一種生產(chǎn)反式-4-羥基-l-脯氨酸的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)反式?4?羥基?L?脯氨酸的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的工程菌的構(gòu)建方法，包括A1)和A2)：A1)向受體細(xì)胞中導(dǎo)入L?脯氨酸?4?羥化酶基因、谷氨酸?5?激酶基因和谷氨酸?5?半醛脫氫酶基因；A2)為將受體細(xì)胞的α－酮戊二酸脫氫酶基因、異檸檬酸裂解酶基因或脯氨酸脫氫酶基因敲除、或用乙酰輔酶A合成酶基因替換受體細(xì)胞的丙酮酸氧化酶基因；利用重組細(xì)胞與底物進(jìn)行反應(yīng)得到反式?4?羥基?L?脯氨酸。實(shí)驗(yàn)證明，可以利用本發(fā)明的反式?4?羥基?L?脯氨酸的生產(chǎn)方法生產(chǎn)反式?4?羥基?L?脯氨酸。
【專利說明】
_種生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的工程菌及其構(gòu)建方法與 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 反式-4-羥基-L-脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-proline，Hyp)是廣泛存在于動(dòng)物膠 和骨膠原中的亞氨基酸，分子式如式1。
[0003]
[0004] 反式-4-羥基-L-脯氨酸可以作為膠原蛋白合成的增強(qiáng)劑而用于化妝品和醫(yī)藥產(chǎn) 品行業(yè)。也可以作為許多組織（如皮膚、骨骼和消化道）的補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物而用于食品行業(yè)。此 外，反式-4-羥基-L-脯氨酸帶有手性分子，是合成藥物時(shí)有用的手性元件。其有用的衍生品 包括MK-1220、聚胺-4-L-羥脯氨酸和N-乙酰-羥脯氨酸(奧沙西羅）。歷-1220被認(rèn)為是一個(gè) 高活性的丙型肝炎病毒蛋白酶抑制劑;聚胺-4-L-羥脯氨酸被用作非降解性丙烯酸骨結(jié)合 劑;N-乙酰-羥脯氨酸可以抑制炎癥和減少腫脹，是有用的治療骨關(guān)節(jié)炎等影響結(jié)締組織疾 病，奧沙西羅已經(jīng)被確立為一種無毒副作用的治療關(guān)節(jié)疾病的藥物。
[0005] 目前，生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的主要方法是生物提取法:利用動(dòng)物蛋白如明 膠、豬皮為原料，經(jīng)酸、堿水解后提取反式-4-羥基-L-脯氨酸，該方法純化步驟長(zhǎng)，成本高， 且廢棄物污染嚴(yán)重。隨著脯氨酸-4-羥化酶的開發(fā)和生物技術(shù)的發(fā)展，利用微生物生產(chǎn)反 式-4-羥基-L-脯氨酸成為可能。
[0006] 國(guó)外，Shibasaki等人于2000發(fā)表文章稱已構(gòu)建可以工業(yè)化生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的微生物，即在含有葡萄糖和L-脯氨酸的培養(yǎng)基中，用大腸桿菌過量表達(dá)L-脯氨酸- 4-羥化酶來轉(zhuǎn)化L-脯氨酸生成反式-4-羥基-L-脯氨酸。國(guó)內(nèi)，劉合棟等人于2013年構(gòu)建了 過量表達(dá)L-脯氨酸-4-羥化酶的大腸桿菌，利用葡萄糖做底物，發(fā)酵法生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸。以上方法的共同缺點(diǎn)是耗時(shí)較長(zhǎng)，而且L-脯氨酸做底物，成本昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何低成本生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)方法，該 方法以谷氨酸和/或可溶性谷氨酸鹽為底物，葡糖糖作輔因子，利用工程菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn) 反式-4-羥基-L-脯氨酸，不但降低了生產(chǎn)成本，還縮短了生產(chǎn)周期。
[0009] 本發(fā)明所提供的反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)方法，包括利用重組細(xì)胞與底物進(jìn) 行反應(yīng)得到反式-4-羥基-L-脯氨酸；
[0010] 所述重組細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行Al)、A2)、A3)和A4)的改造得到重 組細(xì)胞的步驟：
[0011] Al)向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入L-脯氨酸-4-輕化酶(P4H)基因；
[0012] A2)向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入谷氨酸-5-激酶(ProB)基因；
[0013] A3)向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入谷氨酸-5-半醛脫氫酶(ProA)基因；
[0014] A4)為如下BI)、B2)、B3)和B4)這四種中的任一種、任兩種、任二種或四種：
[0015] BI)將所述受體細(xì)胞的α -酮戊二酸脫氫酶（SucA)基因敲除，該改造以"ASUCA"表 示；
[0016] B2)將所述受體細(xì)胞的異檸檬酸裂解酶(AceA)基因敲除，該改造以"AaceA"表示； [0017] B3)為如下B31)和B32)，該改造以"Δρ0ΧΒ: :acs"表示：
[0018] B31)將所述受體細(xì)胞的丙酮酸氧化酶(PoxB)基因敲除；
[0019] B32)向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入乙酰輔酶A合成酶(Acs)基因；
[0020] B4)將所述受體細(xì)胞的脯氨酸脫氫酶(PutA)基因敲除，該改造以" △ putA"表示； [0021 ]所述受體細(xì)胞為微生物細(xì)胞、非人動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
[0022] 上述方法中，所述受體細(xì)胞為大腸桿菌。所述受體細(xì)胞具體可為大腸桿菌K12。
[0023] 上述方法中，所述底物可為谷氨酸或/和可溶性谷氨酸鹽。
[0024] 上述方法中，B3)可為用所述乙酰輔酶A合成酶基因替換所述受體細(xì)胞的所述丙酮 酸氧化酶基因。
[0025] 上述敲除和替換均可通過同源重組實(shí)現(xiàn)。
[0026]上述方法中，所述L-脯氨酸-4-輕化酶可為如下Gl)或G2)的蛋白質(zhì)：
[0027] Gl)氨基酸序列是SEQ ID No. 1的蛋白質(zhì)；
[0028] G2)在SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基得到的具有所述L-脯氨酸-4-羥化酶功能的由Gl)衍生的蛋白質(zhì)；
[0029]所述谷氨酸-5-激酶可為下述Hl)或H2)的蛋白質(zhì)：
[0030] Hl)氨基酸序列為SEQ ID No.3的蛋白質(zhì)；
[0031] H2)在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基得到的具有所述谷氨酸-5-激酶功能的由Hl)衍生的蛋白質(zhì)；
[0032]所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶可為下述I 1)或12)的蛋白質(zhì)：
[0033] II)氨基酸序列為SEQ ID No.5的蛋白質(zhì)；
[0034] 12)在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基得到的具有所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶功能的由II)衍生的蛋白質(zhì)；
[0035]所述α-酮戊二酸脫氫酶可為下述Jl)或J2)的蛋白質(zhì)：
[0036] Jl)氨基酸序列為SEQ ID No.7的蛋白質(zhì)；
[0037] J2)在SEQ ID No.7所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基得到的具有所述α-酮戊二酸脫氫酶功能的由Jl)衍生的蛋白質(zhì)；
[0038]所述脯氨酸脫氫酶可為下述Kl)或Κ2)的蛋白質(zhì)：
[0039] Kl)氨基酸序列為SEQ ID No.8的蛋白質(zhì)；
[0040] K2)在SEQ ID No.8所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基得到的具有所述脯氨酸脫氫酶功能的由Kl)衍生的蛋白質(zhì)；
[0041 ]所述異檸檬酸裂解酶可為下述LI)或L2)的蛋白質(zhì)：
[0042] LI)氨基酸序列為SEQ ID No.9的蛋白質(zhì)；
[0043] L2)在SEQ ID No.9所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基得到的具有所述異檸檬酸裂解酶功能的由LI)衍生的蛋白質(zhì)；
[0044]所述丙酮酸氧化酶可為下述Ml)或M2)的蛋白質(zhì)：
[0045] Ml)氨基酸序列為SEQ ID No. 10的蛋白質(zhì)；
[0046] M2)在SEQ ID No. 10所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基得到的具有所述丙酮酸氧化酶功能的由Ml)衍生的蛋白質(zhì)；
[0047]所述乙酰輔酶A合成酶可為下述NI)或N2)的蛋白質(zhì)：
[0048] NI)氨基酸序列為SEQ ID No. 11的蛋白質(zhì)；
[0049] N2)在SEQ ID No. 11所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾 個(gè)氨基酸殘基得到的具有所述乙酰輔酶A合成酶功能的由NI)衍生的蛋白質(zhì)。
[0050] 上述方法中，所述L-脯氨酸-4-羥化酶基因可為下述Gll)-G13)中的任一種DNA分 子：
[0051 ] G11)編碼序列是SEQ ID No.2所示的CDNA分子或基因組DNA;
[0052] G12)在嚴(yán)格條件下與G11)限定的DNA分子雜交且編碼所述L-脯氨酸-4-羥化酶的 cDNA分子或基因組DNA;
[0053] G13)與G11)或G12)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且編碼所述L-脯氨酸- 4-羥化酶的cDNA分子或基因組DNA;
[0054] 所述谷氨酸-5-激酶基因可為下述Hl I) -Hl 3)中的任一種DNA分子：
[0055] H11)編碼序列是SEQ ID No.4所示的cDNA分子或基因組DNA;
[0056] H12)在嚴(yán)格條件下與Hll)限定的DNA分子雜交且編碼所述谷氨酸-5-激酶的cDNA 分子或基因組DNA;
[0057] H13)與H11)或H12)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且編碼所述谷氨酸-5-激酶的cDNA分子或基因組DNA;
[0058] 所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶基因可為下述111)-113)中的任一種DNA分子：
[0059] 111)編碼序列是SEQ ID No.6所示的cDNA分子或基因組DNA;
[0060] 112)在嚴(yán)格條件下與111)限定的DNA分子雜交且編碼所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶 的cDNA分子或基因組DNA;
[00611 113)與111)或112)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且編碼所述谷氨酸-5- 半醛脫氫酶的cDNA分子或基因組DNA;
[0062] 所述乙酰輔酶A合成酶基因可為下述NI I)-Nl3)中的任一種DNA分子：
[0063] Nil)編碼序列是SEQ ID No. 12所示的cDNA分子或基因組DNA;
[0064] N12)在嚴(yán)格條件下與Nil)限定的DNA分子雜交且編碼所述乙酰輔酶A合成酶的 cDNA分子或基因組DNA;
[0065] N13)與Nil)或N12)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且編碼所述乙酰輔酶A 合成酶的cDNA分子或基因組DNA。
[0066] 上述嚴(yán)格條件可為如下：50°C，在7%十二烷基硫酸鈉（SDS)、0.5M NaP〇4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50 °C，2 X SSC，0.1 % SDS中漂洗；還可為：50 °C，在7 % SDS、0.5M NaP〇4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50 °C，I X SSC，O. I % SDS中漂洗；還可為：50 °C，在 7 % SDS、0.5M NaP〇4和 ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50 °C，0.5 X SSC，0.1 % SDS 中漂洗;還 可為：50 °C，在7 % SDS、0 · 5M NaP〇4和 ImM EDTA的混合溶液中雜交，在50 °C，0 · I X SSC，0 · 1 % SDS中漂洗；還可為：50 °C，在7 % SDS、0.5M NaP〇4和ImM EDTA的混合溶液中雜交，在65 °C， 0.1父33(：，0.1%303中漂洗;也可為:在6\33(：，0.5%303的溶液中，在65°(：下雜交，然后用2 X SSC，0 · 1 % SDS和 I X SSC，0 · 1 % SDS各洗膜一次。
[0067]上述"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟 件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比（％ )表示，其可 以用來評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。
[0068] 上述方法中，所述L-脯氨酸-4-羥化酶基因可通過含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因表 達(dá)盒的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體細(xì)胞中。
[0069]本發(fā)明中所述L-脯氨酸-4-羥化酶基因表達(dá)盒可含有所述L-脯氨酸-4-羥化酶基 因和啟動(dòng)所述L-脯氨酸-4-羥化酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。本發(fā)明中所述L-脯氨酸-4-羥化酶基 因表達(dá)盒指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)SEQ ID No. 1所示的L-脯氨酸-4-羥化酶的DNA，該DNA不 但可包括啟動(dòng)所述L-脯氨酸-4-羥化酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止所述L-脯氨酸-4-羥化酶基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述L-脯氨酸-4-羥化酶基因表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序 列。
[0070] 上述方法中，所述谷氨酸-5-激酶基因可通過含有谷氨酸-5-激酶基因表達(dá)盒的重 組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體細(xì)胞中。
[0071] 本發(fā)明中所述谷氨酸-5-激酶基因表達(dá)盒可含有所述谷氨酸-5-激酶基因和啟動(dòng) 所述谷氨酸-5-激酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。本發(fā)明中所述谷氨酸-5-激酶基因表達(dá)盒指能夠在 宿主細(xì)胞中表達(dá)SEQ ID No.3所示的谷氨酸-5-激酶的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)所述谷氨 酸-5-激酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止所述谷氨酸-5-激酶基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一 步，所述谷氨酸-5-激酶基因表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。
[0072] 上述方法中，所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶基因可通過含有谷氨酸-5-半醛脫氫酶基 因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述受體細(xì)胞中。
[0073] 本發(fā)明中所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶基因表達(dá)盒可含有所述谷氨酸-5-半醛脫氫 酶基因和啟動(dòng)所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。本發(fā)明中所述谷氨酸-5-半醛 脫氫酶基因表達(dá)盒指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)SEQ ID No.5所示的谷氨酸-5-半醛脫氫酶的 DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止所 述谷氨酸-5-半醛脫氫酶基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶基因表達(dá) 盒還可包括增強(qiáng)子序列。
[0074]所述L-脯氨酸-4-羥化酶基因表達(dá)盒、所述谷氨酸-5-激酶基因表達(dá)盒和所述谷氨 酸-5-半醛脫氫酶基因表達(dá)盒的啟動(dòng)子均可為ara啟動(dòng)子。
[0075] 在本發(fā)明中的一個(gè)實(shí)施例中，所述含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因表達(dá)盒的重組表 達(dá)載體為將重組載體PYBlS的Bgl Π 和EcoR I識(shí)別序列間的DNA片段替換為序列表中SEQ IDNo.2所示的DNA分子得到的重組載體pYBls-p4h。所述重組載體pYBls-p4h表達(dá)SEQID No. 1所示的L-脯氨酸-4-羥化酶。
[0076] 所述重組載體p Y B I S的制備方法如下：以P 1 5 A S a I I _ F : GTCGACGTGCGTCAGCAGAATATGTG和StrSph I_R: ACCTACCAAGGCAACGCTAT為引物，以載體 pACY⑶uet-l(N〇Vagen公司）為模板擴(kuò)增得到含有復(fù)制子和鏈霉素抗性基因的DNA片段，將 該DNA片段命名為ori-aadA;利用引 物araC-TrrnB_sphI_F : GCACATGCATGCAATGTGCCTGTCAAATG和araC-TrrnB_SalI_R: ATATACGCGTCGACGAAAGGCCCAGTCTTTC，從 pBAD-h i sB 擴(kuò)增得到含有 pBAD 啟動(dòng)子、酶切位點(diǎn)和 終止子的DNA片段，將該DNA片段命名為araC-TrrnB。分別用SphI和Sail雙酶切ori-aadA和 araC-TrrnB，將or i-aadA雙酶切得到的大片段和araC-TrrnB雙酶切得到的大片段連接，得 到重組載體PYB1S。重組載體pYBlS的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示。
[0077] 所述含有谷氨酸-5-激酶基因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體和所述含有谷氨酸-5-半醛 脫氫酶基因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體均可為將所述重組載體pYBls-p4h的EcoR I和SacI識(shí)別 序列間的DNA片段替換為序列表中SEQ ID No.4所示的DNA分子得到的重組載體ρΗΒΑ。所述 重組載體PHBA表達(dá)SEQ ID No. 1所示的L-脯氨酸-4-羥化酶、SEQ ID No.3所示的谷氨酸-5-激酶和SEQ ID No.5所示的谷氨酸-5-半醛脫氫酶。所述含有L-脯氨酸-4-羥化酶基因表達(dá) 盒的重組表達(dá)載體也可為所述重組載體ρΗΒΑ。
[0078] 其中，SEQ ID No.4的第1-6位核苷酸為RBS的序列，SEQ ID No.4的第12-1115位核 苷酸為ProB基因的序列，編碼SEQ ID No.3所示的ProB，SEQ ID No.4的第1127-2380位核苷 酸為ProA基因的序列，編碼SEQ ID No. 5所示的ProA。
[0079] 上述方法中，所述對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行A1)、A2)、A3)和A4)的改造可為向α-酮戊二酸 脫氫酶基因缺失細(xì)胞、異檸檬酸裂解酶基因缺失細(xì)胞、脯氨酸脫氫酶缺失細(xì)胞或丙酮酸氧 化酶基因缺失的含有乙酰輔酶A合成酶基因的細(xì)胞中導(dǎo)入所述L-脯氨酸-4-羥化酶基因、所 述谷氨酸-5-激酶基因和所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶基因。
[0080] 所述α-酮戊二酸脫氫酶基因缺失細(xì)胞具體可為國(guó)立遺傳學(xué)研究所的Δ sucA菌 株。所述異檸檬酸裂解酶基因缺失細(xì)胞具體可為國(guó)立遺傳學(xué)研究所的A aceA菌株。所述脯 氨酸脫氫酶缺失細(xì)胞具體可為國(guó)立遺傳學(xué)研究所的A putA菌株。所述丙酮酸氧化酶基因缺 失的含有乙酰輔酶A合成酶基因的細(xì)胞具體可為將大腸桿菌K12的丙酮酸氧化酶基因替換 為乙酰輔酶A合成酶基因得到的重組細(xì)胞，該細(xì)胞的名稱為△ poxB: : acs突變株。
[0081 ] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組細(xì)胞為向所述Δ sucA菌株、所述Δ aceA菌株、 所述Δ putA菌株和所述Δ p〇xB: : acs突變株中導(dǎo)入所述重組載體pHBA得到的重組細(xì)胞
[0082]上述方法中，所述重組細(xì)胞與所述底物在體系R中進(jìn)行反應(yīng)；所述體系R由水、 Tris、FeS〇4、維生素 C和W組成，所述W為α-酮戊二酸(α-KG)、葡萄糖和聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton Χ-100)這三種中的任一種、任兩種或三種。
[0083] 上述方法中，所述體系R為下述體系R1-R8中任一種：
[0084]體系Rl:體系Rl由水和溶質(zhì)組成;所述溶質(zhì)及其濃度分別為IOOmM Tris、0.5-2g/ IOOmL葡萄糖、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至 pH7.0；
[0085] 體系R2:體系R2由水和溶質(zhì)組成;所述溶質(zhì)及其濃度分別為IOOmM Tris、0.5-2g/ IOOmL葡萄糖、4mM FeSCU和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7.0;
[0086] 體系R3:體系R3由水和溶質(zhì)組成;所述溶質(zhì)及其濃度分別為IOOmM Tris、5-100mM α-酮戊二酸、4mM FeS〇4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7.0;
[0087] 體系R4:體系R4由水和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其濃度分別為10011^1^8、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至ρΗ7·0;
[0088] 體系R5:體系R5由水和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其濃度分別為IOOmM Tris、4mM FeS〇4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7.0;
[0089] 體系R6:體系R6由水和溶質(zhì)組成;所述溶質(zhì)及其濃度分別為IOOmM Tris、5-100mM α_酮戊二酸、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至 pH7.0；
[0090] 體系R7:體系R7由水和溶質(zhì)組成;所述溶質(zhì)及其濃度分別為IOOmM Tris、0.5-2g/ IOOmL葡萄糖、5-100mMa-酮戊二酸、4mM FeSCU和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7.0;
[0091] 體系R8:體系R8由水和溶質(zhì)組成;所述溶質(zhì)及其濃度分別為IOOmM Tris、0.5-2g/ IOOmL葡萄糖、5-100mMa-酮戊二酸、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM維生 素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7.0。
[0092] 上述方法中，所述0.5-2g/100mL葡萄糖具體可為0.5-1.5g/100mL葡萄糖或lg/ IOOmL葡萄糖。
[0093] 所述5-100mMa-酮戊二酸具體可為25-100mMa-酮戊二酸或50mMa-酮戊二酸。
[0094] 所述0.05-0.2g/100mL Triton X-100具體可為0.1g/100mL Triton X-100。
[0095] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述重組細(xì)胞。
[0096] 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是如何提高反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量。
[0097] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的成套試劑。 [0098]本發(fā)明所提供的生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的成套試劑，為Dl)或D2):
[0099] Dl)由所述重組細(xì)胞與a)組成的成套試劑；
[0100] 所述a)為α-酮戊二酸、葡萄糖和Triton x-100這三種中的任一種、任兩種或三種；
[0101] D2)由用于構(gòu)建所述的重組細(xì)胞的生物材料與所述a)組成的成套試劑；
[0102]所述用于構(gòu)建所述重組細(xì)胞的生物材料，為Cl)或C2):
[0103] Cl)用于構(gòu)建所述重組細(xì)胞的成套DNA分子，含有所述L-脯氨酸-4-羥化酶基因、所 述谷氨酸-5-激酶基因和所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶基因這三個(gè)基因中的至少一個(gè)基因； [0104] C2)含有Cl)所述成套DNA分子中所述三個(gè)基因、或其中任兩個(gè)基因的載體。
[0105] 上述成套試劑中，所述重組細(xì)胞和所述α-酮戊二酸的配比可為30mg(細(xì)胞濕重）：5 X HT6-IOO Xl(T6m〇l。所述重組細(xì)胞和所述α-酮戊二酸的配比具體可為30mg(細(xì)胞濕重）： 25 X 10-6-100 X 10-6mol或30mg(細(xì)胞濕重）：50 X 10-6mol。
[0106] 所述重組細(xì)胞和所述葡萄糖的配比可為30mg(細(xì)胞濕重）：0.005-0.02g。所述重組 細(xì)胞和所述葡萄糖的配比具體可為30mg(細(xì)胞濕重）：0.005-0.0158或3011^/11^細(xì)胞(細(xì)胞濕 重/體積）：〇.〇lg。
[0107] 所述重組細(xì)胞和所述Triton X-100的配比可為30mg(細(xì)胞濕重）：0.0005-0.002g。 所述重組細(xì)胞和所述Triton X-100的配比具體可為30mg(細(xì)胞濕重）：0.001g。
[0108] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，C2)所述載體為所述重組載體ρΗΒΑ。
[0109] 上述成套試劑中，Cl)所述成套DNA分子由所述L-脯氨酸-4-羥化酶基因、所述谷氨 酸-5-激酶基因、所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶基因和所述乙酰輔酶A合成酶基因組成，這四個(gè) 基因各自獨(dú)立包裝；
[0110] C2)所述載體為含有Cl)所述成套DNA分子中所述四個(gè)基因、或其中任三個(gè)基因、或 其中任兩個(gè)基因的載體。
[0111] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：
[0112] M1、所述重組細(xì)胞在制備反式-4-羥基-L-脯氨酸中的應(yīng)用；
[0113] M2、所述重組細(xì)胞在生物轉(zhuǎn)化谷氨酸或可溶性谷氨酸鹽制備反式-4-羥基-L-脯氨 酸中的應(yīng)用；
[0114] M3、所述成套試劑在制備反式-4-羥基-L-脯氨酸中的應(yīng)用；
[0115] M4、所述成套試劑在生物轉(zhuǎn)化谷氨酸或可溶性谷氨酸鹽制備反式-4-羥基-L-脯氨 酸中的應(yīng)用。
[0116] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述α-酮戊二酸脫氫酶基因和/或所述異 檸檬酸裂解酶基因和/或所述丙酮酸氧化酶基因和/或所述脯氨酸脫氫酶基因的敲除在生 產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸中的應(yīng)用。
[0117] 上文中，所述可溶性谷氨酸鹽可為谷氨酸鈉。
[0118] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)方法一一向?qū)⒋竽c桿菌Κ12的 sucA基因、aceA基因、putA基因敲除或?qū)⒋竽c桿菌Κ12的ροχΒ基因敲除并導(dǎo)入acs基因得到 的重組細(xì)胞中導(dǎo)入P4H基因、proB基因和proA基因，可以提高細(xì)胞轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉得到的反 式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量:大腸桿菌K12菌體反應(yīng)液中無反式-4-羥基-L-脯氨酸，pHBA/ BW菌體(將P4H基因、ProB基因和ProA基因的pHBA導(dǎo)入大腸桿菌Kl 2得到的工程菌)反應(yīng)液中 反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量為10.66 ±0.06mM，pHBA/ Δ putA菌體（向?qū)⒋竽c桿菌K12putA 基因缺失得到的A putA菌株中導(dǎo)入P4H基因、ProB基因和ProA基因得到的工程菌)反應(yīng)液中 反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量為18.13 ± 0.2 ImM，pHBA/ Δ sucA菌體(向?qū)⒋竽c桿菌Kl 2sucA 基因缺失得到的A sucA菌株中導(dǎo)入P4H基因、ProB基因和ProA基因得到的工程菌)反應(yīng)液中 反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量為20.94±0.57mM，pHBA/Δ aceA(向?qū)⒋竽c桿菌K12aceA基因 缺失得到的Δ aceA菌株中導(dǎo)入P4H基因、ProB基因和ProA基因得到的工程菌)菌體反應(yīng)液中 反式-4-羥基-1^-脯氨酸的含量為14.74±0.6111^，？?jī)?cè)4/八 1)〇成：：&(^菌體（向?qū)⒋竽c桿菌 K12poxB基因敲除并導(dǎo)入acs基因得到的突變株ΔροχΒ: :acs中導(dǎo)入P4H基因、ProB基因和 ProA基因得到的工程菌)反應(yīng)液中反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量為13.67±0.4511^。？?jī)?cè)八/ 基-L-脯氨酸分別為pHBA/BW的1.70倍、1.96倍、1.38倍和1.28倍。
[0119] 實(shí)驗(yàn)證明，α-KG可以提高細(xì)胞轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉得到的反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn) 量：當(dāng)轉(zhuǎn)化液中α-KG濃度為OmM時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為5.94±0.14mM;當(dāng)轉(zhuǎn)化 液中α-KG濃度為5mM時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為9.10 ± 0.06mM，為OmMa-KG轉(zhuǎn)化液 的1.53倍；當(dāng)轉(zhuǎn)化液中a-KG濃度為25mM時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為12.91 土 0.3411^，為〇1111€[-隊(duì)轉(zhuǎn)化液的2.17倍；當(dāng)轉(zhuǎn)化液中€ [-隊(duì)濃度為5011^時(shí)，反式-4-羥基-1^-脯氨 酸的產(chǎn)量為18.51 ±0.87mM，為OmMa-KG轉(zhuǎn)化液的3.12倍；當(dāng)轉(zhuǎn)化液中a-KG濃度為IOOmM時(shí)， 反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為15.18 ±0.32mM，為OmMa-KG轉(zhuǎn)化液的2.56倍。
[0120] 實(shí)驗(yàn)證明，葡萄糖可以提高細(xì)胞轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉得到的反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn) 量:當(dāng)轉(zhuǎn)化液為中無葡萄糖時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為5.94±0.14mM;當(dāng)轉(zhuǎn)化液中 葡萄糖濃度為0.5g/100mL時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為13.5 ±0.47mM，為無葡萄糖 的2.27倍;當(dāng)轉(zhuǎn)化液中葡萄糖濃度為1.0g/100mL時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為15.22 ±0.30mM，為無葡萄糖的2.56倍；當(dāng)轉(zhuǎn)化液中葡萄糖濃度為1.5g/100mL時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為13.67 ± 0.35mM，為無葡萄糖的2.30倍；當(dāng)轉(zhuǎn)化液中葡萄糖濃度為2 . Og/ IOOmL時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為10.66 ±0.06mM，為無葡萄糖的1.79倍。
[0121]實(shí)驗(yàn)證明，Triton X-100可以提高細(xì)胞轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉得到的反式-4-羥基-L-脯氨 酸的產(chǎn)量：當(dāng)轉(zhuǎn)化液中無 Tri ton X-100時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為13.67 土 0.35mM;當(dāng)轉(zhuǎn)化液中Triton X-100的濃度為為0. lg/100mL時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn) 量為28·74±0· 13mM，為無 Triton X-100轉(zhuǎn)化液的2· 10倍。
[0122] 實(shí)驗(yàn)證明，可以利用本發(fā)明的反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)方法生產(chǎn)反式-4-羥 基-L-脯氨酸，并可以通過添加 α-KG、葡萄糖和/或Triton X-100提高反式-4-羥基-L-脯氨 酸的產(chǎn)量。
【附圖說明】
[0123] 圖1為重組質(zhì)粒pHBA的示意圖。
[0124] 圖2為工程菌的蛋白表達(dá)SDS-PAGE圖。其中，泳道M為蛋白分子量Marker;泳道1為 pYBl S/BW;泳道 2 為 pYBl S-p4h/BW;泳道 3 為 pHBA/BW。
[0125] 圖3為基因改造過的工程菌株蛋白表達(dá)SDS-PAGE圖。其中，泳道M為蛋白分子量 Marker;泳道 1 為pHBA/BW;泳道2為pHBA/ Δ sucA;泳道3為pHBA/ Δ aceA;泳道4為pHBA/ Δ poxB: :acs;泳道5為pHBA/AputA。
[0126] 圖4為Hyp標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0127] 圖5為不同工程菌株的反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量。其中，pYBls/BW表示pYBlS/ Bff0
[0128] 圖6為α-酮戊二酸(α-KG)對(duì)反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量的影響。
[0129] 圖7為葡萄糖對(duì)反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量的影響。
[0130] 圖8為在最優(yōu)條件下利用重組細(xì)胞制備反式-4-羥基-L-脯氨酸的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0131]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。
[0132] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0133] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0134] 下述實(shí)施例中的大腸桿菌K12(Tomoya Baba,Takeshi Ara,Miki Hasegawa,Yuki Takai,Yoshiko Okumura,Miki Baba , Kiri 11 A Datsenko,Masaru Tomita, Barry L Wanner,and Hirotada Mori I. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants:the Keio collection.Molecular Systems Biology (2006) :1-11.)公眾可從中國(guó)科學(xué)院微生物研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相 關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0135] 下述實(shí)施例中的AputA菌株（JW0999)(國(guó)立遺傳學(xué)研究所（NIG，Japan)產(chǎn)品） (Baba,Tomoya,et al·"Construction of Escherichia coli K-12 in-frame , single-gene knockout mutants : the Keio collection·"Molecular systems biology 2.1 (2006).)是大腸桿菌K12的putA基因缺失菌株，putA基因編碼序列表中SEQ ID No.8所示的 脯氨酸脫氫酶。
[0136] 下述實(shí)施例中的AsucA菌株(為國(guó)立遺傳學(xué)研究所(NIGJapan)產(chǎn)品，NIG編號(hào)為 JW0715)(Baba et al.，2006)是將大腸桿菌K12的α-酮戊二酸脫氫酶基因（sucA)替換為兩 端帶有FRT位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因（約1300bp)從而將大腸桿菌Kl2的sucA敲除(缺失）的 大腸桿菌K12突變體，其基因型為AsucA: =Kanc3SucA編碼SEQ ID Νο·7所示的蛋白質(zhì)，sucA 的編碼序列如SEQ ID No. 13所示。引物對(duì)sucA_up550F(AACCTCTTGTCCGTCTTTCTG)和sucA_ down353R(CGCATCGTTGTTTTGCTC)從Δ sucA菌株的基因組DNA中擴(kuò)增得到一個(gè)約2200bp的片 段，從大腸桿菌K12的基因組DNA中擴(kuò)增得到一個(gè)約3705bp的片段。其中，sucA_up550F和 sucA_down353R引物結(jié)合位置分別是大腸桿菌1(12的811〇六基因的上游55(^口和下游35(^卩附 近區(qū)域。測(cè)序分析結(jié)果表明A sucA菌株的基因組上沒有sucA。
[0137] 下述實(shí)施例中的AaceA菌株(為國(guó)立遺傳學(xué)研究所(NIG Japan)產(chǎn)品，NIG編號(hào)為 JW3975)(Baba et al.，2006)是將大腸桿菌K12的異檸檬酸裂合酶基因（aceA)替換為兩端 帶有FRT位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因從而將大腸桿菌K12的異檸檬酸裂合酶基因（aceA)敲除 (缺失）的大腸桿菌K12突變體，其基因型為AaceA^Kan。異檸檬酸裂合酶基因（aceA)位于 大腸桿菌K12基因組4217109..4218413的位置，其編碼序列為SEQ ID No. 14,編碼SEQ ID No. 9 所示的異檸檬酸裂合酶。用引物對(duì) aceA_up380_F: GTGAACGCACCGAAGAAGG 和 aceA_d700_ R:GTCAGATGGCGAATAATGTAATGGA從Δ aceA菌株的基因組DNA中擴(kuò)增得到一個(gè)約2500bp的片 段，從大腸桿菌K12的基因組DNA中擴(kuò)增得到一個(gè)約2429bp的片段。其中，引物結(jié)合位置分別 是大腸桿菌K12的aceA基因的上游和下游區(qū)域。測(cè)序分析結(jié)果表明AaceA菌株的基因組上 沒有aceA。
[0138] 下述實(shí)施例中的5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基為無菌培養(yǎng)基，其配制方法如下：IOOmL A+2mL B+2mL C+200y-L D+lOOy-L E；
[0139] A為ZY溶液，ZY溶液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為：I % (質(zhì)量百分比 濃度)胰蛋白胨和〇. 5 % (質(zhì)量百分比濃度)酵母粉；
[0140] B為50 X M溶液，50 X M溶液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為：1.25M Na2HP〇4，1.25M KH2P〇4,2.5M NH4Cl和0.25M Na2S〇4;
[0141] C為50 X 5052溶液，50 X 5052溶液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為： 25% (質(zhì)量百分比濃度)甘油，2.5% (質(zhì)量百分比濃度)葡萄糖，10% (質(zhì)量百分比濃度)L-阿 拉伯糖；
[0142] D為IM MgS〇4水溶液；
[0143] E為1000X微量元素溶液，1000 X微量元素溶液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃 度分別為：50mM FeCl3，20mM CaCl2，IOmM MnCl2, IOmM ZnS〇4,2mM CoCl2，2mM NiCl2，2mM Na2M〇4,2mM Na2Se〇3,2mM H3BO3D
[0144] 實(shí)施例1、重組細(xì)胞的制備
[0145] 1、重組載體pHBA的構(gòu)建
[0146] 構(gòu)建表達(dá)L-脯氨酸-4-羥化酶(P4H)、谷氨酸-5-激酶(ProB)和谷氨酸-5-半醛脫氫 酶(ProA)的重組載體，P4H的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示，P4H由SEQ ID No.2 所示的P4H基因編碼，ProB的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示，ProA的氨基酸序列 如序列表中SEQ ID No.5所示，ProB由SEQ ID No.4的第12-1115位核苷酸所示的ProB基因 編碼，ProA由SEQ ID No.4的第1127-2380位核苷酸所示的ProA基因編碼。具體方法如下：
[0147] 制備名稱為pYBIS的載體：以P15ASal I_F:GTCGACGTGCGTCAGCAGAATATGTG和 StrSph I_R: ACCTACCAAGGCAACGCTAT為引物，以載體pACYCDuet-1 (Novagen公司）為模板擴(kuò) 增得到含有復(fù)制子和鏈霉素抗性基因的DNA片段，將該DNA片段命名為ori-aadA;利用引物 araC-TrrnB_sphI_F:GCACATGCATGCAATGTGCCTGTCAAATG和araC-TrrnB_SalI_R: ATATACGCGTCGACGAAAGGCCCAGTCTTTC，從pBAD-hisB(invitrogen公司，貨號(hào)：V430-01)擴(kuò)增 得到含有PBAD啟動(dòng)子、酶切位點(diǎn)和終止子的DNA片段，將該DNA片段命名為araC-TrrnB。分別 用SphI和Sal I雙酶切ori-aadA和araC-TrrnB，將or i-aadA雙酶切得到的大片段和araC-TrrnB雙酶切得到的大片段連接，得到重組載體PYBlSt3PYBlS的核苷酸序列如SEQ ID No. 15 所示。SEQ ID No. 15中，第1667-3450位為復(fù)制子和鏈霉素抗性基因，第86-1660位為pBAD啟 動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和終止子。
[0148] 將重組載體pYBIS的Bgin和EcoR I識(shí)別序列間的DNA片段替換為序列表中SEQ ID No. 2所示的DNA分子（即P4H基因），得到重組載體pYBI s-p4h。重組載體pYBl s-p4h表達(dá)SEQ ID No. 1所示的Pfflt3PYBls-Ptt和pYBIS的差別僅在于：pYBls-p4h為將pYBls的Bgl Π 和 EcoR I識(shí)別序列間的DNA片段替換為序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子得到的重組載 體。
[0149] 將重組載體pYBls_p4h的EcoR I和SacI識(shí)別序列間的DNA片段替換為序列表中SEQ 10如.4所示的0嫩分子，得到重組載體?耶4(圖1)。？耶4和?￥818-?411的差別僅在于:？?jī)?cè)八為 將pYBls-p4h的EcoR I和SacI識(shí)別序列間的DNA片段替換為序列表中SEQ ID No.4所示的 DNA分子得到的重組載體。重組載體pHBA表達(dá)SEQ ID No. 1所示的P4H、SEQ ID No. 3所示的 ProB和SEQ ID No .5所示的ProA。
[0150] 其中，SEQ ID No.4的第2-6位核苷酸為RBS的序列，SEQ ID No.4的第12-1115位核 苷酸為ProB基因的序列，編碼SEQ ID No.3所示的ProB，SEQ ID No.4的第1127-2380位核苷 酸為ProA基因的序列，編碼SEQ ID No. 5所示的ProA。
[0151] 2、重組細(xì)胞的構(gòu)建
[0152] 2.1 突變株 Δρ0ΧΒ: :acs的構(gòu)建
[0153]首先構(gòu)建大腸桿菌K12的突變株Δ p〇xB: :acs，Δ p〇xB: :acs突變株為將大腸桿菌 K12的丙酮酸氧化酶(PoxB)編碼基因替換為乙酰輔酶A合成酶(Acs)編碼基因的菌株。Δ poxB: :acs突變株的構(gòu)建如下：
[0154] (1)宿主菌的制備：
[0155]將pKD46質(zhì)粒(Clontech公司產(chǎn)品）通過氯化鈣轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌K12,得到含 有質(zhì)粒PKD46的重組大腸桿菌K12/pKD46。重組大腸桿菌K12/pKD46在阿拉伯糖誘導(dǎo)后，表達(dá) λ噬菌體的3個(gè)重組蛋白，宿主菌就具有了同源重組的能力。
[0156] (2)poxBup-FumA-acs_kan-poxBdown 片段的制備：
[0157] poxBup-FumA-acs-kan-poxBdown片段的核苷酸序列如SEQIDNo·6，由3970個(gè)核 苷酸組成，含有(a)大腸桿菌FumA啟動(dòng)子(SEQ ID No.6第62-195位）、（b)大腸桿菌乙酰CoA 合成酶基因（acs) (SEQ ID No. 6第216至2177位（由1962個(gè)核苷酸組成））、（C)TrrnB終止子 (SEQ ID如.6第2184-2440位）、（(1)帶?1?1'側(cè)翼的卡那霉素抗性基因 $1?1'-1?11141?1')(卡那霉 素抗性基因如SEQ ID Νο·6第2858-3652位，F(xiàn)RT序列為： gaagttcctatactttctagagaataggaacttcg，F(xiàn)RT-kan_FRT的核苷酸序列如SEQ ID No · 6第 2450 - 3877位）、（e)poxB的上游同源臂poxBup(SEQ ID 如.6第1-61位）、（〇?(?8的下游同 源臂poxBdown(SEQ ID 吣.6第3907-3970位）。
[0158] (3)同源重組：
[0159] 將SEQ ID 1^〇.6所不的口(《13卯-?1111^-&〇8-1^11-口(《13(1〇￥11片段電轉(zhuǎn)入重組大腸桿菌 K12/pKD46的感受態(tài)細(xì)胞，利用卡那霉素平板(卡那霉素的濃度為50μg/ml)篩選到陽性轉(zhuǎn)化 體一將poxBup-FumA-acs-kan-poxBdown轉(zhuǎn)入重組大腸桿菌K12/pKD46得到的重組大腸桿 菌，命名為 Δ p〇xB: :acs突變株。用poxB_up_480_F(TGGGTAGAGCAGGAAGTGAAA)和poxB_down_ 410_r (TGCGGGCGAAATGGA)進(jìn)行PCR驗(yàn)證，從Δ ρ〇χΒ: : acs突變株的基因組DNA中擴(kuò)增得到一 個(gè)約4500bp的片段，從大腸桿菌K12的基因組DNA中擴(kuò)增得到一個(gè)約2600bp的片段。其中，弓丨 物結(jié)合位置分別是大腸桿菌K12的poxB基因的上游和下游區(qū)域。測(cè)序分析結(jié)果表明Δ poxB: :acs突變株的基因組上沒有丙酮酸氧化酶基因（ροχΒ)，Δ p〇xB: :acs突變株的基因組 上含有SEQ ID吣.6所示的?1111^-3〇8-1?111片段。
[0160] 2.2突變株 AsucA AputA的構(gòu)建
[0161] 具體采用如下Pl噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法構(gòu)建：
[0162] (1)將Δ sucA的FRT位點(diǎn)之間的卡那霉素抗性基因刪除，消除Δ sucA的卡那霉素抗 性，得到大腸桿菌突變體Δ sucAAkan(簡(jiǎn)稱Δ sucAAkan)。具體如下:首先，利用表達(dá)Flp重 組酶的質(zhì)粒pCP20(Clontech公司）化學(xué)轉(zhuǎn)化Δ sucA，將Δ sucA的FRT位點(diǎn)之間的卡那霉素抗 性基因刪除，消除A sucA的卡那霉素抗性，得到大腸桿菌突變體△ sucAAkan(簡(jiǎn)稱△ sucA Akan)。以Δ sucAAkan的基因組DNA為模板，用弓丨物對(duì)sucA_up550F (AACCTCTTGTCCGTCTTTCTG)和 sucA_down353R(CGCATCGTTGTTTTGCTC)進(jìn)行 PCR 驗(yàn)證，擴(kuò)增得 到一個(gè)約1000 bp的片段，結(jié)果表明卡那霉素抗性已經(jīng)消除?！?sucAAkan在涂有卡那霉素的 LB平板(卡那霉素的濃度為50μg/ml)上不生長(zhǎng)，表明已經(jīng)消除Δ sucA的卡那抗性。
[0163] (2)將AsucAAkan的脯氨酸脫氫酶(PutA)替換為卡那霉素抗性基因得到的突變 體Δ sucA Δ putA。具體如下：（a)獲得供體菌的Pl:將供體菌Δ putA接種于含IOmmo 1/L MgCl2、5mmol/L CaCl2和0.1%葡萄糖的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)lh，加入野生型Pl噬菌體，培養(yǎng)l-3h。加幾滴氯仿再搖幾分鐘，離心取上清即得到噬菌體Pl VirΛputA。（b)利用Pl噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo) 技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌敲除株P(guān)G03，具體步驟如下:過夜培養(yǎng)△ sucAAkan(受體菌），1.5mL菌液 1000 Og離心2分鐘后，用0.75mL的Pl鹽溶液(溶劑為水，溶質(zhì)為IOmM CaCl2和5mM MgS〇4)重懸 厶8此4厶1?111細(xì)胞，將10(^1^噬菌體？1￥化厶口此4與10(^1^ 8此4厶1?111細(xì)胞懸浮液混合，孵育 30min，用Iml LB和200yL檸檬酸鈉，37°C繼續(xù)培養(yǎng)Ih，離心收集，用IOOyL LB重懸后，涂布含 卡那霉素的LB平板(卡那霉素的濃度為50μg/ml)上，篩選陽性克隆（能在該含卡那霉素的平 板上生長(zhǎng)的克?。┘碢G03，以陽性克隆Δ sucA Δ putA的基因組DNA為模板，用putA_up604_f putA的基因組DNA中擴(kuò)增得到一個(gè)約1000 bp的片段。測(cè)序結(jié)果表明Δ sucA Δ putA是將Δ sucAAkan的脯氨酸脫氫酶(PutA)替換為卡那霉素抗性基因得到的突變體。
[0164] 2.2重組細(xì)胞的構(gòu)建
[0165] 將步驟1的重組載體pHBA分別導(dǎo)入大腸桿菌K12及Λ putA菌株、Λ sucA菌株、Λ aceA菌株、Δ ρ〇χΒ: :acs和Δ sucA Δ putA突變株中，分別得到含有重組載體ρΗΒΑ的工程菌株 Λ sucA Λ putA〇
[0166] 將步驟1中的重組載體pYBIS和pYBls-p4h分別導(dǎo)入大腸桿菌K12中，得到含有目的 載體的重組細(xì)胞pYBIS/BW和pYBls-p4h/BW。
[0167] 分別將 pYBlS/BW、pYBls-p4h/BW、pHBA/BW、pHBA/AputA、pHBA/ASucA、pHBA/A aceA和ρΗΒΑ/Δρ 0ΧΒ: :acs于5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中、在30°C下進(jìn)行培養(yǎng)，并用SDS-PAGE電泳 分析各重組細(xì)胞中蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖2和圖3所示。結(jié)果顯示，pYBl S/BW不表達(dá)P4H、Pr〇B 和ProA;pYBls_p4h/BW表達(dá)P4H，不表達(dá)ProB和ProA;pHBA/BW、pHBA/AputA、pHBA/A sucA、 pHBA/AaceA和ρΗΒΑ/Δρ〇χΒ: :acs均表達(dá)P4H、ProB和ProA。
[0168] 實(shí)施例2、利用實(shí)施例1的重組細(xì)胞制備反式-4-羥基-L-脯氨酸
[0169] 利用實(shí)施例1的重組細(xì)胞制備反式-4-羥基-L-脯氨酸，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次重復(fù)實(shí) 驗(yàn)的具體步驟如下：
[0170] 從平板上挑取pHBA/BW的單菌落于LB培養(yǎng)基中，于37 °C、220rpm下培養(yǎng)IOh，得到 pHBA/BW菌液；按照1 %接種量將pHBA/BW菌液接種于5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于30°C、220rpm 下培養(yǎng)16h，得到pHBA/BW培養(yǎng)液;將pHBA/BW培養(yǎng)液于4°C、4200rpm下離心10min，棄上清液， 得到pHBA/BW粗菌體。用氯化鈉質(zhì)量百分濃度為0.85%的氯化鈉水溶液洗滌pHBA/BW粗菌體 2次，每次均在4 °C、420Or pm下離心10m i η，收集菌體，得到pHBA/BW菌體。
[0171] 將pHBA/BW菌體重懸于ImL轉(zhuǎn)化液(轉(zhuǎn)化液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分 別為IOOmM Tris、50mM谷氨酸鈉（生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號(hào)：A602012)、 1.5g/100mL葡萄糖、4mM FeS〇4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7.0)中，得到反式-4-羥 基-L-脯氨酸的制備體系，反式-4-羥基-L-脯氨酸的制備體系pHBA/BW的濃度為300D/mL (30mg/mL細(xì)胞(細(xì)胞濕重/體積））；將反式-4-羥基-L-脯氨酸的制備體系于30°C、250rpm下 孵育12h，得到pHBA/BW菌體反應(yīng)液，用氯胺T法測(cè)定pHBA/BW菌體反應(yīng)液中反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量。
[0172] 按照如下氯胺T法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線、測(cè)定反式-4-羥基-L-脯氨酸含量，用到的標(biāo)準(zhǔn)品 為反式-4-羥基-L-脯氨酸(阿拉丁公司，產(chǎn)品編號(hào)Hll100 5):
[0173] (1)將樣品按照一定比例稀釋后，取100μ 1于2mL離心管中，向離心管中加入200μ 1 異丙醇和100μ1氧化劑溶液(氧化劑溶液為將7% (質(zhì)量百分比濃度)氯胺T水溶液與醋酸-檸 檬酸緩沖液(pH 6.0)按照1:4的體積比混合得到的溶液，其中，醋酸-檸檬酸緩沖液(ρΗ6.0) 由水與溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為34.4g/L無水醋酸鈉、37.5g/L二水合檸檬酸鈉、 5.5g/L-水合梓檬酸和385mL/L異丙醇）。
[0174] (2)搖勻，室溫放置4分鐘；向離心管中加入200μ1新配制的艾氏試劑(艾氏試劑由 對(duì)二甲氨基苯甲醛、高氯酸與異丙醇組成，艾氏試劑中各物質(zhì)的比例關(guān)系為:二甲氨基苯甲 醛:高氯酸：異丙醇=Img: 4mL: 6mL)，搖勻，置于60 °C水浴中20分鐘，自來水冷卻至室溫;于 560nm處檢測(cè)吸光值。
[0175] Hyp標(biāo)準(zhǔn)曲線的結(jié)果如表1，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 10.6x+0.0845，R2 = 0.9988_4)。
[0176] 表l、Hyp標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0178] 按照上述方法，將pHBA/BW分別替換為大腸桿菌K12、pYBlS/BW、pYBls-p4h/BW、 pHBA/AputA、pHBA/A sucA、pHBA/AaceA和ρΗΒΑ/Δρ〇χΒ: :acs，其他步驟均不變，分別檢測(cè) 大腸桿菌K12菌體反應(yīng)液、pYBIS/BW菌體反應(yīng)液、pYBI s_p4h/BW菌體反應(yīng)液、ρΗΒΑ/ Δ putA菌 體反應(yīng)液、pHBA/AsucA菌體反應(yīng)液、pHBA/AaceA菌體反應(yīng)液和ρΗΒΑ/Δρ〇χΒ: :acs菌體反 應(yīng)液中反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量。
[0179] 結(jié)果（圖5)顯示，大腸桿菌Kl 2菌體反應(yīng)液中無反式-4-羥基-L-脯氨酸，pHBA/BW菌 體反應(yīng)液中反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量為10.66 ± 0.06mM，pYBl S/BW菌體反應(yīng)液中反式- 4-羥基-L-脯氨酸的含量為0.06 ± 0.02mM，pYBl s-p4h/BW菌體反應(yīng)液中反式-4-羥基-L-脯 氨酸的含量為〇. 79 ± 0.07mM，ρΗΒΑ/Δ putA菌體反應(yīng)液中反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量為 18.13±0.211111，口冊(cè)厶/&811〇厶菌體反應(yīng)液中反式-4-羥基-1^-脯氨酸的含量為20.94± 0.57mM，ρΗΒΑ/ Δ aceA菌體反應(yīng)液中反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量為14.74 ± 0.6 ImM，ρΗΒΑ/ 八卩(《13::3〇8菌體反應(yīng)液中反式-4-羥基-1^-脯氨酸的含量為13.67±0.4511^[。表明4￥1315/ BW轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉幾乎不產(chǎn)生反式-4-羥基-L-脯氨酸，pYBls-p4h/BW轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉可產(chǎn)生極 少量的反式-4-羥基-L-脯氨酸，pHBA/BW轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉產(chǎn)生的反式-4-羥基-L-脯氨酸分別 為pYB I s/BW和pYB I s-p4h/BW的178倍和13.43倍，表明，P4H、ProB和ProA可以大幅度提高大 腸桿菌K12轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉得到的反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量；pHBA/AputA、ρΗΒΑ/Δ 81^4冊(cè)4/八3064和口冊(cè)4/八口0113::308轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉產(chǎn)生的反式-4-羥基-]^-脯氨酸分別 為pHBA/BW的1.70倍、1.96倍、1.38倍和1.28倍，表明，SUcA基因、aceA基因和PUtA基因的缺 失可以提高大腸桿菌K12轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉得到的反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量，poxB基因的 缺失與acs基因的導(dǎo)入也可以提高大腸桿菌K12轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉得到的反式-4-羥基-L-脯氨 酸的產(chǎn)量。
[0180] 實(shí)施例3、利用重組細(xì)胞制備反式-4-羥基-L-脯氨酸條件的優(yōu)化
[0181] 1、α-酮戊二酸(a-KG)對(duì)反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量的影響
[0182] 根據(jù)實(shí)施例2的利用重組細(xì)胞制備反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法，將pHBA/BW替換 為ρΗΒΑ/ △ putA，并將轉(zhuǎn)化液分別替換為OmMa-KG轉(zhuǎn)化液(OmMa-KG轉(zhuǎn)化液由超純水和溶質(zhì)組 成，溶質(zhì)及其濃度分別為IOOmM Tris、50mM谷氨酸鈉、4mM FeSO4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié) pH至pH7.0)、5mMa-KG轉(zhuǎn)化液(5mMa-KG轉(zhuǎn)化液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為 5mMa-KG、IOOmM Tris、50mM谷氨酸鈉、4mM FeS〇4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7 · 0)、 2 5mMa -KG轉(zhuǎn)化液（2 5mMa -KG轉(zhuǎn)化液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為2 5mMa -KG、 IOOmM Tris、50mM谷氨酸鈉、4mM FeS〇4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7 · 0)、50mMa-KG轉(zhuǎn) 化液(50mMa-KG轉(zhuǎn)化液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為50mMa-KG、IOOmM Tris、 50mM谷氨酸鈉、4mM FeS〇4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7 · 0)、IOOmMa-KG轉(zhuǎn)化液（IOOmM 〇-隊(duì)轉(zhuǎn)化液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為10011^€[-1^、10011^1^8、5011^谷氨 酸鈉、4mM FeS04和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7.0)，其他步驟均不變，分別檢測(cè)不同濃 度的α-KG對(duì)反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖6所示。
[0183] 結(jié)果顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)化液為OmMa-KG轉(zhuǎn)化液時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為5.94 土 0.14mM;當(dāng)轉(zhuǎn)化液為5mMa-KG轉(zhuǎn)化液時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為9.10 ± 0.06mM，為 OmMa-KG轉(zhuǎn)化液的1.53倍;當(dāng)轉(zhuǎn)化液為25mMa-KG轉(zhuǎn)化液時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為 12.91±0.34禮，為〇!111€1-1?轉(zhuǎn)化液的2.17倍 ；當(dāng)轉(zhuǎn)化液為5〇1111€1-隊(duì)轉(zhuǎn)化液時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為18.51 ± 0.87mM，為OmMa-KG轉(zhuǎn)化液的3.12倍；當(dāng)轉(zhuǎn)化液為IOOmMa-KG轉(zhuǎn)化 液時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為15.18± 0.32mM，為OmMa-KG轉(zhuǎn)化液的2.56倍。結(jié)果表 明，當(dāng)向轉(zhuǎn)化液中加入a-KG時(shí)，可以提高反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量，當(dāng)轉(zhuǎn)化液中a-KG的 濃度為50mM時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量最高。
[0184] 2、葡萄糖對(duì)反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量的影響
[0185] 根據(jù)實(shí)施例2的利用重組細(xì)胞制備反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法，將pHBA/BW替換 為pHBA/ △ putA，并將轉(zhuǎn)化液分別替換為0葡萄糖轉(zhuǎn)化液(0葡萄糖轉(zhuǎn)化液由超純水和溶質(zhì)組 成，溶質(zhì)及其濃度分別為IOOmM Tris、50mM谷氨酸鈉、4mM FeSO4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié) pH至pH7.0)、0.5g/100mL葡萄糖轉(zhuǎn)化液(0.5g/100mL葡萄糖轉(zhuǎn)化液由超純水和溶質(zhì)組成，溶 質(zhì)及其濃度分別為〇.5g/100mL葡萄糖、IOOmM Tris、50mM谷氨酸鈉、4mM FeSCU和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7.0)、1.0g/100mL葡萄糖轉(zhuǎn)化液（I.0g/100mL葡萄糖轉(zhuǎn)化液由超純水 和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為l.〇g/l〇〇mL葡萄糖、IOOmM Tris、50mM谷氨酸鈉、4mM FeS〇4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7 ·0)、1 · 5g/100mL葡萄糖轉(zhuǎn)化液（1 · 5g/100mL葡萄 糖轉(zhuǎn)化液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為1.5g/100mL葡萄糖、IOOmM Tris、50mM 谷氨酸鈉、4mM FeS〇4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7.0)、2.0g/100mL葡萄糖轉(zhuǎn)化液 (2.0g/100mL葡萄糖轉(zhuǎn)化液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為2.0g/100mL葡萄糖、 IOOmM Tris、50mM谷氨酸鈉、4mM FeS〇4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7.0)，其他步驟均 不變，分別檢測(cè)不同濃度的葡萄糖對(duì)反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖7所示。
[0186] 結(jié)果顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)化液為0葡萄糖轉(zhuǎn)化液時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為5.94 土 0 · 14mM;當(dāng)轉(zhuǎn)化液為0 · 5g/100mL葡萄糖轉(zhuǎn)化液時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為13 · 5 土 0.47mM，為0葡萄糖轉(zhuǎn)化液的2.27倍；當(dāng)轉(zhuǎn)化液為1.0g/100mL葡萄糖轉(zhuǎn)化液時(shí)，反式-4-羥 基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為15.22±0.3mM，為0葡萄糖轉(zhuǎn)化液的2.56倍；當(dāng)轉(zhuǎn)化液為1.5g/100mL 葡萄糖轉(zhuǎn)化液時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為13.67 ±0.35mM，為0葡萄糖轉(zhuǎn)化液的 2.30倍；當(dāng)轉(zhuǎn)化液為2.0g/100mL葡萄糖轉(zhuǎn)化液時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為10.66 土 0.06mM，為0葡萄糖轉(zhuǎn)化液的1.79倍。結(jié)果表明，當(dāng)向轉(zhuǎn)化液中加入葡萄糖時(shí)，可以提高反 式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量，當(dāng)轉(zhuǎn)化液中葡萄糖的濃度為1.0g/100mL時(shí)，反式-4-羥基-L-腫氣酸的廣量最尚。
[0187] 3、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)對(duì)反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量的影響
[0188] 根據(jù)實(shí)施例2的利用重組細(xì)胞制備反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法，將pHBA/BW替換 為pHBA/ Δ putA，并將轉(zhuǎn)化液分別替換為OTriton X-100轉(zhuǎn)化液(OTriton X-100轉(zhuǎn)化液由超 純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為1.5g/100mL葡萄糖、IOOmM Tris、50mM谷氨酸鈉、4mM FeS〇4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7 · 0)、0 · lg/100mL Triton X-100轉(zhuǎn)化液（0 · lg/ IOOmL Triton X-IOO轉(zhuǎn)化液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為O.lg/lOOmL Triton X-100、l .5g/100mL葡萄糖、IOOmM Tris、50mM谷氨酸鈉、4mM FeS〇4和8mM維生素 C， 用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7.0)，其他步驟均不變，分別檢測(cè)不同濃度的Triton X-100對(duì)反式-4-羥 基-L-腫氨酸廣量的影響。
[0189] 結(jié)果顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)化液為OTriton X-100轉(zhuǎn)化液時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量為 13.67 ±0.35mM;當(dāng)轉(zhuǎn)化液為0. lg/100mL Triton X-100轉(zhuǎn)化液時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸 的產(chǎn)量為28.74 ±0.13mM，為OTriton X-100轉(zhuǎn)化液的2.10倍。結(jié)果表明，當(dāng)向轉(zhuǎn)化液中加入 Triton X-100時(shí)，可以提高反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量，當(dāng)轉(zhuǎn)化液中Triton X-100的質(zhì) 量百分比濃度為0.1 gAOOmL時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量最高。
[0190] 4、優(yōu)化后的反應(yīng)液的反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量
[0191] 從平板上挑取ρΗΒΑ/ Δ putA的單菌落于LB培養(yǎng)基中，于37°C、220rpm下培養(yǎng)10h，得 到pHBA/ Δ putA菌液;按照1 %接種量將pHBA/ Δ putA菌液接種于5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于30 °C、220rpm下培養(yǎng)16h，得到ρΗΒΑ/ Δ putA培養(yǎng)液;將ρΗΒΑ/ Δ putA培養(yǎng)液冰浴IOmin后于4°C、 4200rpm下離心10min，棄上清液，得到ρΗΒΑ/ Δ putA粗菌體。用氯化鈉質(zhì)量百分濃度為 0.85%的氯化鈉水溶液洗滌ρΗΒΑ/ Δ putA粗菌體2次，每次均在4°C、4200rpm下離心10min， 收集菌體，得到ρΗΒΑ/Δ putA菌體。
[0192] 將ρΗΒΑ/ Δ putA菌體重懸于ImL轉(zhuǎn)化液1 (轉(zhuǎn)化液1由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其 濃度分別為IOOmM Tris、50mM谷氨酸鈉、1.5g/100mL葡萄糖、O.lg/lOOmL Triton X-100、 4mM FeS〇4和8mM維生素 C，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7.0)中，得到反式-4-羥基-L-脯氨酸的制備體 系，反式-4-羥基-L-脯氨酸的制備體系中pHBA/AputA的濃度為300D/mL(即30mg/mL細(xì)胞 (細(xì)胞濕重/體積））；將反式-4-羥基-L-脯氨酸的制備體系于30°C、250rpm下孵育12h，得到 ρΗΒΑ/ Δ putA菌體反應(yīng)液1，用氯胺T法測(cè)定ρΗΒΑ/ Δ 口此4菌體反應(yīng)液1中反式-4-羥基-1^-脯 氨酸的含量。
[0193] 結(jié)果顯示，ρΗΒΑ/ Δ putA菌體反應(yīng)液1中反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量為28.7mM， 為轉(zhuǎn)化液為I .〇g/l〇〇mL葡萄糖轉(zhuǎn)化液時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量的1.89倍，為轉(zhuǎn)化 液為〇. IgAOOmL Triton X-100轉(zhuǎn)化液時(shí)，反式-4-羥基-L-脯氨酸的產(chǎn)量的1.025倍。
[0194] 實(shí)施例4、在最優(yōu)條件下利用重組細(xì)胞制備反式-4-羥基-L-脯氨酸
[0195] 根據(jù)實(shí)施例2的利用重組細(xì)胞制備反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法，將pHBA/BW分別 替換為ρΗΒΑ/ Δ SUcA、pHBA/ Δ putA和ρΗΒΑ/ Δ sucA Δ putA。轉(zhuǎn)化液由超純水和溶質(zhì)組成，溶 質(zhì)及其濃度分別為IOOmM Tris、50mM谷氨酸鈉、4mM FeS〇4、8mM維生素 C、1.0g/100mL葡萄糖 和0. lg/100mL Triton X-100，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至pH7.0。其他步驟均不變，分別檢測(cè)反式-4-羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量(圖8)。
[0196] 結(jié)果顯示，最優(yōu)轉(zhuǎn)化液條件下，pHBA/BW菌體反應(yīng)液中反式-4-羥基-L-脯氨酸的含 量為16.74±0.37mM，ρΗΒΑ/ Δ sucA菌體反應(yīng)液中反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量為22.35 土 0.99mM，為pHBA/BW菌體反應(yīng)液產(chǎn)量的1.34倍。ρΗΒΑ/ Δ putA菌體反應(yīng)液中反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量為39.80 ± 0.53mM，為pHBA/BW菌體反應(yīng)液產(chǎn)量的2.38倍。ρΗΒΑ/ Δ sucA Δ putA 菌體反應(yīng)液中反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量為17.79 ± 0.47mM，為pHBA/BW菌體反應(yīng)液產(chǎn)量 的1.06倍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產(chǎn)方法，包括利用重組細(xì)胞與底物進(jìn)行反應(yīng)得到反式-4_羥基-L-脯氨酸； 所述重組細(xì)胞的構(gòu)建方法，包括對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行Al)、A2)、A3)和A4)的改造得到重組細(xì) 胞的步驟： A1)向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入L-脯氨酸-4-羥化酶基因； A2)向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入谷氨酸-5-激酶基因； A3)向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入谷氨酸-5-半醛脫氫酶基因； 八4)為如下131)、132)、133)和134)這四種中的任一種、任兩種、任二種或四種： B1)將所述受體細(xì)胞的α -酮戊二酸脫氫酶基因敲除； Β2)將所述受體細(xì)胞的異檸檬酸裂解酶基因敲除； Β3)為如下Β31)和Β32): Β31)將所述受體細(xì)胞的丙酮酸氧化酶基因敲除； Β32)向所述受體細(xì)胞中導(dǎo)入乙酰輔酶Α合成酶基因； B4)將所述受體細(xì)胞的脯氨酸脫氫酶基因敲除； 所述受體細(xì)胞為微生物細(xì)胞、非人動(dòng)物細(xì)胞或植物細(xì)胞。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述受體細(xì)胞為大腸桿菌。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述底物為谷氨酸或/和可溶性谷氨酸 鹽。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于:所述L-脯氨酸-4-羥化酶是如下G1) 或G2)的蛋白質(zhì)： G1)氨基酸序列是SEQ ID No.l的蛋白質(zhì)； G2)在SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸殘基得到的具有所述L-脯氨酸-4-羥化酶功能的由G1)衍生的蛋白質(zhì)； 所述谷氨酸-5-激酶是下述H1)或H2)的蛋白質(zhì)： H1)氨基酸序列為SEQ ID No.3的蛋白質(zhì)； H2)在SEQ ID No.3所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸殘基得到的具有所述谷氨酸-5-激酶功能的由H1)衍生的蛋白質(zhì)； 所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶是下述I 1)或12)的蛋白質(zhì)： 11) 氨基酸序列為SEQ ID No.5的蛋白質(zhì)； 12) 在SEQ ID No.5所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸殘基得到的具有所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶功能的由I 1)衍生的蛋白質(zhì)； 所述α -酮戊二酸脫氫酶是下述J1)或J2)的蛋白質(zhì)： J1)氨基酸序列為SEQ ID No.7的蛋白質(zhì)； J2)在SEQ ID No.7所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸殘基得到的具有所述α-酮戊二酸脫氫酶功能的由J1)衍生的蛋白質(zhì)； 所述脯氨酸脫氫酶是下述Κ1)或Κ2)的蛋白質(zhì)： Κ1)氨基酸序列為SEQ ID No.8的蛋白質(zhì)； K2)在SEQ ID No.8所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸殘基得到的具有所述脯氨酸脫氫酶功能的由K1)衍生的蛋白質(zhì)； 所述異檸檬酸裂解酶是下述LI)或L2)的蛋白質(zhì)： L1)氨基酸序列為SEQ ID No.9的蛋白質(zhì)； L2)在SEQ ID No.9所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸殘基得到的具有所述異檸檬酸裂解酶功能的由L1)衍生的蛋白質(zhì)； 所述丙酮酸氧化酶是下述Ml)或M2)的蛋白質(zhì)： Ml)氨基酸序列為SEQ ID No. 10的蛋白質(zhì)； M2)在SEQ ID No. 10所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸殘基得到的具有所述丙酮酸氧化酶功能的由Ml)衍生的蛋白質(zhì)； 所述乙酰輔酶A合成酶是下述N1)或N2)的蛋白質(zhì)： N1)氨基酸序列為SEQ ID No. 11的蛋白質(zhì)； N2)在SEQ ID No. 11所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸殘基得到的具有所述乙酰輔酶A合成酶功能的由N1)衍生的蛋白質(zhì)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于:所述L-脯氨酸-4-羥化酶基因?yàn)?下述G11) -G13)中的任一種DNA分子： G11)編碼序列是SEQ ID如.2所示的〇0嫩分子或基因組0嫩； G12)在嚴(yán)格條件下與G11)限定的DNA分子雜交且編碼所述L-脯氨酸-4-羥化酶的cDNA 分子或基因組DNA; G13)與G11)或G12)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且編碼所述L-脯氨酸-4-羥 化酶的cDNA分子或基因組DNA; 所述谷氨酸-5-激酶基因?yàn)橄率鯤ll)-H13)中的任一種DNA分子： H11)編碼序列是SEQ ID如.4所示的〇0嫩分子或基因組0嫩； H12)在嚴(yán)格條件下與H11)限定的DNA分子雜交且編碼所述谷氨酸-5-激酶的cDNA分子 或基因組DNA; H13)與H11)或H12)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且編碼所述谷氨酸-5-激酶 的cDNA分子或基因組DNA; 所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶基因?yàn)橄率鯥 11)-1 13)中的任一種DNA分子： 111) 編碼序列是SEQ ID No.6所示的cDNA分子或基因組DNA; 112) 在嚴(yán)格條件下與I 11)限定的DNA分子雜交且編碼所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶的 cDNA分子或基因組DNA; 113) 與111)或112)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且編碼所述谷氨酸-5-半醛 脫氫酶的cDNA分子或基因組DNA; 所述乙酰輔酶A合成酶基因?yàn)橄率鯪11 )-N13)中的任一種DNA分子： Nil)編碼序列是SEQ ID No. 12所示的cDNA分子或基因組DNA; N12)在嚴(yán)格條件下與Nil)限定的DNA分子雜交且編碼所述乙酰輔酶A合成酶的cDNA分 子或基因組DNA; N13)與Nil)或N12)限定的DNA分子具有75%以上的同一性且編碼所述乙酰輔酶A合成 酶的cDNA分子或基因組DNA。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述重組細(xì)胞與所述底物在體系 R中進(jìn)行反應(yīng);所述體系R由水、Tris、FeS〇4、維生素 C和W組成，所述W為α-酮戊二酸、葡萄糖 和Triton X-100這三種中的任一種、任兩種或三種。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述體系R為下述體系R1-R8中任一種： 體系R1:體系R1由水和溶質(zhì)組成;所述溶質(zhì)及其濃度分別為lOOmM Tris、0.5-2g/100mL 葡萄糖、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM維生素C，pH7.0; 體系R2:體系R2由水和溶質(zhì)組成;所述溶質(zhì)及其濃度分別為lOOmM Tris、0.5-2g/100mL 葡萄糖、4mM FeSCU和8mM維生素C，pH7.0; 體系R3:體系R3由水和溶質(zhì)組成;所述溶質(zhì)及其濃度分別為lOOmM Tris、5-100mMa-酮 戊二酸、4mM FeS〇4和8mM維生素C，pH7.0; 體系R4:體系R4由水和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其濃度分別為lOOmM Tris、0.05-0.2g/ 100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM維生素C，pH7.0; 體系R5:體系R5由水和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其濃度分別為lOOmM Tris、4mM FeS〇4和 8mM 維生素 C，pH7.0; 體系R6:體系R6由水和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其濃度分別為lOOmM Tris、5-100mMa-酮 戊二酸、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM維生素C，pH7.0; 體系R7:體系R7由水和溶質(zhì)組成;所述溶質(zhì)及其濃度分別為lOOmM Tris、0.5-2g/100mL 葡萄糖、5-100mMa-酬戊二酸、4mM FeSCU和8mM維生素C，pH7.0; 體系R8:體系R8由水和溶質(zhì)組成;所述溶質(zhì)及其濃度分別為lOOmM Tris、0.5-2g/100mL 葡萄糖、5-100mMa-酮戊二酸、0.05-0.2g/100mL Triton X-100、4mM FeS〇4和8mM維生素 C， ρΗ7·0〇8. 權(quán)利要求1-5中任一所述重組細(xì)胞。9. 生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸的成套試劑，為D1)或D2): D1)由權(quán)利要求8所述重組細(xì)胞與a)組成的成套試劑； 所述a)為α-酮戊二酸、葡萄糖和Triton X-100這三種中的任一種、任兩種或三種； D2)由用于構(gòu)建權(quán)利要求8所述的重組細(xì)胞的生物材料與所述a)組成的成套試劑； 所述用于構(gòu)建權(quán)利要求8所述的重組細(xì)胞的生物材料，為C1)或C2): C1)用于構(gòu)建權(quán)利要求8所述的重組細(xì)胞的成套DNA分子，含有權(quán)利要求1-5中任一所述 方法中的所述L-脯氨酸-4-羥化酶基因、所述谷氨酸-5-激酶基因和所述谷氨酸-5-半醛脫 氫酶基因這三個(gè)基因中的至少一個(gè)基因； C2)含有C1)所述成套DNA分子中所述三個(gè)基因、或其中任兩個(gè)基因的載體。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的成套試劑，其特征在于:C1)所述成套DNA分子由權(quán)利要求1-5 中任一所述方法中的所述L-脯氨酸-4-羥化酶基因、所述谷氨酸-5-激酶基因、所述谷氨酸-5-半醛脫氫酶基因和所述乙酰輔酶A合成酶基因組成，這四個(gè)基因各自獨(dú)立包裝； C2)所述載體為含有C1)所述成套DNA分子中所述四個(gè)基因、或其中任三個(gè)基因、或其中 任兩個(gè)基因的載體。11. 下述任一應(yīng)用： M1、權(quán)利要求8所述重組細(xì)胞在制備反式-4-羥基-L-脯氨酸中的應(yīng)用； M2、權(quán)利要求8所述重組細(xì)胞在生物轉(zhuǎn)化谷氨酸或可溶性谷氨酸鹽制備反式-4-羥基-L-脯氨酸中的應(yīng)用； M3、權(quán)利要求9或10所述成套試劑在制備反式-4-羥基-L-脯氨酸中的應(yīng)用； M4、權(quán)利要求9或10所述成套試劑在生物轉(zhuǎn)化谷氨酸或可溶性谷氨酸鹽制備反式-4-羥 基-L-脯氨酸中的應(yīng)用； M5、權(quán)利要求1或4所述α-酮戊二酸脫氫酶基因和/或所述異檸檬酸裂解酶基因和/或 所述丙酮酸氧化酶基因和/或所述脯氨酸脫氫酶基因的敲除在生產(chǎn)反式-4-羥基-L-脯氨酸 中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK106086102SQ201610248615
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年4月20日 公開號(hào)201610248615.5, CN 106086102 A, CN 106086102A, CN 201610248615, CN-A-106086102, CN106086102 A, CN106086102A, CN201610248615, CN201610248615.5
【發(fā)明人】林白雪, 崔麗, 袁慎鍵, 陶勇
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院微生物研究所