聚酮合酶基因啟動子PBbpksp的用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物技術領域，具體涉及聚酮合酶基因啟動子PBbpksp的用途。本發(fā)明要解決的技術問題是為蟲生真菌的利用提供一種新選擇。本發(fā)明的技術方案是聚酮合酶基因啟動子PBbpksp在調(diào)控蟲生真菌產(chǎn)孢中的用途。該啟動子具有重要的應用價值，可調(diào)節(jié)特定基因在球孢白僵菌產(chǎn)孢階段或產(chǎn)孢結構中的表達，從而有效的控制球孢白僵菌的產(chǎn)孢或孢子特性。該啟動子為通過分子生物學手段改良和利用蟲生真菌提供了一種新選擇。
【專利說明】
聚酮合酶基因啟動子PBbpksp的用途
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術領域，具體涉及聚酮合酶基因啟動子Ppksp的用途。
【背景技術】
[0002] 昆蟲病原真菌是控制自然界害蟲的主要因素之一(Charnley，1997)，具有種類繁 多、生長迅速、能侵染宿主的不同發(fā)育階段等特點，已成為生物農(nóng)藥中的重要組成部分(李 增智，1997)。蟲生真菌還具有對環(huán)境友好、宿主不易產(chǎn)生抗性等優(yōu)點，已被開發(fā)成生物殺蟲 劑，廣泛應用在農(nóng)林害蟲及城市衛(wèi)生昆蟲的防治上。分生孢子是真菌殺蟲劑的有效成份，其 通過附著宿主體壁、萌發(fā)后穿透宿主體壁開始侵染過程，完成后又在僵蟲體表大量產(chǎn)生，開 始下一輪侵染過程。真菌致死昆蟲后一般能在其體外大量產(chǎn)孢，引起擴散，在適宜時形成流 行病，并與其它各種天敵和許多殺蟲劑相容。真菌殺蟲劑已在我國和歐美國家得到廣泛的 應用（馮明光，1998)，迄今為止，已有50多種登記注冊的產(chǎn)品，包括球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae)、玫煙色擬青霉（Paeci lomyces fumosoroseus)和錯蟻輪枝菌(Verticillium lecanii)在內(nèi)的十多種真菌。最近，昆蟲病原 真菌，特別是經(jīng)過基因工程改良后的菌株，在城市衛(wèi)生害蟲如蚊子、蒼蠅、蟑螂及入侵害蟲 火蟻的防治中展示了巨大的潛力，顯示出昆蟲病原真菌在生防領域具有廣闊的應用前景 (Wang et al.，2007;Fan et al.，2012a，2012b;Fang et al. ,2011)。因此，利用基因工程 調(diào)控蟲生真菌的孢子發(fā)育對于蟲生真菌的推廣應用及環(huán)境安全等具有重要意義。但總體說 來，由于昆蟲病原真菌在應用過程中存在防效不穩(wěn)定及擊倒害蟲的時間過程等問題，因此 真菌殺蟲劑在農(nóng)藥市場，以及生物農(nóng)藥市場所占份額還較低。
[0003]在昆蟲病原微生物中，真菌的侵染機制比較特別，它不必被宿主吞食而直接通過 外骨骼或表皮侵入寄主。其侵染過程分為以下幾步:分生孢子附著在昆蟲體壁并萌發(fā)，形成 侵染結構(如附著胞）；菌絲穿過昆蟲體壁，在蟲體內(nèi)生長并致病昆蟲;最終真菌以死亡的蟲 體為營養(yǎng)源，大量產(chǎn)生分生孢子，孢子擴散后感染其它昆蟲，開始其另一輪的侵染過程 (Chanley，2003)。在此過程中，孢子是侵染的起始，也是一輪侵染完成的終點，其產(chǎn)量、活力 及抗逆能力直接決定了真菌生防制劑的防治效果及市場地位。利用基因工程對昆蟲病原真 菌的孢子進行改良，提高其田間應用時對紫外、高溫等不利條件的耐受性，或提高孢子產(chǎn) 量，對于昆蟲病原真菌的應用具有重要價值?，F(xiàn)有的研究顯示，轉(zhuǎn)基因工程中啟動子的選擇 是決定成敗的關鍵。長期以來，在昆蟲病原真菌的轉(zhuǎn)基因研究中均是以組成性啟動子為主。 但組成性啟動子在非靶標位置及時間表達，往往會消耗生物體能量，甚至對生物體的生長 造成不利影響。因此，為了利用基因工程調(diào)控昆蟲病原真菌的產(chǎn)孢及孢子特性，急需有產(chǎn)孢 階段或產(chǎn)孢結構中特異表達的啟動子。但迄今為止，還沒有昆蟲病原真菌產(chǎn)孢特異階段或 特異結構相關啟動子的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是為蟲生真菌的利用提供一種新選擇。
[0005] 本發(fā)明的技術方案是聚酮合酶基因啟動子PBbpksp在蟲生真菌中的用途。
[0006] 具體的，所述的用途為在調(diào)控蟲生真菌產(chǎn)孢或提高蟲生真菌孢子抗性中的用途。
[0007] 具體的，所述的聚酮合酶基因啟動子PBbpksp來自于球孢白僵菌。
[0008] 具體的，所述的蟲生真菌為綠僵菌或球孢白僵菌。
[0009] 具體的，所述的聚酮合酶基因啟動子PBbpksp具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序 列。SEQIDN0 · lPBbpksP啟動子序列（1108bp)
[0010] GCTCAGGAATCTCGGGTAAAAAGACCGGCCCTTCTTCAGCCCCTGTATTGCGGTAGCTATCGCGGGAGC TATCTCGGTAGCAACACACTTAATGCAGGAGCTATGACACTATTGAATGATGACTCGCGTTGGATCAAGCTCGAGAC TGGTTTCGCATGCCGCTCGGAGCCAAACCCCTGGGGATTGCTACTGAGCGCATGCTCCGCGAAACTTTGTCAATATT CTCTCAGTGACATAGAGTAGAAAAGGTTATGAGAGAGTGGGTATGTGTATTTCGTTTAGCGTTACAGGTTTCTACAC AATTGTTTGATGGGAAACTCCATGAGAGCTGAGGATGTTACAGATTGTATTGAGCGCCGTTTAGAAGGTTCCGTTCC GGCCTTGCATAGTCTCCCGAGACATAGCTACTGTTCGACTAGTATAAATTATTGCAGGGGAGTTTCTATAATGATCG CTCCTCGTTCCTTTTCTGATTTGCAGATGTTTATATACAGATATCAGTACAGCCATATCAACCATGTAGTGCTGAGA ATGCCACTTATGCTTTCTCCCGTGTAATCAATTGCCATGTATACCGTTCTAAAGATATAATCATGACTGCTCTGATG CAGAAGATTTGAGTTATTGTGCAAGTCTGTTCAGAATCTCTGACAAATAACTCGGACATTTGTTGTCGATAGATGGT GGAGACGGCCTGAATTAGAAATAATTGGACCATAACAACATAGGAGCTATTGAATGCTAAGTCAGGCGTTTCTGGGG TTGATACGGAGCCGAGATCTGCGCTAACGAGTCAAGTCAAGCAGAGTCATAACCTCCCGGCGCCTGATTATCAGGTC TTCCCGGTTGGTTTTGGGCGGAAAGAGCGCACGGTTTCTTGGCGGGCTATAACGACTAGATGACATTTATAGATTGC TCAGCTTCACGTGGGAATCGGTACGTTGAGACTGACCGTCTCATTCAGGTCAAGTATATAAGAATGGCATTATCTGC CTGTCTTCGGCCACACCTTTTACCATTACATACGCCAATCTACTTTTCTCAACGAGCTTCATACTTTTTGATAACAA GTCATAACTTTCAAACAAAAATAGCACAAGCAGCAACC
[0011] 本發(fā)明的有益效果:PBbpksP啟動子具有良好的特異性，僅在產(chǎn)孢期間的產(chǎn)孢結構 中特異表達。該啟動子具有重要的應用價值，可調(diào)節(jié)特定基因在球孢白僵菌產(chǎn)孢階段或產(chǎn) 孢結構中的表達，從而有效的控制球孢白僵菌的產(chǎn)孢或孢子特性。該啟動子為通過分子生 物學手段改良和利用蟲生真菌提供了一種新選擇。可利用其調(diào)節(jié)相關基因在孢子中的表 達，改良孢子對不良環(huán)境的耐受性、產(chǎn)孢量等。
【附圖說明】
[0012]圖1實時定量PCR檢測BbpksP在球孢白僵菌不同發(fā)育階段的表達情況。PDB(3d)，馬 鈴薯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天;PDA(X)，馬鈴薯固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3，5，10天?？v坐標表示基因 BbpksP的表達量。
[0013] 圖2 pPk2-SUR-PpksP: :eGFP圖譜。PBbpksP，球孢白僵菌BbpksP的啟動子;eGFP，綠 色熒光蛋白基因；TtrpC，構巢曲霉的色氨酸終止子。
[0014] 圖3 PDB培養(yǎng)基中芽孢子、菌絲熒光觀察。Bb0062，PgpdA: :eGFP，PBbpksP: :eGFP分 別表示球孢白僵菌野生型菌株、組成性啟動子PgpdA引導GFP表達的菌株及BbpksP啟動子 引導GFP表達的菌株。blastspore，表示球孢白僵菌芽孢子;hyphae表示真菌菌絲。圖中所示 為各菌株在馬鈴薯培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天后產(chǎn)生的芽孢子及菌絲熒光觀察。
[0015] 圖4侵染大蠟螟（Galleria mellonella)時蟲菌體熒光觀察。Bb0062，PgpdA:: eGFP，BbpksP: : eGFP分別表示球孢白僵菌野生型菌株、組成型啟動子PgpdA引導GFP表達菌 株及BbpksP啟動子引導GFP表達菌株。圖中所示為各菌株侵染大蠟螟4天后產(chǎn)生的蟲菌體熒 光觀察。
[0016] 圖5 PDA培養(yǎng)基中分生孢子、產(chǎn)孢結構、菌絲熒光觀察。Brightfield表示明視野， Fluorenscence表示GFP焚光信號，Merge表示明視野與GFP信號的融合。Bb0062_4d表示野生 型菌株培養(yǎng)4天后的產(chǎn)孢結構及孢子;PgpdA ::eGFP-4d表示組成型啟動子PgpdA引導GFP表 達菌株培養(yǎng)4天后的觀察;PBbpksP: : eGFP-2d，3d，4d，5d分別表示BbpksP啟動子引導GFP表 達菌株培養(yǎng)2天，3天，4天，5天后的熒光觀察。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合具體實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0018] 實施例1球孢白僵菌中PBbpksP啟動子的表達模式測定
[0019] BbpksP是一個來自球孢白僵菌的聚酮合成酶基因。為分析其啟動子的活性特點， 接種野生型球孢白僵菌于馬鈴薯培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基PDB，固體培養(yǎng)基PDA)，提取不同時間 點的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA(TaKaRa，PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser)，利用 Real-time PCR測定BbpksP基因的表達模式。RT引物對為？1:5'-6六660六1'(：1^6〇：1^6八6-3'，P2:5'-AGTCAAACATCTTGGACGGC-3'oRT-PCR 反應體系：5.0yL Universal SYBR Green Supermix(Bi〇-RAD)，4.0yL cDNA，0.5yL Pl，0.5yL P2,總體積lOyl^RT-PCR反應參數(shù)：95°C (3111；[11);40循環(huán)：95°0（1086(3)，56°0（2086(3)，72°0（2086(3)。球孢白僵菌的&(31:;[11為內(nèi)標基 因，引物序列為Pact-1 :GTCAAGTCATCACCATTGGC和Pact-2:GAGGAGCAATGATCTTGACC。通常情 況下，在Η)Α培養(yǎng)基上，野生型球孢白僵菌一般在3d時開始形成產(chǎn)孢結構，之后從3d到10d產(chǎn) 孢量持續(xù)上升。RT-PCR結果顯示（圖1)，在PDB中培養(yǎng)時BbpksP基因不表達，但在PDA上培養(yǎng) 3d時（剛開始產(chǎn)生分生孢子）少量表達，而在5d、10d表達水平顯著提高。這表明，PBbpksP啟 動子是產(chǎn)孢期間啟動表達的特異性啟動子。
[0020] 實施例2PBbpksP: :eGFP菌株的獲得 [0021] l.PBbpskP啟動子的克隆及載體構建
[0022]人工合成引物對P3/P4(P3 : 5 '-GCTCAGGAATCTCGGGTAA-3 ' ； P4 : 5 '-GGTTGCTGCTTGTGCTAT-3 '），利用野生型球孢白僵菌基因組DNA擴增BbpksP啟動子片段。擴 增體系為：l〇XPhusion Taq PCR Buffer(含Mg2+)2.5yL，10mmol/L dNTP 2yL，10ymol/L引 物(？3/?4)各叫1^，基因組0嫩模板以1^(101^/^)，51]/^?11118丨〇11聚合酶0.2以1^，加水至2541^ 體系。卩〇?反應參數(shù)：98°(：(211^11) ;30循環(huán)：981€(1086。），561€(1586。），72°(：(3086。） ；721€ (3min)。將獲得的PBbpksP啟動子片段(約1 · lkb)克隆進pEasy-Blunt載體(TransGen)，經(jīng)測 序驗證獲得正確的 pEasy-Blunt-PBbpksP。以 3|*P5/P6(P5:5'_ GCGGCCGCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG;P6:5'-AAGCTTAGGATTACCTCTAA ACA AGTG)，WpK2-BarGFP(Zhang et al.，2010)為模版，PCR擴增eGFP-TtrpC。擴增體系為：10XPhusion Taq PCR Buffer(含Mg2+)2.5yL，10mmol/L dNTP 2yL，10ymol/L引物(P3/P4)各lyL，基因組DNA模 板lyL( 10ng/yL)，5U/yL Phusion聚合酶0· 2yL，加水至25yL體系。PCR反應參數(shù)：98°C (211^11);30循環(huán)：981€(1〇86。），56。(：（1586。），72。(：（5〇86。） ；72。(：（311^11)。將獲得的66卩？-TtrpC片段克隆進pEasy-Blunt載體（TransGen)，經(jīng)測序驗證獲得正確的pEasy-Blunt-eGFP-TtrpC。以Xbal與Notl酶切質(zhì)粒pEasy-Blunt-PBbpksP，獲得PBbpksP片段；以Notl與 HindIΠ 酶切的pEasy-Blunt-eGFP-TtrpC質(zhì)粒，獲得eGFP-Ttrpc片段，用XbaI與HindIΠ 酶切 pk2-SUR-Ttrpc質(zhì)粒（將SUR抗性基因 （Zhang et al. ,2010)代替pK2-BarGFP上的BarGFP (Zhang et al. ,2010)，獲得pK2-SUR-TtrpC)，獲得線性化載體，以T4DNA連接酶連接這三個 片段（約為 14kb)，獲得pk2-SUR-PBbpksP: :eGFP-Ttrpc重組載體（圖2)。將口1^2-51]1?-PBbpksP: : eGFP-Ttrpc質(zhì)粒用電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL-1中。
[0023] 2.真菌的遺傳轉(zhuǎn)化與篩選
[0024]以野生型球孢白僵菌為轉(zhuǎn)化受體，參照Fang等人的方法(Fang et al，2004)，利用 根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法進行轉(zhuǎn)化，所用培養(yǎng)基及具體轉(zhuǎn)化方法如下：
[0025]轉(zhuǎn)化過程中所用的培養(yǎng)基：
[0026]頂固體培養(yǎng)基：（400mL 2.5XMM鹽溶液/L，5mL甘油/L，MES 8.5g/L，瓊脂粉 15g/L， 使用前加入200ymol/L乙酰丁香酮和5mmol/L葡萄糖）
[0027] IM液體培養(yǎng)基：（400mL 2.5XMM鹽溶液/L，5mL甘油/L，MES 8.5g/L，使用前加入 200ymol/L乙酰丁香酮和10mm〇l/L過濾滅菌的葡萄糖，避光保存）
[0028] CZM培養(yǎng)基（1L) :30g/L;NaN〇3,2g/L;MgS〇4 · 7H2〇,0.5g/L;K2HP〇4，lg/L;FeS〇4 · 7H20，0 · 001g/L ;KC1，0 · 5g/L;調(diào)pH至7 · 0。瓊脂粉，15g/L; 121°C 高溫滅菌 15min。
[0029] 將含有質(zhì)粒載體的根癌農(nóng)桿菌單菌落接種到YEB液體培養(yǎng)基中（含50yg/mL羧芐青 霉素和50yg/mL卡那霉素），28°C、200rpm搖床過夜培養(yǎng)（16~20h)。取3mL菌液6000rpm、 lOmin離心，棄上清液，用等量的頂液體培養(yǎng)基(含有200μΜ乙酰丁香酮和10mM Glucose)重 懸菌體，并調(diào)整濃度至0D660為0.15，然后于28°C，180rpm搖床培養(yǎng)6h。在此期間先將微孔濾 膜(半島，上海)平鋪于頂固體培養(yǎng)基上，用了《的11-80(0.5^^八)配制濃度為2\10 4個/1111的 孢懸液。將上述孢懸液和預培養(yǎng)后的農(nóng)桿菌菌液等體積混均后，取1〇〇μ1菌液涂布于頂固體 培養(yǎng)基平板上的微孔濾膜上，22°C共培養(yǎng)48h。將共培養(yǎng)之后的微孔濾膜轉(zhuǎn)至一篩培養(yǎng)基 CZM+60μg/ml氯嘧磺隆上繼續(xù)篩選，26°C培養(yǎng)大約5d直到有抗性菌落出現(xiàn)。將上述陽性菌落 進行PCR驗證。轉(zhuǎn)化子robpksP: : eGFP菌株能擴增出大約1.9kb片段。PCR擴增體系：10 X Ex Taq PCR Buffer(含Mg2+)2yL，5mmol/l dNTP 2yL，引物P3(PBbpksP上游引物）lyL，引物 Pgfp-2(eGFP下游：TTACTTGTACAGCTCGTCCA)lyL，DNA模板lyL(50ng)，Ex Taq DNA聚合酶5U/ yL 0.2yL，加水至20yL體系。擴增的程序：94°C預變性5min，94°C30s，56°C30s，72°C3min循 環(huán) 32 次，72°C 延伸 10min。
[0030] 3.PBbpksP啟動子表達模式研究
[0031] 接種robpksP: : eGFP菌株在PDB培養(yǎng)基中，在多個生長時間點（2d、3d、4d、5d)進行 熒光觀察以研究PBbpksP基因的表達模式。觀察結果顯示，PBbpksP: :eGFP菌株在培養(yǎng)基 中的菌絲和芽孢子沒有GFP信號（圖3)。球孢白僵菌侵染宿主過程中，會形成酵母樣的蟲菌 體。？8匕?1^? ::66??在蟲菌體中也沒有表達（圖4)。？匕3::66??為組成型啟動子?8?(^與66卩？ 的融合基因。在CZM固定培養(yǎng)基中產(chǎn)孢結構形成之前不表達eGFP，但在產(chǎn)孢過程中，在未成 熟的孢子與產(chǎn)孢結構中eGFP表達量較高（圖5)，在成熟的孢子中表達量較低或者基本不表 達。該研究結果表明，PBbpksP啟動子具有良好的特異性，僅在產(chǎn)孢期間的產(chǎn)孢結構中特異 表達。該啟動子具有重要的應用價值，可調(diào)節(jié)特定基因在球孢白僵菌產(chǎn)孢階段或產(chǎn)孢結構 中的表達，從而有效的控制球孢白僵菌的產(chǎn)孢或孢子特性。
【主權項】
1. 聚酮合酶基因啟動子PBbpksp在蟲生真菌中的用途。2. 如權利要求1所述的用途，其特征在于:所述的用途為在調(diào)控蟲生真菌產(chǎn)孢或提高蟲 生真菌孢子抗性中的用途。3. 如權利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述的聚酮合酶基因啟動子PBbpksp來自 于球孢白僵菌。4. 如權利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述的蟲生真菌為綠僵菌或球孢白僵菌。5. 如權利要求3所述的用途，其特征在于:所述的蟲生真菌為綠僵菌或球孢白僵菌。6. 如權利要求1或2所述的用途，其特征在于:所述的聚酮合酶基因啟動子robpksp具有 如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。7. 如權利要求3所述的用途，其特征在于:所述的聚酮合酶基因啟動子robpksp具有如 SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。8. 如權利要求4所述的用途，其特征在于:所述的聚酮合酶基因啟動子robpksp具有如 SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
【文檔編號】C12N15/113GK106086059SQ201610486138
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月28日
【發(fā)明人】范艷華, 馬玉戈, 裴炎, 金丹
【申請人】西南大學