雙鏈dna酶、其編碼核苷酸及該酶的制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種堪察加擬石蟹來(lái)源的雙鏈DNA酶及其制備方法，包括表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建，表達(dá)菌株構(gòu)建，蛋白表達(dá)和純化方法以及雙鏈DNA酶活性測(cè)定方法。編碼該雙鏈DNA酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明中公開(kāi)的雙鏈DNA酶可用于RT?PCR技術(shù)中，特異性地去除雙鏈DNA模板，在生物技術(shù)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】
雙鏈DNA酶、其編碼核苷酸及該酶的制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種雙鏈DNA酶、其編碼核苷酸及該酶的制備 方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 逆轉(zhuǎn)錄PCR或者稱為反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR，RT_PCR)，是聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再 以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。由一條RNA單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)稱作"逆轉(zhuǎn)錄"，由 依賴RNA的DNA聚合酶(逆轉(zhuǎn)錄酶)來(lái)完成。隨后，DNA的另一條鏈通過(guò)脫氧核苷酸引物和依賴 DNA的DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶Η降解，留下 互補(bǔ)DNA。
[0003] RT-PCR的指數(shù)擴(kuò)增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測(cè)很低拷貝數(shù)的RNAdRT-PCR廣泛 應(yīng)用于遺傳病的診斷，檢測(cè)基因表達(dá)的方法，并且可以用于定量監(jiān)測(cè)某種RNA的含量。real-time PCR(實(shí)時(shí)熒光PCR)技術(shù)也被用來(lái)做定量分析，它們比普通PCR進(jìn)行定量分析時(shí)靈敏度 更高，定量更精確。RT-PCR檢測(cè)的關(guān)鍵步驟是反轉(zhuǎn)錄后的cDNA模板中不應(yīng)含有雙鏈DNA污 染，因此需要有一種特異性酶解雙鏈DNA的酶，此酶不降解單鏈cDNA。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決RT-PCR檢測(cè)cDNA模板中有可能污染的基因組DNA的問(wèn)題，本發(fā)明提供了 一種具有特異性的雙鏈DNA酶及其應(yīng)用，具體通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0005] 本發(fā)明提供了一種編碼雙鏈DNA酶的核苷酸，核苷酸的序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 本發(fā)明還提供了一種表達(dá)雙鏈DNA酶的重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒包含如SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。
[0007] 進(jìn)一步地，上述重組質(zhì)粒的融合蛋白表達(dá)載體為pET28a-NusA-TEV。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其特征在于，該轉(zhuǎn)化體包含如SEQ ID NO. 1 所示的核苷酸序列。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種雙鏈DNA酶，該雙鏈DNA酶包含由如SEQ ID NO. 1所示的核苷 酸序列編碼的氨基酸序列。
[0010]本發(fā)明還提供了上述雙鏈DNA酶的制備方法，包括以下步驟：
[0011]步驟1、人工合成如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，并在該核苷酸序列的5'端和 3'端分別設(shè)置限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將得到的核苷酸序列克隆至融合蛋白表達(dá)載體，測(cè)序，得 到包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的質(zhì)粒；
[0012] 步驟2、將步驟1中得到的所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株，進(jìn)行蛋白表達(dá)，并使用rTEV酶 酶解該蛋白，按照1U rTEV酶加入3ug NusA-dsDNase蛋白比例，在lXrTEV Buffer(50mM Tris，pH8.0,0.5mM EDTA，lmM DTT)中3(TC酶解lh。
[0013] 使用肝素柱和鎳柱純化酶解得到的蛋白。
[0014] 進(jìn)一步地，上述步驟1中，設(shè)置在所述5'端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為EcoR I，設(shè)置在 所述3 '端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為Xho I。
[0015] 進(jìn)一步地，上述步驟2中，表達(dá)菌株為大腸桿菌表達(dá)菌株Rosseta(DE3)。
[0016]優(yōu)選地，該雙鏈DNase的制備方法包括以下步驟：
[0017] 步驟1、人工合成SEQ ID NO. 1序列，并在該序列的5'端和3'端分別設(shè)置限制性內(nèi) 切酶位點(diǎn)EcoR I和Xho I，將得到的DNA序列克隆至蛋白表達(dá)載體pET28a-NusA-TEV，測(cè)序， 得到包含該SEQ ID N0.1 序列的質(zhì)粒pET28a-NusA-TEV-dsDNase;
[0018] 步驟2、將步驟1中得到的質(zhì)粒pET28a-NusA-TEV-dsDNase轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌 株R〇SSeta(DE3)，進(jìn)行蛋白表達(dá)，并使用rTEV酶酶解該蛋白，使用肝素柱和鎳柱純化蛋白。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種特異性酶解雙鏈DNA的試劑盒，該試劑盒包括上述雙鏈DNA酶 和酶解反應(yīng)緩沖液。
[0020] 最后，本發(fā)明還提供了上述試劑盒在PCR技術(shù)中的應(yīng)用以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明 作進(jìn)一步說(shuō)明，以充分說(shuō)明本發(fā)明的目的、技術(shù)特征和技術(shù)效果。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1示出了本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中制備的雙鏈DNA酶的活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其 中：
[0022] l-2ug pUC19質(zhì)粒DNA加入5U雙鏈DNA酶37°C酶解30min
[0023] 2_2ug pUC19質(zhì)粒DNA
[0024] 3-0.5呢〇)(174單鏈0嫩加入51]雙鏈0嫩酶37°(：酶解301^11
[0025] 4-〇.5ug〇X174 單鏈 DNA
[0026] 5-lug 293總RNA加入5U雙鏈DNA酶37°C酶解30min
[0027] 6-lug 293總RNA。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的描述。以下的實(shí)施例是對(duì) 本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。
[0029] 1、雙鏈DNA酶人工基因合成
[0030] 雙鏈DNA酶具體的DNA序列如下（SEQ ID N0.1):
[0031] ATGGCCAACATGGAGTCCAAGCAAGGAATAATGGTTTTGGGATTCTTAATTGTCCTCCTCTTCGTGTCT GTCAATGGCCAGGACTGTGTGTGGGACAAGGACACGGACTTTCCCGAGGACCCGCCACTCATTTTCGATTCAAACTT GGAGCTCATCAGACCCGTCTTGGAAAATGGCAAAAGGATCGTCAGTGTCCCCAGTGGCAGCAGCTTAACCTTGGCCT GCTCTGGGTCTGAACTGATCAACCTGGGCATGGAGGCGGTGGAAGCCAAGTGTGCTGGGGGAGTCATGCTTGCCATA GAAGGAACGGAGTGGGAGATCTGGAGCCTGGGGTGCAGCAACCACGTGAAGGAGACCATCCGCCGCAACCTTGGAAC ATGTGGGGAAGCGGACCAGGGGGATAGGCACAGTATTGGCTTCGAGTACTACGGTGGCTCCATCTATTATGAACTGA TCAGCGTGTGTTTCGGGCCCGTGTCCGAAACAACCTTGCGCACCGAGCATGTCCTCCACGGCGCCAACATTGCCGCC AAGGACATCGAGACCTCCCGCCCCTCCTTCAAGACCTCCACCGGGTTCTTCAGCGTCTCCATGTCCACCGTCTACAG CCAGGCGTCACAGCTGCAGTTAATGACAGACATATTGGGAGATTCGGATCTAGCCAACAACATCATCGACCCCTCCC AACAGTTGTACTTCGCCAAAGGTCACATGTCTCCTGACGCAGACTTTGTGACGGTGGCAGAACAGGACGCCACCTAC TACTTCATCAACGCCCTACCGCAGTGGCAGGCCTTCAATAATGGCAACTGGAAGTACCTAGAATACGCGACCCGAGA CCTGGCCGAATCCCACGGTAGCGACCTGCGAGTGTATAGCGGAGGGTGGAGCCTGCTGCAGCTAGATGATATTAACG GCAACCCCGTGGACATCCTGCTGGGACTGTCTGAGGGCAAGGAGGTCGTGCCCGTTCCATCCCTCACTTGGAAGGTG GTTTACGAAGAGAGCAGCAGCAAAGCGGCCGCGATCGTCGGTATCAACAACCCTCACATCACCACCGCCCCCTCCCC CTTGTGTTCCGACCTGTGCTCCTCCTTGACCTGGATAGACTTCAACCTGGACGACCTGGCTCACGGGTACACCTACT GTTGTGCCGTAGATGACCTCCGGCAGGCCATACCCTATATCCCGGACCTGGGCAATGTCGGACTCCTCACTAAC
[0032] 將編碼上述雙鏈DNA酶的核苷酸序列通過(guò)人工基因合成的方法合成，并在此核苷 酸序列5 '端加上E c 〇 R I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)G A A T T C，3 '端加上Xh ο I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) CTCGAG，通過(guò)EcoR I和Xho I雙酶切、割膠回收、T4連接酶連接克隆至蛋白表達(dá)載體pET28a-NusA-TEV。雙鏈DNA酶完整編碼區(qū)為1221bp，共含有407個(gè)氨基酸，表達(dá)蛋白的理論分子量為 44539Da.
[0033] 2、雙鏈DNA酶蛋白的表達(dá)與純化
[0034]將測(cè)序正確的雙鏈DNA酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株R〇SSeta(DE3)，挑取單菌 落接種至50ml LB液體培養(yǎng)基，加入卡那霉素終濃度50ug/ml和氯霉素34ug/ml雙抗性篩選， 37°C，200rpm培養(yǎng)過(guò)夜。第二天按照2:100比例轉(zhuǎn)接至250ml LB液體培養(yǎng)基，加入卡那霉素 終濃度50ug/ml和氯霉素34ug/ml雙抗性篩選，共轉(zhuǎn)接4瓶，37°C，200rpm培養(yǎng)至菌液0D600檢 測(cè)數(shù)值為〇. 8時(shí)加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D硫代半乳糖苷使其終濃度為0.1-0.5mM，誘導(dǎo)培養(yǎng)4h 后，4°C7000rpm離心收集菌體。將此菌體按照每克加入40ml的比例懸浮于20mM Tris. Cl， pH8.0，300mM NaCl，10 %Glycero 1裂解緩沖液，超聲前加入終濃度ImM苯甲基磺酰氟，超聲 波破碎儀進(jìn)行菌體破碎。超聲裂解條件為超聲3秒間隔5秒，30 %超聲功率，超聲15min。當(dāng)菌 液變得清亮?xí)r離心收集上清液，取樣進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，并采用鎳柱純化雙鏈 DNA酶蛋白，用rTEV酶酶解純化的雙鏈DNA酶蛋白，按照1U rTEV酶加入3ug NusA-dsDNase蛋 白比例，在lXrTEV Buffer(50mM Tris，pH8.0,0.5mM EDTA，lmM DTT)中30°C酶解lh。再用 肝素柱進(jìn)行純化，具體純化操作步驟參照肝素柱和Ni NTA Beads 6FF說(shuō)明書進(jìn)行，獲得純 度約95 %的雙鏈DNA酶蛋白。
[0035] 3、雙鏈DNA酶活性測(cè)定
[0036] 將純化后的雙鏈DNA酶分別與雙鏈DNA(pUC 19質(zhì)粒DNA)、單鏈DNA( Φ X174單鏈 DNA)、RNA(293總RNA)在20mM Tris.Cl，pH8.0,5mM MgCl2反應(yīng)體系中進(jìn)行酶切反應(yīng)，37°C溫 育30min。結(jié)果顯示雙鏈DNA酶能夠很好酶解雙鏈DNA，對(duì)單鏈DNA和RNA沒(méi)有酶解，如附圖1所 不。
[0037]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無(wú)需創(chuàng) 造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員 依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過(guò)邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù) 方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種編碼雙鏈DNA酶的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO. 1所示。2. -種表達(dá)雙鏈DNA酶的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒包含如SEQ ID NO. 1所 示的核苷酸序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒的融合蛋白表達(dá)載體為 pET28a-NusA-TEV。4. 一種重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述重組表達(dá)轉(zhuǎn)化體包含如SEQ ID NO. 1所示的 核苷酸序列。5. -種雙鏈DNA酶，其特征在于，所述雙鏈DNA酶包含由如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序 列編碼的氨基酸序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的雙鏈DNA酶的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下 步驟： 步驟1、人工合成如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，并在所述核苷酸序列的5'端和3' 端分別設(shè)置限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將得到的核苷酸序列克隆至融合蛋白表達(dá)載體，測(cè)序，得到 包含如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列的質(zhì)粒； 步驟2、將步驟1中得到的所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌株，進(jìn)行蛋白表達(dá)，并使用rTEV酶酶解 所述蛋白，所述rTEV酶酶解去除N端融合蛋白，釋放出可溶性雙鏈DNA酶，使用肝素柱和鎳柱 純化酶解得到的蛋白。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟1中，設(shè)置在所述5'端的限制 性內(nèi)切酶位點(diǎn)為EcoR I，設(shè)置在所述3'端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為Xho I。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟2中，所述表達(dá)菌株為大腸桿 菌表達(dá)菌株R〇sseta(DE3)。9. 一種特異性酶解雙鏈DNA的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括根據(jù)權(quán)利要求5所 述的雙鏈DNA酶和酶解反應(yīng)緩沖液。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒在PCR技術(shù)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/22GK106085986SQ201610411175
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月12日 公開(kāi)號(hào)201610411175.0, CN 106085986 A, CN 106085986A, CN 201610411175, CN-A-106085986, CN106085986 A, CN106085986A, CN201610411175, CN201610411175.0
【發(fā)明人】曹平生
【申請(qǐng)人】翌圣生物科技（上海）有限公司