表達(dá)雞細(xì)小病毒vp2蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法，所述的耐熱疫苗株分類命名為rTS?VP2/CPV，于2016年4月19日保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO:V201627。該疫苗株在感染動(dòng)物或細(xì)胞后，可高效表達(dá)雞細(xì)小病毒的VP2蛋白。該毒株可用于制備雞新城疫、細(xì)小病毒二聯(lián)耐熱活疫苗。CCTCC NO: V20162720160419
【專利說明】
表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白的重組新城 疫耐熱疫苗株及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)小病毒對(duì)家禽，特別是鴨、鵝等水禽危害較大。鵝細(xì)小病毒感染，俗稱鵝流感、小 鵝瘟，是一種侵害幼鵝和番鴨的高度接觸傳染性疾病，表現(xiàn)為急性、亞急性和慢性型，急性 型可引起10日齡內(nèi)的雛鵝100%死亡。在大規(guī)模飼養(yǎng)鵝和番鴨的國(guó)家，該病具有重要的經(jīng)濟(jì) 意義。種鵝免疫接種可打打降低本病的影響。滅活疫苗或致弱活疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生良好的免 疫反應(yīng)，目前已有鵝細(xì)小病毒和番鴨細(xì)小病毒二價(jià)疫苗。但是未見有雞細(xì)小病毒疫苗的研 究報(bào)道。
[0003] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，新型基因工程疫苗的研發(fā)不斷取得突破，其中 基于新城疫病毒載體的新型多聯(lián)活疫苗是研發(fā)熱點(diǎn)之一，許多病原的免疫原性基因已經(jīng)在 新城疫載體內(nèi)成功表達(dá)，并取得了較好的免疫保護(hù)效果，如傳染性法氏囊病毒的VP2蛋白、 H5亞型禽流感病毒的HA蛋白、狂犬病毒的G糖蛋白、嚴(yán)重急性呼吸綜合征病毒的CoV蛋白、人 類免疫缺陷病毒的Gag蛋白等。此類疫苗具有可誘導(dǎo)全身性免疫(體液免疫、細(xì)胞免疫和粘 膜免疫）、高雞胚生長(zhǎng)特性、生產(chǎn)成本低廉、免疫方式簡(jiǎn)便(飲水、氣霧、點(diǎn)眼/滴鼻等方式）、 安全(毒株間發(fā)生重組及毒力返強(qiáng)可能性極小)等優(yōu)點(diǎn)。但現(xiàn)有的新城疫病毒載體疫苗均是 以非耐熱型新城疫病毒為骨架構(gòu)建的。
[0004] 現(xiàn)有已經(jīng)上市的有鵝、番鴨細(xì)小病毒的滅活疫苗或活疫苗，但未見有雞細(xì)小病毒 的疫苗研究報(bào)道。
[0005] 因此，如何提供一種具有耐熱、穩(wěn)定性強(qiáng)、冷藏條件要求低的表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2 蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明進(jìn)行了深入研究，提供了一種表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2 蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株及制備方法。
[0007] 本發(fā)明一方面涉及一種表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株，其特 征在于所述的耐熱疫苗株分類命名為rTS-VP2/CPV，于2016年4月19日保藏于武漢大學(xué)中國(guó) 典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC N0:V201627。
[0008] 本發(fā)明另一方面還涉及表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株的制備 方法，其特征在于包括如下步驟：
[0009] 1.1雞細(xì)小病毒VP2基因的PCR擴(kuò)增
[0010] P C R擴(kuò)增雞細(xì)小病毒的V P 2基因，擴(kuò)增引物為：上游引物V -CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGCTGATGAAAATGA ACCAG-3'，下游引物5' -ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTAGTTGGTTCTGG GAGCC-3'，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收純化后，測(cè)定DNA濃度，待進(jìn)行克隆連接；
[0011] 1.2新城疫病毒耐熱載體片段的PCR擴(kuò)增
[0012] 以超長(zhǎng)片段PCR的方法獲得新城疫病毒載體序列，擴(kuò)增引物為：上游引物5Y-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGAC-3'，下游引物5' -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTGC-3'，擴(kuò)增模板為新城疫病毒耐熱株質(zhì)粒PTS09-C，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，測(cè)定其濃度，待 克隆連接；
[0013] 1.3重組質(zhì)粒pTS-VP2/CPV的克隆連接
[0014]采用In-fusion克隆連接技術(shù)，將純化好的VP2基因片段和耐熱載體片段進(jìn)行克隆 連接(連接序列為GCCATGGGTAACTTT和ATGGTGAGCAAGGGC)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞， 轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在LB平皿上培養(yǎng)16小時(shí)后挑單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，對(duì)菌液進(jìn)行VP2基因的PCR 鑒定，鑒定為陽性的菌液進(jìn)彳丁質(zhì)粒提??；
[0015] 1 · 4重組病毒rTS-VP2/CPV的拯救恢復(fù)
[0016] 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒PTS-VP2/CPV與三個(gè)分別表達(dá)NP、P和L蛋 白的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，反復(fù)凍融收獲細(xì)胞液，接種9-11日齡SPF 雞胚。接種后5天，收獲雞胚尿囊液，分離得到表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白的重組新城疫耐熱疫 苗株。
[0017] 本發(fā)明還涉及上述表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株在制備重組 病毒中的應(yīng)用。
[0018] 本發(fā)明還涉及上述表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株在制備雞細(xì) 小病毒、新城疫二聯(lián)耐熱活疫苗中的應(yīng)用。
[0019] 本申請(qǐng)公開了一種表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株，該疫苗株 具有顯著的耐熱特性，可極大降低對(duì)冷鏈系統(tǒng)的依賴，節(jié)省保存運(yùn)輸成本和提高疫苗熱穩(wěn) 定性。該毒株在感染動(dòng)物或細(xì)胞后，可高效表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白。該毒株可用于制備雞 細(xì)小病毒、新城疫二聯(lián)耐熱活疫苗。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白的重組耐熱新城疫病毒全長(zhǎng)質(zhì)粒的構(gòu)建示 意圖。其中rTS09-C為親本株的基因組結(jié)構(gòu)，rTS-VP2/CPV為在rTS09-C基因組中插入了 VP2 蛋白后的結(jié)構(gòu)，詳細(xì)標(biāo)注了插入序列的整體序列組成。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，以下所述，僅是對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施 例而已，并非對(duì)本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示 的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實(shí)施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明 的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以下實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改或等同變化，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 第一步、重組全長(zhǎng)質(zhì)粒pTS-VP2/CPV的構(gòu)建與鑒定
[0024] 1.1雞細(xì)小病毒VP2基因的PCR擴(kuò)增
[0025] P C R擴(kuò)增雞細(xì)小病毒的V P 2基因，擴(kuò)增引物為：上游引物V -CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGCTGATGAAAATGA ACCAG-3'，下游引物5' -ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTAGTTGGTTCTGG GAGCC-31下劃線部分為用于In-fusion克隆連接的互補(bǔ)序列）。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的 條帶約1.7kb，與預(yù)期的1711bp相符(VP2基因長(zhǎng)度為1620bp，分別在VP2基因前端和后端引 入了基因起始序列和基因終止序列，同時(shí)在VP2基因前端引入了Kozak序列）。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn) 行瓊脂糖凝膠回收純化后，測(cè)定DNA濃度，待進(jìn)行克隆連接。
[0026] 1.2新城疫病毒耐熱載體片段的PCR擴(kuò)增
[0027]以超長(zhǎng)片段PCR的方法獲得新城疫病毒載體序列，擴(kuò)增引物為：上游引物5Y-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGAC-3'，下游引物5' -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTGC-31下劃線部分為用于In-fusion克隆連接的互補(bǔ)序列）。擴(kuò)增模板為新城疫病毒耐熱株質(zhì) 粒PTS09-C。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶約18kb，與預(yù)期的17.8kb大小相符。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn) 行回收純化，測(cè)定其濃度，待克隆連接。
[0028] 1 · 3重組質(zhì)粒pTS-VP2/CPV的克隆連接
[0029]按照?qǐng)D1所示的方式，采用In-fusion克隆連接技術(shù)，將純化好的VP2基因片段和耐 熱載體片段進(jìn)行克隆連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在LB平皿上培養(yǎng) 16小時(shí)后挑單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。對(duì)菌液進(jìn)行VP2基因的PCR鑒定。鑒定為陽性的菌液進(jìn)行 質(zhì)粒提取，待酶切和測(cè)序鑒定。
[0030] 1 · 4重組質(zhì)粒PTS-VP2/CPV的酶切與測(cè)序鑒定
[0031]分別以BamHI和Mlul內(nèi)切酶對(duì)全長(zhǎng)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，均得到了與預(yù)期相符 的酶切圖譜。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒PTS-VP2/CPV送至測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表 明雞細(xì)小病毒的VP2基因插入到了新城疫病毒耐熱載體的P和Μ基因之間，且所有序列與預(yù) 期完全一致，重組質(zhì)粒PTS-VP2/CPV構(gòu)建成功。
[0032] 第二步、重組病毒rTS-VP2/CPV拯救恢復(fù)與鑒定 [0033] 2 · 1重組病毒rTS-VP2/CPV的拯救恢復(fù)
[0034]采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTS-VP2/CPV與三個(gè)分別表達(dá)NP、P和L蛋 白的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞(已預(yù)感染表達(dá)T7RNA聚合酶的痘苗病毒）。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)， 反復(fù)凍融收獲細(xì)胞液，接種9-11日齡SPF雞胚。接種后5天，收獲雞胚尿囊液，待進(jìn)行新城疫 病毒檢測(cè)。
[0035] 2.2重組病毒的血凝效價(jià)和熒光定量PCR檢測(cè)
[0036] 以血凝試驗(yàn)和熒光定量PCR的方法，對(duì)收獲雞胚尿囊液進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均為新城疫 陽性。初步表明重組病毒rTS-VP2/CPV拯救成功。
[0037] 2.3重組病毒VP2基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序
[0038] 應(yīng)用雞細(xì)小病毒的VP2基因的特異性擴(kuò)增引物，對(duì)重組病毒rTS-VP2/CPV的VP2基 因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定分析，得到1711bp長(zhǎng)的VP2基因序列（SEQ ID No. 1)，從5'到3'端，依次包含了P基因的部分非編碼區(qū)序列(UTR)、P基因的基因終止序 列(GE)、中間序列（IG)、VP2基因的基因起始序列(GS)、Kozak序列、VP2基因序列、VP2基因的 雙重終止密碼子、VP2基因的GE序列、IG序列、Μ基因的GS序列和Μ基因的UTR序列。與預(yù)期序 列100%-致。
[0039] 第三步、雞細(xì)小病毒VP2蛋白在重組病毒rTS-VP2/CPV中的表達(dá)驗(yàn)證
[0040] 3.1間接免疫熒光法檢測(cè)截VP2蛋白的表達(dá)
[0041 ] 將重組病毒rTS-VP2/CPV和rTS09-C(對(duì)照)分別以0.01M0I感染BHK-21細(xì)胞，24h后 進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)，一抗為NDV陽性雞血清或雞細(xì)小病毒陽性血清。檢測(cè)結(jié)果表明，重 組病毒rTS-VP2/CPV感染的細(xì)胞內(nèi)，使用NDV陽性雞血清或雞細(xì)小病毒陽性血清作為一抗時(shí) 均能檢測(cè)到綠色熒光，而rTS09-C株感染的細(xì)胞只在NDV陽性血清作用下檢測(cè)到熒光。
[0042] 3.2Western Blot法檢測(cè)VP2蛋白的表達(dá)
[0043] 將重組病毒rTS-VP2/CPV和rTS09-C(對(duì)照)分別以0.01M0I感染BHK-21細(xì)胞，24h后 收集細(xì)胞裂解液，以雞細(xì)小病毒陽性血清為一抗進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，在 60KDa附近出現(xiàn)一條明顯的目的條帶，與預(yù)期的60.78KDa大小相近。表明VP2蛋白在重組病 毒感染的細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)。
[0044] 第四步、重組病毒rTS-VP2/CPV的生物學(xué)特性鑒定
[0045] 4.1重組病毒的增殖特性測(cè)定
[0046] 為比較重組病毒rTS-VP2/CPV株與親本rTS09-C株的生長(zhǎng)增殖情況，將兩株病毒分 別以100TCID5q接種BHK-21細(xì)胞，接種后24h、48h、72h、96h取上清500μ1，測(cè)定病毒TCID 5q，繪 制病毒的生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明，重組病毒rTS-VP2/CPV株和親本rTS09-C株在BHK-21細(xì)胞的 生長(zhǎng)曲線相似，增殖滴度相近，約為10 7· WciDso/ml。
[0047] 4.2重組病毒的致病性測(cè)定
[0048] 測(cè)定重組病毒對(duì)雞胚的最小致死劑量的平均致死時(shí)間（MDT/MLD)，結(jié)果顯示不同 稀釋度（ΠΓ1至ΠΓ9)的病毒接種雞胚后的120h內(nèi)均不會(huì)對(duì)雞胚致死，重組病毒rTS-VP2/CPV 的MDT/MLD大于120h，表明重組病毒保持了親本株的低毒特性，外源基因的插入并未改變重 組病毒的致病性。
[0049] 4.3重組病毒的耐熱特性測(cè)定
[0050] 測(cè)定重組病毒在56 °C環(huán)境下的HA耐熱特性，同時(shí)設(shè)置非耐熱株LaSota株和耐熱株 rTS09-C株為對(duì)照。如表1所示，非耐熱株LaSota在56°C耐熱處理9min后，HA效價(jià)降為0,親本 株rTS09-C和重組病毒rTS-VP2/CPV在56°C耐熱處理150min后仍具有血凝活性。表明重組病 毒rTS-VP2/CPV的耐熱特性與親本株一致，均為耐熱株。（該病毒株已經(jīng)保藏，保藏在武漢大 學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO: V201627)。
[0051 ]表1.重組病毒的HA耐熱特性測(cè)定結(jié)果
[0052]
[0053] a表示病毒具有血凝活性，|3表示病毒沒有血凝活性
[0054] 以上所述實(shí)施例只是本發(fā)明的較佳實(shí)例，而沒有限制本發(fā)明的實(shí)施范圍。因此，凡 是根據(jù)本
【發(fā)明內(nèi)容】
的實(shí)質(zhì)所作出的等效修改，都應(yīng)屬于在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株，其特征在于所述的耐熱疫苗株 分類命名為rTS-VP2/CPV，于2016年4月19日保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保 藏號(hào)為CCTCC N0:V201627。2. 表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株的制備方法，其特征在于包括如 下步驟： 1.1雞細(xì)小病毒VP2基因的PCR擴(kuò)增 P C R擴(kuò)增雞細(xì)小病毒的V P 2基因，擴(kuò)增引物為：上游引物5 7 -CAGCTATATTAAGGATTAAGAAAAAATACGGGTAGAAAGCTTGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGCTGATGAAAATGA ACCAG-3'，下游引物5' -ATCGGGGCACTCCGATTCTACCCGTATTTTTTCTTAATTATTATTAGTTGGTTCTGG GAGCC-3'，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收純化后，測(cè)定DNA濃度，待進(jìn)行克隆連接； 1.2新城疫病毒耐熱載體片段的PCR擴(kuò)增 以超長(zhǎng)片段PCR的方法獲得新城疫病毒載體序列，擴(kuò)增引物為：上游引物5'-TCGGAGTGCCCCGATTGTGCCAAGATGGAC-3'，下游引物5' -TCCTTAATATAGCTGAATTGATTGCAGCTGC-3'，擴(kuò)增模板為新城疫病毒耐熱株質(zhì)粒PTS09-C，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，測(cè)定其濃度，待 克隆連接； 1.3重組質(zhì)粒pTS-VP2/CPV的克隆連接 采用In-fusion克隆連接技術(shù)，將純化好的VP2基因片段和耐熱載體片段進(jìn)行克隆連 接，連接序列為GCCATGGGTAACTTT和ATGGTGAGCAAGGGC，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化 后的細(xì)胞在LB平皿上培養(yǎng)16小時(shí)后挑單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，對(duì)菌液進(jìn)行VP2基因的PCR鑒 定，鑒定為陽性的菌液進(jìn)彳丁質(zhì)粒提?。? 1.4重組病毒rTS-VP2/CPV的拯救恢復(fù) 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將已構(gòu)建的重組質(zhì)粒PTS-VP2/CPV與三個(gè)分別表達(dá)NP、P和L蛋白的 輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)，反復(fù)凍融收獲細(xì)胞液，接種9-11日齡SPF雞胚。 接種后5天，收獲雞胚尿囊液，分離得到表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株。3. 權(quán)利要求1所述的表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株在制備重組病 毒中的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1所述的表達(dá)雞細(xì)小病毒VP2蛋白的重組新城疫耐熱疫苗株在制備雞細(xì)小 病毒、新城疫二聯(lián)耐熱活疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P31/14GK106085971SQ201610428715
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月15日
【發(fā)明人】邵華斌, 溫國(guó)元, 羅青平, 羅玲, 王紅琳, 張騰飛, 汪宏才, 張蓉蓉, 盧琴, 艾地云
【申請(qǐng)人】湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所