一種用于pd研究的hsp70干擾穩(wěn)定細(xì)胞系及其建立方法
【專利摘要】一種用于PD研究的HSP70干擾穩(wěn)定細(xì)胞系及其建立方法本發(fā)明針對HSP70在PD疾病發(fā)生發(fā)展中的作用尚未完全清楚，需要多種研究方法進(jìn)一步明確的情況，通過構(gòu)建針對HSP70的RNA干擾慢病毒表達(dá)質(zhì)粒載體，建立干擾質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SH?SY5Y細(xì)胞系。本發(fā)明采用的技術(shù)方法:設(shè)計(jì)并合成多個(gè)針對hsp70基因的RNA干擾序列,并將其插入真核表達(dá)慢病毒載體，通過與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后進(jìn)行熒光定量PCR檢測目的基因表達(dá)水平，篩選出有效干擾質(zhì)粒；通過慢病毒感染法將該有效干擾質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至SH?SY5Y細(xì)胞系，通過攜帶的GFP熒光篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，熒光定量PCR檢測驗(yàn)證。該細(xì)胞系與親本細(xì)胞系相比具有類似的生長曲線。
【專利說明】一種用于PD研究的HSP70干擾穩(wěn)定細(xì)胞系及其建立方法
[0001 ]技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬基因及細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種HSP70 RNA干擾穩(wěn)定 細(xì)胞系及其建立方法。
[0002]
【背景技術(shù)】帕金森病(Parkinson DisSH-SY5Yse，PD)是一種椎體外系進(jìn)行性神 經(jīng)退化性疾病，病理學(xué)主要表現(xiàn)為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和紋狀體多巴胺能神經(jīng)纖維的數(shù)量 顯著下降。大量動物實(shí)驗(yàn)證明氧化應(yīng)激損傷對PD的發(fā)生起重要作用。免疫反應(yīng)在PD發(fā)生中 的作用也受到關(guān)注，ro中的免疫反應(yīng)是由沉積的α突觸核蛋白激活星形膠質(zhì)細(xì)胞來啟動的， 分泌的大量細(xì)胞因子、化學(xué)因子激活小膠質(zhì)細(xì)胞，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞會進(jìn)一步釋放大量神 經(jīng)炎癥介質(zhì)、趨化因子，最終使得神經(jīng)元損傷；同時(shí)活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞激活氧化應(yīng)激作用 最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。突觸核蛋白基因過表達(dá)或突變可引起α_突觸核蛋白的錯(cuò)誤折疊、 有毒蛋白寡聚體和多聚體的形成，使其結(jié)構(gòu)和功能障礙，從而啟動一系列級聯(lián)反應(yīng)致多巴 胺能系統(tǒng)損傷，最終導(dǎo)致帕金森病。研究認(rèn)為神經(jīng)保護(hù)劑可能是治療ro的一個(gè)新的有效途 徑，熱休克蛋白70(hsp70)作為分子伴侶家族中的一員，是一種重要的應(yīng)激蛋白，能與錯(cuò)誤 折疊的蛋白相互作用，阻止聚集物的形成，并且還有助于錯(cuò)誤折疊蛋白的降解，因此將其用 于PD的發(fā)病機(jī)制與疾病治療方面的研究，已有研究表明HSP70能減輕帕金森病細(xì)胞模型中 突觸核蛋白毒性的作用。RNA干擾技術(shù)可特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，已被用于廣 泛探索基因功能的研究領(lǐng)域。
[0003] SH-SY5Y細(xì)胞為人的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，常用于PD發(fā)病機(jī)制的研究。目前PD發(fā)病 機(jī)制的研究中，HSP70的作用尚不完全清楚，尚沒有采用HSP70 RNA干擾技術(shù)的研究方法。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明針對HSP70在PD疾病發(fā)生發(fā)展中的作用尚未完全清楚，需要多 種研究方法進(jìn)一步明確的情況，通過構(gòu)建針對HSP70的RNA干擾慢病毒表達(dá)質(zhì)粒載體，建立 干擾質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SH-SY5Y細(xì)胞系。本發(fā)明采用的技術(shù)方法:設(shè)計(jì)并合成多個(gè)針對hsp70 基因的RNA干擾序列，并將其插入真核表達(dá)慢病毒載體，通過與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后 進(jìn)行熒光定量PCR檢測目的基因表達(dá)水平，篩選出有效干擾質(zhì)粒;通過慢病毒感染法將該有 效干擾質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞系，通過攜帶的GFP熒光篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，熒光定 量PCR檢測驗(yàn)證。
【附圖說明】
[0005] 圖1.為本發(fā)明實(shí)施例1中不同HSP70 RNA干擾序列下的細(xì)胞HSP70表達(dá)水平比較。 其中橫坐標(biāo)為不同樣品（sample)，縱坐標(biāo)為hsp70 mRNA相對表達(dá)水平(relative amout)。
[0006] 圖2.為本發(fā)明實(shí)施例2中所采用的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0007] 圖3.為本發(fā)明實(shí)施例3中采用含HSP70 RNA干擾序列的慢病感染SH-SY5Y細(xì)胞熒光 檢測圖。
[0008] 圖4:慢病毒干擾重組質(zhì)粒的酶切電泳圖。
[0009] 圖5:SH-SY5Y-hsp70細(xì)胞系穩(wěn)定性分析。其中第1代和第30代分別指第1代和第30 代SH-SY5Y-hsp70細(xì)胞系，明場是指明場下細(xì)胞照片，焚光場是指熒光場下細(xì)胞照片。
[0010] 圖6:SH-SY5Y-hsp70細(xì)胞系與野生型SH-SY5Y細(xì)胞系生長曲線比較。其中橫坐標(biāo)為 細(xì)胞生長時(shí)間（培養(yǎng)時(shí)間），縱坐標(biāo)為450nm單波長條件下測定的光度吸收值(波長450nm)〇
[0011] 圖7:不同濃度DMS0對細(xì)胞活性的影響；其中橫坐標(biāo)為不同濃度DMS0(DMS0:濃 度），縱坐標(biāo)為450nm單波長條件下測定的光度吸收值(波長450nm)〇
【具體實(shí)施方式】
[0012]藥品與試劑:各種限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自NEB公司，膠回收試劑 盒、小量質(zhì)粒抽提試劑盒購自MN公司；轉(zhuǎn)染試劑M40為實(shí)驗(yàn)室自主制備;DMEM培養(yǎng)基，抗生 素，胰酶，D-PBS購自hyclone公司，胎牛血清購自GIBC0公司；CCK-8試劑盒購自Do j indo公 司；其他試劑均為進(jìn)口和國產(chǎn)分析純試劑。
[0013] 儀器:倒置熒光顯微鏡Ti，尼康公司。 本發(fā)明的高效表達(dá)細(xì)胞模型可穩(wěn)定表達(dá)干擾序列和綠色熒光蛋白，因此可以在熒光顯 微鏡下直接觀察。
[0014]實(shí)施案例1 HSP70干擾序列的設(shè)計(jì)和篩選 根據(jù)GenBank公布的HSP70基因 HSPA1A(序列號:NM_005345.5)設(shè)計(jì)4條干擾序列見表1: 表1.HSP70 RNA干擾序列
將4種干擾序列分別克隆至慢病毒質(zhì)粒載體中，重組表達(dá)質(zhì)粒酶切電泳圖見圖4。采用 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。293T細(xì)胞采用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1天消化293T細(xì)胞，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種至35mm培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng) 皿接種6 X 105個(gè)細(xì)胞;次日用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基分別配制鈣轉(zhuǎn)試劑和RNA干擾質(zhì)粒，每 84μ1培養(yǎng)基內(nèi)加入16μ1鈣轉(zhuǎn)試劑，每100μΙ培養(yǎng)基內(nèi)加入4yg質(zhì)粒，分別混勻后將鈣轉(zhuǎn)溶液 和質(zhì)粒溶液輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，逐滴加入培養(yǎng)皿內(nèi)，在37 °C，5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24h，更換新鮮的含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA。分別 取lyg RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，采用熒光定量PCR法檢測HSP70的表達(dá)水平，以beta-actin作為內(nèi) 參，熒光定量PCR所采用的引物探針序列見表2: 表2.hsp70和beta-actin弓物探針設(shè)計(jì)
采用2-ΔΔ?τ相對定量方法計(jì)算不同RNA干擾序列樣品的HSp7〇表達(dá)水平。篩選出表達(dá)水 平最低的RNA干擾序列。檢測結(jié)果(見圖1)表明S3序列的HSP70表達(dá)水平最低，說明S3序列的 RNA干擾效果最好，選該序列作為建立穩(wěn)定細(xì)胞系的干擾序列。
[0015]本發(fā)明中使用慢病毒表達(dá)載體prrl-CMV作為GFP的表達(dá)載體，制備方法使用現(xiàn)有 的公認(rèn)技術(shù)，其中GFP的CDNA序列為SEQ ID N0.1所示。
[0016]實(shí)施案例2 HSP70干擾慢病毒的包裝制備 在真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染和基因治療領(lǐng)域，病毒載體正越來越受到重視。目前常用的病毒載體 包括腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、皰疹病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等，其中逆轉(zhuǎn)錄病毒中 的慢病毒載體因其表達(dá)的穩(wěn)定性，包裝容量大以及能夠?qū)崿F(xiàn)多基因共感染等優(yōu)勢被廣泛使 用于科研中。慢病毒感染能夠?qū)⒛康幕蛘先爰?xì)胞的基因組，所以不用再培養(yǎng)基中加入 篩選壓力就能穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，大大簡化了實(shí)驗(yàn)過程，降低了成本。因此本發(fā)明使用慢病 毒包裝、感染的方法獲得最終的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。
[0017] 目前使用的慢病毒包裝體系是由HIV病毒的基因組改造而成的。使用最廣泛的為 第三代慢病毒，是一種三質(zhì)粒系統(tǒng)，能用于感染非分裂期的細(xì)胞。通過改造去除了不相關(guān)基 因序列，并使用異源的部分基因代替同源基因（如：envelope-coding質(zhì)粒）來增加其安全 性，同時(shí)對啟動子等序列進(jìn)行修飾改造提高了病毒滴度和轉(zhuǎn)染效率。最后通過改造得到了 自身失活型慢病毒載體(self-inactivation，SIN)有著較高的滴度，轉(zhuǎn)染效率和安全性。 而病毒獲得后除了能用于細(xì)胞的感染外，也能用于基因治療。
[0018] 本發(fā)明中以人腎上皮細(xì)胞(293T)為受體細(xì)胞進(jìn)行慢病毒的包裝。
[0019] 使用的包裝質(zhì)粒為 pMD2. G，pMD-PRRE 和 pRSV-REV。
[0020] 試驗(yàn)過程如下： (1)細(xì)胞培養(yǎng) 用含抗生素和10%血清的完全DMEM培養(yǎng)基接種細(xì)胞于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，細(xì)胞濃度為6 X 1〇5/孔。待細(xì)胞完全貼壁后，用轉(zhuǎn)染試劑M40進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
[0021] (2)轉(zhuǎn)染過程 DNA和轉(zhuǎn)染試劑混合物的配制 A溶液: 慢病毒干擾質(zhì)粒 i.7yg 包裝質(zhì)?；旌衔?1.8yg 無血清無抗生素 DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)充至100μΙ，震蕩混勻； Β溶液： 轉(zhuǎn)染試劑 16μ1 無血清無抗生素 DMEM培養(yǎng)基補(bǔ)充至100μΙ，輕柔混勻； 將Α液與Β液輕柔混勻，室溫靜置10min，將混合液加入到細(xì)胞中。37 °C，5% C02培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)，次日換為含血清含抗生素的DMEM培養(yǎng)基。
[0022] (3)慢病毒的收集和純化 收集轉(zhuǎn)染后第4天和第5天的細(xì)胞上清，將第四天和第五天收集的病毒液4000g，室溫離 心10min;離心后的病毒液經(jīng)0.45μηι濾膜過濾后轉(zhuǎn)入超濾管內(nèi)（ufc910024，MILLIP0RE)，常 溫，4000g，離心15min;收集病毒濃縮液，分裝，凍存于-80度。
[0023]采用熒光定量PCR絕對定量法檢測所制備病毒的滴度，以構(gòu)建的106~101()C〇pi eS 干擾質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2,檢測病毒的滴度為8.14X105vg/ml。
[0024] 實(shí)施例3含有HSP70干擾序列的SH-SY5Y穩(wěn)定細(xì)胞系的建立 試驗(yàn)過程如下： (1)細(xì)胞培養(yǎng) 用含抗生素和10%血清的完全DMEM培養(yǎng)基接種細(xì)胞于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，細(xì)胞濃度為6 X 1〇5/孔。待細(xì)胞完全貼壁后，用轉(zhuǎn)染試劑M40進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
[0025] (2)感染過程 慢病毒用完全DMEM培養(yǎng)基(含6μg/ml polybrene)稀釋至合適倍數(shù)后，加入到棄去上清 的SH-SY5Y細(xì)胞表面;慢病毒感染24h后，換用含抗生素和10%血清的完全DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培 養(yǎng)。
[0026] (3)細(xì)胞克隆化 取飼養(yǎng)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)小鼠脫白致死，75%酒精浸泡lOmin，無菌解剖，剪開腹部皮膚，不要損 傷腹膜，用注射器吸取6_8ml完全培養(yǎng)基，用鑷子夾起腹膜，進(jìn)針，注意不要戳到內(nèi)臟和脂 肪，進(jìn)針方位可以在腹部中間，避開腹部下方的脂肪。
[0027]反復(fù)吹打腹腔數(shù)次，期間用酒精棉球輕揉小鼠腹部，待吸出培養(yǎng)基變黃時(shí)將培養(yǎng) 基吸出，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)備用。（一只成年小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞可以滿足6-8塊96孔細(xì)胞培 養(yǎng)板的鋪板需要）。
[0028]取感染后SH-SY5Y細(xì)胞，消化，計(jì)數(shù)，每20ml培養(yǎng)基(含相應(yīng)濃度的飼養(yǎng)細(xì)胞)加入 150個(gè)細(xì)胞，分96孔板，200μ1/孔。
[0029] 細(xì)胞培養(yǎng)1天后觀察是否有污染，培養(yǎng)3-5天后計(jì)數(shù)細(xì)胞亞克隆數(shù)目，并做記錄。細(xì) 胞培養(yǎng)10天，選擇單克隆細(xì)胞孔在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，選擇發(fā)綠色熒光的細(xì)胞克隆進(jìn) 行消化和擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0030] 實(shí)施案例四陽性克隆細(xì)胞的篩選 由于外源基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞的染色體上，根據(jù)整合位點(diǎn)的隨機(jī)性，可能存在宿 主細(xì)胞狀態(tài)差、對信號分子反應(yīng)弱和目的基因表達(dá)穩(wěn)定性差等問題。因此將所有挑出的陽 性克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，進(jìn)行細(xì)胞生長曲線對比試驗(yàn)和GFP表達(dá)穩(wěn)定性分析。
[0031] 試驗(yàn)例一 GFP表達(dá)穩(wěn)定性分析 在本實(shí)驗(yàn)中共篩選得到了 4個(gè)陽性克隆。對這4個(gè)陽性克隆進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳 代培養(yǎng)試驗(yàn)方案:細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，棄去細(xì)胞上清，用D-PBS洗滌一遍，加入適量胰酶 進(jìn)行消化，倒置顯微鏡下觀察，待大部分細(xì)胞變?yōu)閳A形時(shí)使用有血清有抗生素的完全DMEM 培養(yǎng)基終止消化，吹下細(xì)胞，l〇〇〇rpm離心10分鐘，留1/4的細(xì)胞在原培養(yǎng)體系中繼續(xù)培養(yǎng)， 待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)重復(fù)上述操作。
[0032]每傳代5次，熒光顯微鏡下觀察熒光細(xì)胞的比例和細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，拍照記錄。結(jié) 果如圖5所示：SH-SY5Y-HSP70細(xì)胞系在第30代時(shí)其熒光率仍然保持100%，證明SH-SY5Y-HSP70細(xì)胞系具有良好的穩(wěn)定性。
[0033]試驗(yàn)例二本發(fā)明細(xì)胞模型與野生型細(xì)胞生長曲線比較 從上部試驗(yàn)篩選獲得的4株細(xì)胞中選擇細(xì)胞生長狀態(tài)最好的1株，對這株細(xì)胞與野生型 SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞數(shù)量達(dá)到一定規(guī)模時(shí)進(jìn)行生長曲線分析。生長曲線分析 試驗(yàn)方案:細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞消化和計(jì)數(shù)，按照1.5 X 103/孔的細(xì)胞密度鋪板 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，使用有血清有抗生素的完全DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每 孔200μ1，分別在24h，48h，72h，96h，120h和144h進(jìn)行細(xì)胞活力分析，具體步驟為:棄去細(xì)胞 上清，加入含10% CCK-8試劑的無血清無抗生素 DMEM培養(yǎng)基100μΙ，37°C，5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)孵 育2h后，取出細(xì)胞，在酶標(biāo)儀0D450條件下進(jìn)行讀數(shù)，對結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示:SH-SY5Y-HSP70細(xì)胞系與野生型SH-SY5Y細(xì)胞系相比其生長速度較低，但生長曲線趨勢一致，證 明SH-SY5Y-HSP70細(xì)胞系具有良好的生長活性。
[0034]試驗(yàn)例一和試驗(yàn)例二證明我們篩選獲得的細(xì)胞模型GFP穩(wěn)定性好，生長曲線與野 生型一致，是良好的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
[0035] 熒光定量PCR方法參照實(shí)施例1，檢測結(jié)果（見表3)表明SH-SY5Y-HSP70細(xì)胞系 HSP70表達(dá)水平只有對照組細(xì)胞的0.3%，說明細(xì)胞干擾成功。
[0036] 表3.RNA干擾細(xì)胞與對照細(xì)胞HSP70表達(dá)水平的比較
試驗(yàn)例五不同濃度DMS0對細(xì)胞活性的影響 ro治療藥物可能溶于DMS0。因此有必要檢測不同濃度DMS0對藥物篩選方法的影響。 [0037]細(xì)胞活性分析試驗(yàn)方案：細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞消化和計(jì)數(shù)，按照5 X 1〇3/孔的細(xì)胞密度鋪板96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每組設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，使用含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn) 行培養(yǎng)，每孔200μ1，次日加入含不同濃度DMS0的1% FBS的DMEM，加藥后72h時(shí)進(jìn)行細(xì)胞活力 分析，具體步驟為:棄去細(xì)胞上清，加入含10% CCK-8試劑的無血清無抗生素 DMEM培養(yǎng)基100 μL，37°C，5% C02培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2h后，取出細(xì)胞，在酶標(biāo)儀0D450條件下進(jìn)行讀數(shù)，對結(jié)果進(jìn) 行分析，結(jié)果如圖7所示:顯示不同濃度的DMS0對細(xì)胞增殖沒有顯著影響。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于PD研究的HSP70干擾穩(wěn)定細(xì)胞系SH-SY5Y，其特征在于采用 TGGAGGAGTTCAAGAGAAA 干擾序列構(gòu)建。2. 權(quán)利要求1所述的干擾序列的HSP70表達(dá)抑制率可達(dá)到99%以上。3. 權(quán)利要求1所述的干擾序列后面連接GFP基因，可通過檢測GFP熒光來檢測慢病毒感 染效果。4. 權(quán)利要求2所述的HSP70表達(dá)水平是通過熒光定量PCR相對定量方法檢測的。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于PD研究的HSP70干擾穩(wěn)定細(xì)胞系SH-SY5Y，其特征在于： 所述GFP基因序列為SEQ ID N0:1。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于PD研究的HSP70干擾穩(wěn)定細(xì)胞系SH-SY5Y，其特征在于： 設(shè)計(jì)并合成多個(gè)針對hsp70基因的RNA干擾序列，并將其插入真核表達(dá)慢病毒載體，通過與 包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后進(jìn)行熒光定量PCR檢測目的基因表達(dá)水平，篩選出有效干擾質(zhì) 粒;通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將該有效干擾質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞系，通過亞克隆操作和攜 帶的GFP熒光篩選獲得穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，熒光定量PCR檢測驗(yàn)證。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于研究的HSP70干擾穩(wěn)定細(xì)胞系SH-SY5Y，其特征在于與 親本細(xì)胞系相比具有類似的生長曲線。
【文檔編號】C12N5/10GK106085963SQ201610259046
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年4月25日 公開號201610259046.4, CN 106085963 A, CN 106085963A, CN 201610259046, CN-A-106085963, CN106085963 A, CN106085963A, CN201610259046, CN201610259046.4
【發(fā)明人】蔣明, 尹衍新, 蔣韻, 毛玉婷
【申請人】同濟(jì)大學(xué)蘇州研究院