酸的基因工程菌，其特征在于，以一株產琥珀酸且副產物乙醇減少的菌 株MPASdh2為出發(fā)菌株，過量表達源于米根霉的丙酮酸羧化酶基因 RoPYC及源于粟酒裂殖 酵母的蘋果酸轉運酶基因 SpMAEl。2. 根據(jù)權利要求1所述的一株產琥珀酸的基因工程菌，其特征在于，所述丙酮酸羧化酶 基因 RoPYC的序列如SEQ ID N0.1所示。3. 根據(jù)權利要求1所述的一株產琥珀酸的基因工程菌，其特征在于，所述蘋果酸轉運酶 基因 SpMAEl的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。4. 根據(jù)權利要求1所述的一株產琥珀酸的基因工程菌，其特征在于，所述釀酒酵母ΜΡΔ Sdh2是以釀酒酵母為出發(fā)菌株，用蘋果酸脫氫酶基因替換了乙醇代謝途徑中的丙酮酸脫羧 酶基因 H)C1，并敲除了琥珀酸代謝途徑中的琥珀酸脫氫酶基因 SDH2;所述蘋果酸脫氫酶基 因來源于米根霉，所述琥珀酸脫氫酶基因 SDH2的核苷酸序列如Gene ID: 1360234所示。5. 根據(jù)權利要求4所述的一株產琥珀酸的基因工程菌，其特征在于，所述釀酒酵母為釀 酒酵母 CEN.PK2-1C。6. -種構建權利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，將序列如SEQ ID NO. 1的 RoPYC基因和SEQ ID NO. 2所示SpMAEl基因，分別在釀酒酵母ΜΡΔ Sdh2中過量表達，所述釀 酒酵母MPASdh2是以釀酒酵母為出發(fā)菌株，用蘋果酸脫氫酶基因替換了乙醇代謝途徑中的 丙酮酸脫羧酶基因 H)C1，并敲除了琥珀酸代謝途徑中的琥珀酸脫氫酶基因 SDH2。7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述蘋果酸脫氫酶基因來源于米根霉，所 述琥珀酸脫氫酶基因 SDH2的核苷酸序列如Gene ID: 1360234所示。8. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述RoPYC基因以質粒pY5TEFl為表達載 體，所述SpMAE 1基因以質粒pYX212為表達載體。9. 一種應用權利要求1所述基因工程菌生產琥珀酸的方法，其特征在于，將30°C、 220rpm下培養(yǎng)24h的基因工程菌種子以5%的接種量轉入發(fā)酵培養(yǎng)基于30°C、220rpm條件下 培養(yǎng)96h;發(fā)酵培養(yǎng)基：無氨基酵母氮源1.7g/L、（NH4)2S〇45g/L、葡萄糖20g/L，添加碳酸|丐 5g/L，生物素 96yg/L。10. 權利要求1-4任一所述基因工程菌在構建羧酸高產菌株中的應用。
【文檔編號】C12P7/46GK106085940SQ201610465898
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】徐國強, 蔣伶活, 李佳雨, 蘇珂, 劉維瑾, 范歐洋, 趙禎
【申請人】江南大學
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0訪客 來自[中國] 2023年05月05日 01:446
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