泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因的重組質(zhì)粒，由J亞群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因，雞泛素Ub基因和真核表達(dá)載體pVAX1組成。發(fā)明人還建立相應(yīng)構(gòu)建方法，該法可同時(shí)將J亞群禽白血病病毒gp85、p27、p10基因與雞泛素基因串聯(lián)后插入到pVAX1載體中。體外實(shí)驗(yàn)證明，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF?1細(xì)胞，重組質(zhì)粒成功得到表達(dá)。在雞免疫試驗(yàn)中，免疫雞的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率和后代雛雞的抗體陽(yáng)性率均有提高。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建泛素介導(dǎo)的J亞群禽白血病病毒多基因共表達(dá)DNA疫苗，為J亞群禽白血病病毒新型疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)，為J亞群禽白血病病毒的凈化提供一種有效的輔助手段。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于J亞群禽白血病技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血 病病毒gp85、p27、pl0基因的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。 泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒8卩85、卩27、卩10基因的重 組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【背景技術(shù)】
[0002] J亞群禽白血病病毒(Avian leukosis virus subgroup J，ALV_J)是 1988年首次 從白羽肉雞中分離得到的一種禽白血病病毒新亞群。ALV-J與ALV-A、ALV-B-樣，可引起機(jī) 體發(fā)生免疫抑制，造成疫苗免疫失敗，又嚴(yán)重影響禽類(lèi)的生產(chǎn)性能，導(dǎo)致產(chǎn)蛋量和蛋品質(zhì)的 下降，嚴(yán)重影響?zhàn)B禽業(yè)的健康發(fā)展。相比于ALV-A、ALV-B，ALV-J水平傳播速度更快、危害更 大，目前該病已蔓延到許多國(guó)家，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失。隨著白羽肉種雞引進(jìn)ALV-J 傳入我國(guó)，并于1999年首次在上坪肉雞中分離得到，之后不同地區(qū)、不同品系的雞都有分離 至IjALV-J的報(bào)道，目前ALV-J已蔓延到地方品種雞中，嚴(yán)重威脅我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展。
[0003] 雖然目前尚無(wú)有效的疫苗，但研制新型疫苗作為ALV凈化的輔助手段仍受到人們 的關(guān)注。DNA疫苗具有能夠在機(jī)體內(nèi)持續(xù)表達(dá)并產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞和體液免疫、安全、穩(wěn) 定、制備簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，成為研究的熱點(diǎn)。
[0004] gp85基因表達(dá)病毒表面蛋白，決定亞群特異性，是病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞復(fù)制、誘發(fā)腫 瘤發(fā)生的必須條件。gp85表達(dá)的表面蛋白在ALV-J致病、致瘤中具有重要作用;p27基因表達(dá) 核衣殼蛋白，該蛋白是主要的群特異性抗原，在所有亞群中高度保守;PlO基因表達(dá)蛋白主 要參與病毒早起感染和后期裝配，目前未見(jiàn)PlO基因用于構(gòu)建基因疫苗的報(bào)道。
[0005] 泛素(Ubiquitin，Ub)是由76個(gè)氨基酸組成、高度保守、普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi)的 小分子多肽。泛素及其對(duì)蛋白質(zhì)的標(biāo)志修飾（泛素化，u b i q u i t i n a t i ο η 〇 r ubiquityrmtion)參與細(xì)胞內(nèi)ATP依賴(lài)的選擇性蛋白質(zhì)降解過(guò)程，泛素-蛋白酶體途徑的發(fā) 現(xiàn)，引起了研究者的廣泛關(guān)注。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者利用泛素提高DNA疫苗的免疫效果， 研究結(jié)果表明泛素融合質(zhì)粒DNA能夠誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。目前關(guān)于泛素增強(qiáng)禽類(lèi)病 原免疫應(yīng)答研究報(bào)道甚少，尤其是針對(duì)病毒抗原的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、 p27、pl0基因的重組質(zhì)粒及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，為J亞群禽白血病病毒新型疫苗的研制奠定 基礎(chǔ)。
[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0008] 泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因的重組質(zhì)粒，由J亞群禽白 血病病毒8口85、？27、？10基因，雞泛素1]13基因和真核表達(dá)載體?￥4乂1組成。
[0009] 上述泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、p27、PlO基因的重組質(zhì)粒，為 pVAXl-Ub-gp85-p27-plO。
[0010]上述泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因的重組質(zhì)粒具有序列 表SEQ. ID.No. 13的堿基序列。
[0011] J亞群禽白血病病毒來(lái)自中國(guó)分離株GX13HG03。
[0012] J亞群禽白血病病毒gP85、p27、pl0基因分別具有序列表SEQ.ID.NO.l至 SEQ. ID. No. 3的堿基序列，雞泛素 Ub基因具有序列表SEQ. ID. No. 12堿基序列。
[0013] 上述泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建方 法，運(yùn)用PCR方法擴(kuò)增獲得J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因與雞泛素基因，擴(kuò)增所用 引物F/R-gp85、F/R-p27、F/R-p 10、F/R-Ub分別具有序列表SEQ · ID · No · 4至SEQ · ID · No · 11 的 堿基序列；將J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因與雞泛素基因通過(guò)酶切位點(diǎn)相連的方 法連接并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物經(jīng)Kpn I和Xho I雙酶切后定向插入同樣以Kpn I和Xho I 雙酶切處理的真核表達(dá)載體PVAXl中，即得泛素介導(dǎo)的J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基 因串聯(lián)的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXl-Ub-gp85-p27-plO。
[0014] 上述泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因的重組質(zhì)粒在制備預(yù) 防禽白血病DNA疫苗方面的應(yīng)用。
[0015] 針對(duì)目前J亞群禽白血病防控存在的問(wèn)題，發(fā)明人綜合考慮后選擇gp85、p27、pl0 基因作為核酸疫苗的靶基因，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、p27、 PlO基因的重組質(zhì)粒，由J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因，雞泛素 Ub基因和真核表達(dá) 載體pVAXl組成。發(fā)明人還建立相應(yīng)的構(gòu)建方法，該法可同時(shí)將J亞群禽白血病病毒gp85、 p27、pl0基因與雞泛素基因串聯(lián)后插入到pVAXl載體中。體外實(shí)驗(yàn)證明，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，利用間接免疫熒光(IFA)方法確定構(gòu)建的重組質(zhì)粒成功得到表達(dá)。在雞免疫試驗(yàn)中， 免疫雞的抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)率和后代雛雞的抗體陽(yáng)性率均有提高。本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建泛素介導(dǎo)的J亞 群禽白血病病毒多基因（gp85、p27、pl0)共表達(dá)DNA疫苗，為J亞群禽白血病病毒新型疫苗的 研制奠定了基礎(chǔ)，為J亞群禽白血病病毒的凈化提供一種有效的輔助手段。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1 是pVAXl-Ub-gp85-p27-plO雙切鑒定結(jié)果圖，圖中：M為DL15000DNA Maker;l為 pVAXl-Ub-gp85-p27-plO質(zhì)粒經(jīng)Kpn I+Xho I雙酶切結(jié)果。
[0017]圖2是免疫熒光方法檢測(cè)結(jié)果圖，圖中：A為pVAXl-Ub-gp85-p27-plO在DF-I細(xì)胞中 瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果（陽(yáng)性），B為pVAXl空載體轉(zhuǎn)染結(jié)果（陰性）。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 1.1 毒株
[0019] J亞群禽白血病病毒毒株GX13HG03(發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存）。
[0020] 1.2 方法 [0021] 1.2.1引物設(shè)計(jì)
[0022] 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因序列與雞泛素基 因序列設(shè)計(jì)引物，并在不同引物上分別加入了Hind III、BamH I、EcoR I、Xho I和Kpn I酶 切位點(diǎn)，所有內(nèi)切酶均購(gòu)買(mǎi)于寶生物工程(大連)有限公司。gp85、p27、pl0和泛素基因擴(kuò)增 引物序列見(jiàn)表1。
[0023] 表1引物序列
[0025] 表1中，斜體部分為酶切位點(diǎn)，引物由北京華大基因公司合成。
[0026] 1.2.2 8?85、？27、？10、泛素基因的擴(kuò)增
[0027] GX13HG03毒株gp85、p27、pl0基因的擴(kuò)增：以毒株GX13HG03前病毒DNA為模板，分別 擴(kuò)增gp85、p27、pl0基因。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，60°C退火30秒， 72°C延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。
[0028]泛素基因的擴(kuò)增：按照RNA抽提試劑盒說(shuō)明書(shū)（北京康為世紀(jì)，超純RNA抽提試劑 盒）提取雞肌肉組織總RNA，以之為模板參照MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（寶生物工程（大連）有限公司， TaKaRa MLV，1000 Ounits)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得CDNA13PCR體系配置參照說(shuō)明書(shū)，PCR反應(yīng) 程序?yàn)?4 °C預(yù)變性5分鐘，94 °C變性30秒，62 °C退火45秒，72 °C延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)，最后 72 °C延伸10分鐘。
[0029] 1.2.3目的基因鑒定
[0030]將目的基因 gp85、p27、pl0以及泛素分別與pUC-T克隆載體連接，連接體系見(jiàn)表2。 [0031]表2 8?85、？27、？10、泛素、克隆連接體系
[0033] 將上述反應(yīng)物輕輕混勻后于連接儀中22°C連接30min，之后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞， 具體操作如下：
[0034] 1.在-80°C冰箱取出1管IOOyL的DH5a感受態(tài)細(xì)胞，冰上融化IOmin;
[0035] 2.將IOyL的連接產(chǎn)物全部加入到IOOyL的感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后冰浴30min;
[0036] 3.42。(：熱應(yīng)激9〇8，之后立即置于冰上2111丨11-511^11;
[0037] 4.加入500yL LB液體培養(yǎng)基，37°C225r/min振蕩培養(yǎng)lh-2h;
[0038] 5.取IOyL 100yg/mL的Amp、8yL 500mM的IPTG和40yL 20mg/mL的X-gal均勻涂布于 LB平板上，37 °C放置30min使其充分吸收；
[0039] 6.取I OOyL培養(yǎng)的菌液鋪板，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)。
[0040]過(guò)夜培養(yǎng)后，隨機(jī)挑取3個(gè)LB平板上的白色菌落于300yL含有l(wèi)OOyg/mLAmp的LB培 養(yǎng)基中，37 °C 225r/min振搖培養(yǎng)lh-2h，進(jìn)行菌液PCR鑒定，取IOyL的陽(yáng)性菌液加入到5mL含 有100yg/mL Amp的LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，使用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行酶切 鑒定，鑒定正確后將陽(yáng)性菌液送北京華大基因公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果獲得大小為906bp (SEQ.ID.No.l)、717bp(SEQ.ID.No.2)、186bp(SEQ.ID.No.3WP228bp(SEQ.ID.No.l2W9g 的片段，均與理論值相符。測(cè)序結(jié)果表明，插入的外源目的基因正確，未出現(xiàn)堿基突變。
[0041 ] 1.2.4重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定
[0042] 8?85、？27、？10與泛素基因經(jīng)1.2.3鑒定后，按照酶切體系經(jīng)酶切，雙酶切體系如 下： 反應(yīng)物 體積
[0043] !O^K Buficr 5：lL 栽體質(zhì)粒 25μ：? 內(nèi)切酶1 2μ1.
[0044] 內(nèi)切酶 2 2μΙ ddll：0 總反應(yīng) 5 OfiL
[0045] 酶切反應(yīng)的條件:37 °C 3小時(shí)。
[0046] 酶切結(jié)束后，1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并回收純化酶切后的片段。按照康為世 紀(jì)凝膠電泳回收試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
[0047] 按泛素、gp85、p27、pl0順序利用酶切位點(diǎn)將片段克隆進(jìn)入pVAX-Ι載體中，反應(yīng)體 系如下： 泛素、gp85、p27、plO雙酶切純化產(chǎn)物4 UL pVAX- 1 4 μ L
[0048] Τ4 DNA Liagasc 1 μL, 1〇χΤ4 BuHcr 1 μ￡ 總反M體系 _? ΟμΙ
[0049] 16 °C連接儀連接20h，獲的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂板挑選菌落鑒定陽(yáng)性后抽 質(zhì)粒按照泛素、gp85、p27、pl0順序利用酶切位點(diǎn)將片段克隆進(jìn)入pVAX-Ι載體中，重組質(zhì)粒 即為 pVAXl-Ub-gp85-p27-plO。
[0050] 運(yùn)用雙酶切方法將得到的重組質(zhì)粒pVAXl-Ub-gp85-p27-plO進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng) 結(jié)束后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，根據(jù)電泳結(jié)果判斷重組基因是否插入載體(結(jié)果 見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明目的基因正確插入到載體中，目的片段大小與預(yù)期一致。
[0051 ]將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送樣測(cè)序后進(jìn)一步鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建是否正確及其 目的片段是否準(zhǔn)確插入到表達(dá)載體中。結(jié)果表明目的片段（SEQ. ID.No. 1、SEQ. ID. No. 2、 SEQ. ID.No.3、SEQ. ID.No. 12)正確插入到表達(dá)載體中且測(cè)序結(jié)果與預(yù)期完全一致。
[0052] 1.2.6重組質(zhì)粒的體外表達(dá)及其產(chǎn)物檢測(cè)
[0053] 1.2.6.1重組質(zhì)粒的體外轉(zhuǎn)染
[0054] 將pVAXl-Ub-gp85-p27-plO重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-I細(xì)胞，方法按照轉(zhuǎn)染試劑 (Invitrogen公司，Lipofectamine 2000，1.5ml)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0055] 1.2.6.2間接免疫熒光方法檢測(cè)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的基因表達(dá)
[0056] 1.轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用預(yù)冷的PBS(pH值=7.4)漂洗DF-I細(xì)胞3次，每次5分鐘；
[0057] 2.用4°C預(yù)冷的多聚甲醛固定10分鐘，PBS洗滌3次，自然風(fēng)干；
[0058] 3.滴加 J亞群禽白血病病毒單克隆抗體JE9 (1:250稀釋?zhuān)胖糜?7 °C的濕盒作用 60分鐘，PBS漂洗3次，每次5分鐘；
[0059] 4.分別在各孔內(nèi)滴兔抗鼠 IgG二抗（1:300稀釋?zhuān)胖糜?7°C的濕盒避光作用45分 鐘，PBS漂洗3次，每次5分鐘；
[0060] 5.封片用配置的中性甘油，之后用倒置熒光顯微鏡觀察并進(jìn)行拍照。
[0061 ] 如圖2所示，左圖是轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒pVAXl-Ub-gp85-p27-pl048小時(shí)后的DF-I細(xì) 胞，出現(xiàn)了特異性的熒光信號(hào)；右圖是轉(zhuǎn)染了空載體PVAX148小時(shí)后的DF-I細(xì)胞，未出現(xiàn)特 異性的熒光信號(hào)。
[0062] 1.2.7種雞免疫試驗(yàn)
[0063]選擇血漿病毒分離檢測(cè)禽白血病p27抗原，血清檢測(cè)禽白血病ALV-A/B、ALV-J抗體 全為陰性的180日齡種雞，每組25只，分成對(duì)照組跟免疫組。182日齡首免免疫組種雞的DNA 質(zhì)粒免疫經(jīng)雞肉注射，對(duì)照組用相同體積的PBS進(jìn)行免疫。196日齡二次免疫。免疫方式同 上。
[0064] 免疫pVAXl-Ub-gp85-p27-plO重組質(zhì)粒的種雞在首次免疫后第二周（196日齡)有3 只為ALV-J抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性率12% (3/25)。二次免疫后第二周有5只為ALV-J抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性 率為20% (5/25)。首次免疫后二周種雞后代雛雞無(wú)抗體陽(yáng)性，二次免疫后第二周有1只呈現(xiàn) 為ALV-J抗體陽(yáng)性。對(duì)照組全部為陰性。該結(jié)果證明構(gòu)建的pVAXl-Ub-gp85-p27-plO重組質(zhì) 粒在種雞體內(nèi)表達(dá)了相應(yīng)蛋白，并刺激機(jī)體產(chǎn)生了相應(yīng)抗體。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因的重組質(zhì)粒，其特征在 于由J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因，雞泛素 Ub基因和真核表達(dá)載體pVAXl組成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因的重 組質(zhì)粒，其特征在于為pVAXl-Ub-gp85-p27-plO。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因的重 組質(zhì)粒，其特征在于具有序列表SEQ. ID. No. 13的堿基序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因的重 組質(zhì)粒，其特征在于:所述J亞群禽白血病病毒來(lái)自中國(guó)分離株GX13HG03。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因的重 組質(zhì)粒，其特征在于：所述J亞群禽白血病病毒8?85、？27、？10基因分別具有序列表 SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No. 3的堿基序列，所述雞泛素 Ub基因具有序列表SEQ. ID.No. 12堿基 序列。6. 權(quán)利要求1所述泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因的重組質(zhì)粒 的構(gòu)建方法，其特征在于運(yùn)用PCR方法擴(kuò)增獲得J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因與雞 泛素基因，擴(kuò)增所用引物F/R_gp85、F/R-p27、F/R-plO、F/R-Ub分別具有序列表SEQ. ID. No. 4 至SEQ.ID.NO.ll的堿基序列；將雞泛素基因與J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因通過(guò) 酶切位點(diǎn)相連的方法連接并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物經(jīng)Κρη I和Xho I雙酶切后定向插入同 樣以Κρη I和Xho I雙酶切處理的真核表達(dá)載體pVAXl中，即得泛素介導(dǎo)的J亞群禽白血病病 毒gp85、p27、pl0基因串聯(lián)的真核表達(dá)質(zhì)粒pVAXl-Ub-gp85-p27-plO。7. 權(quán)利要求1所述泛素介導(dǎo)的表達(dá)J亞群禽白血病病毒gp85、p27、pl0基因的重組質(zhì)粒 在制備預(yù)防禽白血病DNA疫苗方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK106086067SQ201610389802
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月6日 公開(kāi)號(hào)201610389802.5, CN 106086067 A, CN 106086067A, CN 201610389802, CN-A-106086067, CN106086067 A, CN106086067A, CN201610389802, CN201610389802.5
【發(fā)明人】韋平, 王培坤, 畢玉彧, 鄒廣珍, 楊永立, 林璐璐, 秦麗莉, 彭昊, 磨美蘭, 韋天超, 黃騰
【申請(qǐng)人】廣西大學(xué)