一種利用可見光照射獲取體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用可見光照射獲取體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層的方法。該方法首先在光敏材料表面實現(xiàn)細胞體外培養(yǎng)，體外培養(yǎng)結(jié)束后通過施加光場，材料表面發(fā)生光電轉(zhuǎn)變，實現(xiàn)細胞脫附，避免了傳統(tǒng)酶解法對細胞功能造成的損傷。本發(fā)明所利用的光敏材料為具有p/n結(jié)的光敏半導體片材或其薄膜。該方法利用可見光獲得的細胞片層保留了重要的細胞外基質(zhì)蛋白，如離子通道、連接蛋白等，細胞間可以更好地進行信號傳遞，保持功能的協(xié)調(diào)一致。大大提高了細胞的利用率和轉(zhuǎn)移細胞的活性。所述實驗方法流程簡單，實驗條件溫和，成本低，具有良好的可操作性，且便于推廣實施。
【專利說明】
一種利用可見光照射獲取體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層的方法
技術(shù)領域
[0001]本發(fā)明屬于組織工程領域，具體涉及一種利用可見光照射獲取體外培養(yǎng)的細胞/ 細胞薄層的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]近年來，由于現(xiàn)有組織工程方法的局限，細胞片層組織工程技術(shù)在組織修復及重建過程中，作為一種新的可構(gòu)建的類組織及類器官結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出巨大潛力。細胞片層最大的優(yōu)勢在于可以保存組織所必須的細胞表面蛋白、細胞外基質(zhì)環(huán)境及細胞間連接的完整。目前，細胞片層技術(shù)被用于治療食管癌，心臟、角膜、肝臟、牙周及泌尿系統(tǒng)疾病等，并表現(xiàn)出光明的前景。因此，如何以溫和的非侵入式的方法獲得完整的細胞片層對于細胞片層組織工程來說是關鍵問題。目前，大多數(shù)的細胞片層獲取都是采用溫敏系統(tǒng)，即通過降低溫度改變材料表面的親疏水性進而獲得細胞片層。但長時間的低溫在一定程度上會損傷細胞功能。近年來，一些其他的細胞收割方法也相繼被報道，包括電致、磁致、pH改變及紫外光致細胞脫附等。事實上，在這些脫附過程中，也伴隨著細胞質(zhì)蛋白分子的調(diào)節(jié)而影響細胞功能。 因此，更有效的及更易操縱的細胞收割方法對細胞片層技術(shù)的發(fā)展非常關鍵。
[0003]洪逸等采用光敏半導體二氧化鈦通過紫外光照改變材料表面的親疏水性成功獲得細胞片層(Yi Hong，Mengfei Yu，Wenjian Weng，et al.Light-1nduced cell detachment for cell sheet technology,B1materials,34(2013)11-18)。但是，紫外光對細胞存在一定的毒性并可能造成基因突變，故這種方法也存在一定缺陷。因此，利用可見光實現(xiàn)細胞脫附受到關注。
[0004]太陽能是人類取之不盡的清潔能源，傳統(tǒng)的太陽能電池材料即對可見光敏感，并可將其轉(zhuǎn)化為電能。選取對可見光響應的帶有p/n結(jié)的太陽能電池基板作為細胞培養(yǎng)表面， 通過可見光的強弱、p/n結(jié)的深度、表面粗糙度及細胞的種類等來調(diào)控光敏材料對可見光的響應及光電效應，研究可見光下材料與細胞或細胞與細胞之間的相互作用，對于細胞片層脫附、組織工程、細胞治療等的發(fā)展都有重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種利用可見光照射獲取體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層的方法，該方法利用具有p/n結(jié)的光敏半導體片材或其薄膜作為細胞培養(yǎng)表面，可以在可見光照射下高效溫和的獲取低損傷的完整細胞片層。
[0006]本發(fā)明利用可見光照射獲取體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層的方法，包括以下步驟:
[0007]a.將具有p/n結(jié)的光敏半導體片材或其薄膜以紫外光照或蒸氣消毒方式消毒；
[0008]b.將上述具有p/n結(jié)的光敏半導體片材或其薄膜作為體外細胞培養(yǎng)表面，在其表面以3 X 104?1 X 106個/cm2的密度種植細胞，加入細胞培養(yǎng)基，并放入37攝氏度恒溫及5% 二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1?1 〇天；
[0009]C.將經(jīng)上述培養(yǎng)后的培養(yǎng)表面移入PBS中，以波長為400?800納米、強度30?200mW/cm2的可見光照射上述光敏半導體片材或其薄膜1?20分鐘，即可使培養(yǎng)后的細胞或細胞薄層脫附。
[0010]上述技術(shù)方案中，所述的具有p/n結(jié)的光敏半導體片材或其薄膜，其中光敏半導體為P型或n型的單晶硅、多晶硅或者非晶硅，在其表面通過施主元素(磷或銻元素)擴散或受主元素(硼或銦元素)擴散形成有p/n結(jié)。所述p/n結(jié)的結(jié)深為0.3?2wii。
[0011]所述的具有P/n結(jié)的光敏半導體片材或其薄膜的表面通常為絨面，即具有金字塔結(jié)構(gòu)的粗糙表面。
[0012]所說的光敏半導體片材的厚度通常為100微米?1000微米。
[0013]所說的光敏半導體薄膜的厚度通常為300納米?20微米。
[0014]所述的光敏半導體片材表面的粗糙度為1?10微米。
[0015]所說的光敏半導體薄膜表面的粗糙度為100?500納米。
[0016]所述的細胞為在體外模擬生理環(huán)境下培養(yǎng)的貼壁細胞，包括成骨細胞、成纖維細胞、成肌細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞及干細胞。
[0017]本發(fā)明方法選擇在可見光照射下表面可發(fā)生光電轉(zhuǎn)變的含有p/n結(jié)的光敏半導體材料，在細胞培養(yǎng)過程中將其作為細胞培養(yǎng)表面，所培養(yǎng)的細胞在經(jīng)可見光照射后，培養(yǎng)表面發(fā)生光電轉(zhuǎn)變，細胞自發(fā)從培養(yǎng)器具表面脫離，實現(xiàn)細胞/細胞薄層的脫附。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0019]本發(fā)明方法避免了傳統(tǒng)酶解法對細胞功能造成的損傷，保留了重要的細胞外基質(zhì)蛋白，如離子通道、連接蛋白等，細胞間可以更好地進行信號傳遞，保持功能的協(xié)調(diào)一致，且大大提高了細胞的利用率和轉(zhuǎn)移細胞的活性。本發(fā)明具有高效的、低損傷、操作簡便并適用細胞范圍廣等特點，具有很強的實用性。本發(fā)明細胞培養(yǎng)表面所需的光敏材料成本低，易于實現(xiàn)，便于推廣應用。對于散在的細胞，本發(fā)明方法可使90%以上的細胞脫附；對于細胞薄層，則可使細胞薄層完整脫附?！靖綀D說明】
[0020]圖1為實施例1中培養(yǎng)細胞在可見光光照前的激光共聚焦圖。
[0021]圖2為實施例1中培養(yǎng)細胞在可見光光照后的激光共聚焦圖。[〇〇22]圖3為細胞脫附流程圖。
[0023]圖4為熒光顯微鏡獲得的細胞片層再迀移熒光圖片?！揪唧w實施方式】
[0024]下面結(jié)合實施例和附圖來詳細說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。
[0025]購買p型或n型的單晶、多晶及非晶硅片，經(jīng)過磷、硼、銦及銻元素擴散后，獲得含有結(jié)深為0.3?2WI1的p/n結(jié)，并以此片材或薄膜作為細胞培養(yǎng)表面，進行下列培養(yǎng)。片材的厚度為100微米?1000微米，粗糙度為1?10微米，薄膜的厚度為300納米?20微米，粗糙度為 100?500納米，片材或薄膜表面均呈絨面。
[0026]實施例1
[0027]在上述單晶硅基板表面(p/n結(jié)深0.3WH，磷擴散)，進行成骨細胞體外培養(yǎng)，接種密度為3X104個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，以波長為400?800納米、強度30mW/cm2的可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射20分鐘，即可使95 % 細胞從表面脫離。圖1和圖2分別為采用激光共聚焦顯微鏡所觀察到的實施例1中培養(yǎng)細胞在可見光照前、后的激光共聚焦顯微圖。對比圖1和圖2,可以看出經(jīng)可見光照射后大量細胞脫離，說明可見光實現(xiàn)單細胞的脫附。[〇〇28] 實施例2
[0029]在上述多晶硅基板表面(p/n結(jié)深0.5wn，磷擴散)，進行成骨細胞體外培養(yǎng)，接種密度為IX 105個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)培養(yǎng)5天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度50mW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射10 分鐘，即可使細胞片層從表面脫離。圖3為采用Nikon相機所觀察到的實施例2中培養(yǎng)細胞片層在可見光照前、后的照片?？梢钥闯鼋?jīng)可見光照射后整個細胞片層實現(xiàn)完整脫附。
[0030]實施例3
[0031]在上述非晶硅基板表面(p/n結(jié)深0.9WH，磷擴散)，進行成骨細胞體外培養(yǎng)，接種密度為5X105個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度70mW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射8分鐘， 即可使細胞片層從表面脫離。圖4為采用熒光顯微鏡所觀察到的實施例3中培養(yǎng)細胞片層在可見光照后脫附再培養(yǎng)2天后的迀移熒光圖片?？梢钥闯鼋?jīng)可見光脫附后的細胞片層重新再培養(yǎng)后，能夠很好的爬出新的細胞，并保持良好的細胞形態(tài)及活力，說明可見光脫附的細胞片層保持了良好的再迀移性能，這在組織工程中細胞片層的再應用是很關鍵的。
[0032]實施例4
[0033]在上述單晶硅基板表面(p/n結(jié)深lwii，硼擴散)，進行成骨細胞體外培養(yǎng)，接種密度為1 X 106個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度40mW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射15分鐘， 即可使細胞片層從表面完整脫離。
[0034]實施例5
[0035]在上述非晶硅基板表面(p/n結(jié)深2WH，硼擴散)，進行成骨細胞體外培養(yǎng)，接種密度為5 X104個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度lOOmW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射5分鐘，即可使細胞片層從表面完整脫離。
[0036]實施例6
[0037]在上述多晶硅基板表面(p/n結(jié)深2WH，硼擴散)，進行成骨細胞體外培養(yǎng)，接種密度為8X104個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度200mW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射1分鐘， 即可使細胞片層從表面完整脫離。
[0038]實施例7
[0039]在上述多晶硅基板表面(p/n結(jié)深lwii，銦擴散)，進行小鼠成纖維細胞體外培養(yǎng)，接種密度為IX 105個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度30mW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射6 分鐘，即可使細胞片層從表面完整脫離。
[0040]實施例8
[0041]在上述單晶硅基板表面(p/n結(jié)深2wii，銦擴散)，進行成肌細胞體外培養(yǎng)，接種密度為2X105個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度50mW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射12分鐘， 即可使細胞片層從表面完整脫離。
[0042]實施例9
[0043]在上述非晶硅基板表面(p/n結(jié)深lwii，銦擴散)，進行小鼠上皮細胞體外培養(yǎng)，接種密度為2X105個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度50mW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射3分鐘，即可使細胞片層從表面完整脫離。
[0044]實施例10
[0045]在上述非晶硅基板表面(p/n結(jié)深2wn，銻擴散)，進行大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)，接種密度為3 X104個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 天后，細胞形成膜片，以波長為400?800納米、強度lOOmW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射10分鐘，即可使細胞片層從表面完整脫離。
[0046]實施例11
[0047]在上述單晶硅基板表面(p/n結(jié)深2WH，銻擴散)，進行小鼠成纖維細胞體外培養(yǎng)，接種密度為5X104個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，以波長為400?800納米、強度30mW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射5分鐘，90 %細胞從基板表面脫離。
[0048]實施例12
[0049]在上述多晶硅基板表面(p/n結(jié)深2WH，銻擴散)，進行成肌細胞體外培養(yǎng)，接種密度為5X104個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，以波長為 400?800納米、強度50mW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射10分鐘，92 %的細胞從基板表面脫離。
[0050]實施例13
[0051]在上述單晶硅基板表面(p/n結(jié)深2WH，銦擴散)，進行小鼠上皮細胞體外培養(yǎng)，接種密度為5X104個/cm2,放入37攝氏度恒溫及5%二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，以波長為400?800納米、強度lOOmW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射10分鐘，96%的細胞從基板表面脫離。
[0052]實施例14
[0053]在上述非晶硅基板表面(p/n結(jié)深2wn，銻擴散)，進行大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)，接種密度為6 X 104個/cm2，放入37攝氏度恒溫及5 %二氧化碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，以波長為400?800納米、強度lOOmW/cm2可見光從細胞培養(yǎng)器皿頂部入射，照射20分鐘， 91 %的細胞從基板表面脫離。
【主權(quán)項】
1.一種利用可見光照射獲取體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層的方法，其特征在于，包括以下 步驟:a.將具有p/n結(jié)的光敏半導體片材或其薄膜以紫外光照或蒸氣消毒方式消毒；b.將上述具有p/n結(jié)的光敏半導體片材或其薄膜作為體外細胞培養(yǎng)表面，在其表面以3 X 104?1 X 106個/cm2的密度種植細胞，加入細胞培養(yǎng)基，并放入37攝氏度恒溫及5%二氧化 碳的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1?10天；c.將經(jīng)上述培養(yǎng)后的培養(yǎng)表面移入PBS中，以波長為400?800納米、強度30?200mW/cm2 的可見光照射上述光敏半導體片材或其薄膜1?20分鐘，即可使培養(yǎng)后的細胞或細胞薄層 脫附。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用可見光照射獲取體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層的方法，其特 征在于，所述的具有p/n結(jié)的光敏半導體片材或其薄膜，其中光敏半導體為p型或n型的單晶 娃、多晶娃或者非晶娃，在其表面通過施主元素擴散或受主元素擴散形成有p/n結(jié)。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用可見光照射獲取體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層的方法，其特 征在于，所述p/n結(jié)的結(jié)深為0 ? 3?2ym。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用可見光照射獲取體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層的方法，其特 征在于，所述的具有p/n結(jié)的光敏半導體片材或其薄膜的表面為絨面。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用可見光照射獲取體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層的方法，其特 征在于，所說的光敏半導體片材的厚度為100微米?1000微米。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用可見光照射獲取體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層的方法，其特 征在于，所說的光敏半導體薄膜的厚度為300納米?20微米。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用可見光照射獲取體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層的方法，其特 征在于，所述的光敏半導體片材表面的粗糙度為1?10微米。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用可見光照射獲取體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層的方法，其特 征在于，所述的光敏半導體薄膜表面的粗糙度為100?500納米。9.如權(quán)利要求1所述的利用可見光照射獲取體外培養(yǎng)的細胞/細胞薄層的方法，其特征 在于，所述的細胞為成骨細胞、成纖維細胞、成肌細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞或干細胞。
【文檔編號】C12N5/077GK106085948SQ201610429597
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】程逵, 王小召, 翁文劍
【申請人】浙江大學