一種用于建立珊瑚游離和內(nèi)寄生共生藻豐度以及珊瑚白化警示系數(shù)h的技術(shù)指標(biāo)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于建立珊瑚游離和內(nèi)寄生共生藻豐度以及珊瑚白化警示系數(shù)H的技術(shù)指標(biāo)的方法。方法為：珊瑚生長的海域海洋環(huán)境游離狀態(tài)共生藻豐度指標(biāo)建立、珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度指標(biāo)的建立、珊瑚白化警示系數(shù)H的建立。本發(fā)明所述方法可對(duì)各類海水野外樣品和水族館的實(shí)驗(yàn)樣品采集的海水都可以準(zhǔn)確測定，在時(shí)間和空間動(dòng)態(tài)都能進(jìn)行長期和短期的監(jiān)測，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種用于建立珊瑚游離和內(nèi)寄生共生藻豐度以及珊瑚白化警 示系數(shù)H的技術(shù)指標(biāo)的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及海洋珊瑚生態(tài)環(huán)境的評(píng)價(jià)技術(shù)及運(yùn)用領(lǐng)域，一種用于建立珊瑚游離和 內(nèi)寄生共生藻豐度以及珊瑚白化警示系數(shù)H的技術(shù)指標(biāo)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 共生藻可以寄生于珊瑚的體內(nèi)，由于它可以進(jìn)行光合作用、合成必需氨基酸和為 珊瑚的鈣化提供能量支持和必要的營養(yǎng)物質(zhì)，作為最初級(jí)的生產(chǎn)者，是珊瑚生長和珊瑚造 礁中不可或缺的一個(gè)角色。由于海洋環(huán)境的污染，極端氣候的變化，厄爾尼諾的頻繁發(fā)生以 及人類活動(dòng)的破壞，造成珊瑚礁的退化和珊瑚"白化"，因?yàn)楣采鍖?duì)海洋環(huán)境及其敏感，珊 瑚"白化"的發(fā)生引發(fā)共生藻的"逃逸"出宿主，釋放到海水環(huán)境中，成為游離的共生藻，造成 珊瑚喪失營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)，引發(fā)珊瑚的死亡。關(guān)于引發(fā)共生藻"逃逸"的機(jī)制目前尚不清楚， 但是珊瑚體內(nèi)共生藻細(xì)胞豐度的降低與珊瑚的死亡率呈現(xiàn)緊密的相關(guān)性以得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)， 還有研究指出珊瑚的白化現(xiàn)在使得共生藻的種群發(fā)生動(dòng)態(tài)和轉(zhuǎn)變，可以讓珊瑚在面臨新的 環(huán)境變化中重新選擇適合的共生藻，從而克服逆境。而且，研究也證實(shí)如果能讓珊瑚重新構(gòu) 建與共生藻類群落的共生系統(tǒng)，有可能使白化的珊瑚得到恢復(fù)。
[0003] 但是目前缺乏一種有效的方法跟蹤共生藻的群落動(dòng)態(tài)變化、共生藻的多樣性和生 物地理分布。目前公認(rèn)的共生藻的物種劃分，依據(jù)分子鑒定的方法，分為A-H八種類型，其中 五種類型的共生藻與珊瑚存在共生關(guān)系（即Clade A，B，C，D和F)。正是共生藻種類多樣性與 群落變化的復(fù)雜性，是評(píng)價(jià)和研究珊瑚共生藻之間關(guān)系的一個(gè)技術(shù)屏障。傳統(tǒng)上在觀察計(jì) 算共生藻細(xì)胞數(shù)量方法上以顯微鏡計(jì)數(shù)為主，但是由于共生藻在形態(tài)學(xué)上缺乏明顯的分類 特征，而且容易受到其他海藻的干擾。以外，顯微鏡技術(shù)只能計(jì)算Iul海水樣本，在統(tǒng)計(jì)上缺 少代表性。
[0004] 由于定量PCR技術(shù)具有統(tǒng)顯微視覺觀察所不可替代的優(yōu)越性，不僅能從分子水平 上檢測共生藻的分類鑒定，還可以定量計(jì)算共生藻的DNA攝入，以及檢測敏感性高等優(yōu)勢(shì)。 總之，定量PCR法具有直觀、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)顯微鏡計(jì)數(shù)方法通量低、準(zhǔn)確率低等缺 點(diǎn)，可以更加全面、準(zhǔn)確、快速地反映環(huán)境共生藻群落結(jié)構(gòu)，從而可以更加客觀地認(rèn)識(shí)環(huán)境 中共生藻原位的生態(tài)狀況。是研究共生藻珊瑚體內(nèi)寄生和體外游離狀態(tài)動(dòng)態(tài)變化的有效手 段。
[0005] 另外本發(fā)明創(chuàng)先采用相對(duì)定量的方法，評(píng)估珊瑚共生藻的群體結(jié)構(gòu)。引入珊瑚白 化警示系數(shù)H評(píng)估珊瑚優(yōu)勢(shì)共生藻是否出現(xiàn)替換現(xiàn)象，直接聯(lián)系珊瑚所處的海洋環(huán)境變化， 對(duì)預(yù)測珊瑚的生長趨勢(shì)具有簡便、靈敏、預(yù)警的特點(diǎn)。因此，為了更好地促進(jìn)珊瑚礁的保護(hù) 管理和珊瑚健康狀態(tài)的評(píng)價(jià)，今后我國應(yīng)采用共生藻內(nèi)寄生狀態(tài)和游離狀態(tài)的豐度分析及 群體結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)指標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于建立珊瑚游離和內(nèi)寄生共生藻豐度以及珊瑚白 化警示系數(shù)H的技術(shù)指標(biāo)的方法
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于建立珊瑚游離和內(nèi)寄生共生藻豐度以及珊 瑚白化警示系數(shù)H的技術(shù)指標(biāo)的方法，其特征在于，方法為：
[0008] 珊瑚生長的海域海洋環(huán)境游離狀態(tài)共生藻豐度指標(biāo)建立、
[0009] 珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度指標(biāo)的建立、
[0010] 珊瑚白化警示系數(shù)H的建立。
[0011] 進(jìn)一步，所述珊瑚生長的海域海洋環(huán)境游離狀態(tài)共生藻豐度指標(biāo)建立為：
[0012] 1)海水樣品的采集，即珊瑚生長海域水深3-5米，通過水柱取IOOmL海水，不同海水 位點(diǎn)重復(fù)三次；
[0013] 2)海水樣品的過濾膜處理；
[0014] 3)海水游離共生藻總DNA樣品的快速提?。?br>[0015] 4)海水游離共生藻通過熒光定量PCR進(jìn)行種類鑒定及豐度的測定。
[0016] 進(jìn)一步，所述珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度指標(biāo)的建立為：
[0017] 1)珊瑚樣品的采集及前處理；
[0018] 2)珊瑚及內(nèi)寄生共生藻總DNA的快速提?。?br>[0019] 3)珊瑚體內(nèi)寄生共生藻通過熒光定量PCR進(jìn)行種類鑒定及豐度的測定。
[0020] 進(jìn)一步，所述海水游離共生藻豐度的測定或珊瑚體內(nèi)寄生共生藻定量PCR的種類 鑒定及豐度的測定步驟為：
[0021] 假設(shè)任意一種共生藻類型clade A，B，C，D或F的標(biāo)準(zhǔn)品從最高濃度Sng/ul，經(jīng)系列 10倍的稀釋，對(duì)應(yīng)共生藻的探針與引物組合進(jìn)行定量PCR，標(biāo)準(zhǔn)品定量PCR結(jié)果的Ct即X值與 標(biāo)準(zhǔn)品DNA稀釋倍數(shù)為10的底數(shù)值Ig之間為線性函數(shù)關(guān)系：
[0022] Y(clade A，B，C，D或F)=aX+b;
[0023] 根據(jù)所述各類型共生藻的Ct值計(jì)算出各類型共生藻的DNA總量的公式為：
[0024] [DNA含量(pg)] = δ X 1000 XlOa Gt+b，其中δ為經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定所得的標(biāo)準(zhǔn) 品的最尚濃度;不超過20ng/ul;
[0025] [細(xì)胞總數(shù)(個(gè)）] = [DNA含量(pg)]/§;其中§為不同種類共生藻單細(xì)胞基因組DNA 的質(zhì)量，大小通常介于3.0~5. Opg/細(xì)胞；
[0026] 最后得到細(xì)胞豐度：
[0027]
[0028]其中Vl為實(shí)驗(yàn)樣品提取所得DNA總量的體積ul，V2為定量PCR所用的DNA的體積ul， M代表用于提取DNA的海水體積ml。
[0029] 進(jìn)一步，所述珊瑚白化警示系數(shù)H的建立為：
[0030] 1)通過所述得到的珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度確定珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共 生藻豐度最大的類型為clade，，檢測結(jié)果為clade A，B，C，D或F中豐度最大的一個(gè)類型。
[0031] 2)通過所述得到的珊瑚生長的海域海洋環(huán)境游離狀態(tài)共生藻豐度，鑒定海水中存 在的游離共生藻中，除0外的其他類型cladeco，檢測結(jié)果為除cladeP外，可為clade A，B, C，D或F中的一個(gè)或者多個(gè)類型。
[0032] 3)待診斷評(píng)估的珊瑚樣品，提取總DNA，分別運(yùn)用針對(duì)PAX(珊瑚內(nèi)參）Xladef及 Clade ω探針與引物組合進(jìn)行焚光定量PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果記錄為Ct pax，Ctf及Ct ω。計(jì)算珊瑚 白化警示系數(shù)Η:
<5)；
[0033] 完整描述珊瑚游離狀態(tài)共生藻及內(nèi)寄生狀態(tài)共生藻的豐度指標(biāo)，結(jié)合珊瑚白化警 示系數(shù)H的值，預(yù)測當(dāng)珊瑚白化警示系數(shù)H>1時(shí)，表明珊瑚共生藻clack#為優(yōu)勢(shì)種群，珊瑚趨 于正常狀態(tài)；當(dāng)HS 1時(shí)，警示珊瑚共生藻優(yōu)勢(shì)種群由clack#替換為clade ω現(xiàn)象，表明珊瑚 所處的海洋環(huán)境出現(xiàn)變化，在一定的程度上警示珊瑚已經(jīng)白化或者有白化的可能性。
[0034] 進(jìn)一步，所述探針與引物組合的序列如SEQ ID N0:1-3，SEQ ID N0:4-6，SEQ ID N0:7-9，SEQIDN0:10-12，SEQIDN0:13-15和SEQIDN0:16-18所示；其中SEQIDN0:2， 5,8，11，14，17為探針序列，其5'端和3'端分別帶有不同的熒光標(biāo)記。
[0035]進(jìn)一步，所述標(biāo)準(zhǔn)品是為clade A，B，C，D或F型珊瑚共生藻的純DNA樣品。
[0036]計(jì)算游離共生藻的細(xì)胞豐度：
[0037] 假設(shè)共生藻N(N代表Clade A，B，C，D和F中的任意一種），標(biāo)準(zhǔn)品從最高濃度Sng/ ul，經(jīng)系列10倍的稀釋，對(duì)應(yīng)共生藻的探針與引物組合進(jìn)行定量PCR，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品定量PCR結(jié) 果的Ct值(X)與標(biāo)準(zhǔn)品DNA稀釋倍數(shù)為10的底數(shù)值(Ig)之間為線性函數(shù)關(guān)系：
[0038] Y clade N=aX+b (1)
[0039] 計(jì)算當(dāng)實(shí)驗(yàn)樣品的定量PCR結(jié)果為Ct時(shí)的DNA模板濃度：
[0040] [DNA含量(pg)] =δΧ1〇〇〇Χ1(Τ ct+b (2)
[0041 ]其中δ為經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定所得的標(biāo)準(zhǔn)品的最高濃度，Ct為熒光定量PCR實(shí)驗(yàn) 得到的閾值，即為公式(1)中的X。
[0042]根據(jù)LaJeunesse et al · (J.Phycol .41,880-886,2005)，流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果， 珊瑚的共生藻的基因組大小介于1.5-4.5pg/細(xì)胞，一定誤差允許的范圍內(nèi)，經(jīng)查的對(duì)應(yīng)實(shí) 驗(yàn)共生藻的基因組大小為§pg/細(xì)胞（1·5〈§〈4·5)(詳見LaJeunesse T C，Lambert G, Andersen R A,et al.SYMBI0DINIUM(PYRRH0PHYTA)GEN0ME SIZES(DNA C0NTENT)ARE SMALLEST AMONG DIN0FLAGELLATES1[J]·Journal of Phycology,2005,41(4):880-886.)〇 計(jì)算對(duì)應(yīng)的細(xì)胞總數(shù)為：
[0043] [細(xì)胞總數(shù)(個(gè)）]=[DNA 含量(pg) ]/§ (3)
[0044] 綜合考虎這合海7k烊品的體葙TJDNA樽板的稀経倍教閔素，得出，
[0045]
[0046]公式中，其中Vl為實(shí)驗(yàn)樣品提取所得DNA總量的體積(ul)，V2為定量PCR所用的DNA 的體積(ul)，M代表用于提取DNA的海水體積(ml)。
[0047] 計(jì)算珊瑚宿主內(nèi)寄生共生藻的細(xì)胞相對(duì)豐度：ACt = Ctm-Ctciade-specific its (5)
[0048] 其中C t P ax為針對(duì)珊瑚P A X內(nèi)參基因的探針經(jīng)定量P C R實(shí)驗(yàn)檢測的C t值， Ctci^pWfi。ITS為珊瑚共生藻各種探針定量PCR實(shí)驗(yàn)的響應(yīng)Ct值，ACt為兩者之間的差值。 [0049] ITS Clade-specif ic的拷貝數(shù)與珊瑚PAX拷貝數(shù)的關(guān)系為2的指數(shù)關(guān)系，即
[0050]
(6)
[0051] 大量研究表明，珊瑚健康狀態(tài)與共生藻群體的機(jī)構(gòu)有緊密的聯(lián)系。一般正常情況 下C型共生藻為占優(yōu)勢(shì)類群。最近，有大量的報(bào)道，發(fā)現(xiàn)當(dāng)海洋環(huán)境或者氣候變化引起的珊 瑚白化，會(huì)使原本C占優(yōu)勢(shì)變?yōu)镈占優(yōu)勢(shì)，又稱有共生藻的替換，如果珊瑚沒有適應(yīng)共生藻 優(yōu)勢(shì)群體結(jié)構(gòu)的變化，最終會(huì)導(dǎo)致珊瑚的死亡，另有研究表明，只有大約不到50%的珊瑚具 有這樣的適應(yīng)能力。所以通過相對(duì)定量PCR的方法檢測珊瑚的優(yōu)勢(shì)共生藻類群是否發(fā)生替 換現(xiàn)象，評(píng)價(jià)珊瑚所處的海洋環(huán)境的變化及珊瑚的健康狀態(tài)，具有一定的指導(dǎo)和警示意義。
[0052]本發(fā)明采用相對(duì)定量法計(jì)算珊瑚共生藻細(xì)胞數(shù)密度的計(jì)算及珊瑚白化警示系數(shù) H，計(jì)算步驟如下：
[0053] 1)通過定量PCR方法檢測調(diào)查海域中正常珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻細(xì)胞豐度指 標(biāo)，測定珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度最大的類型為cladeP，檢測結(jié)果為clade A，B，C，D 或F中豐度最大的一個(gè)類型。
[0054] 2)通過定量PCR方法檢測該海域中海洋環(huán)境游離狀態(tài)共生藻細(xì)胞豐度指標(biāo)，鑒定 海水中存在的游離共生藻中，除爐外的其他類型clade ω，檢測結(jié)果為除cIadef外，可為 clade A，B，C，D或F中的一個(gè)或者多個(gè)類型。
[0055] 3)待診斷評(píng)估的珊瑚樣品，提取總DNA，分別運(yùn)用針對(duì)PAX(珊瑚內(nèi)參）、Clade識(shí)及 Clade ω探針引物組合進(jìn)行焚光定量PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果記錄為Ctpax，C1#_及Ct ω。計(jì)算珊瑚白化 警示系數(shù)：
（7)
[0056] 當(dāng)珊瑚白化警示系數(shù)H>1時(shí)，表明珊瑚共生藻clack#為優(yōu)勢(shì)種群，珊瑚趨于正常狀 態(tài)；當(dāng)HSl時(shí)，警示珊瑚共生藻優(yōu)勢(shì)種群由clade#替換為cladeco現(xiàn)象，表明珊瑚所處的海 洋環(huán)境出現(xiàn)變化，在一定的程度上警示珊瑚已經(jīng)白化或者有白化的可能性。
[0057] 本發(fā)明擬解決的主要問題是如何體現(xiàn)海水中游離狀態(tài)的共生藻以及珊瑚組織內(nèi) 寄生狀態(tài)的共生藻的豐度及多樣性，旨在判斷共生藻在以上兩者狀態(tài)下之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì) 珊瑚健康狀態(tài)的影響。從而開發(fā)一種易于標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)方法或者體系，創(chuàng)造了幾個(gè)相應(yīng)的 評(píng)價(jià)指標(biāo)，為未來的海洋生物及環(huán)境研究提供數(shù)據(jù)支持。本發(fā)明的
【申請(qǐng)人】在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)'白 化'珊瑚中出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)共生種群替換的現(xiàn)象，這對(duì)為來珊瑚礁的'白化'診斷具有指導(dǎo)意義。而 且從技術(shù)本身來講，本發(fā)明涉及建立的指標(biāo)對(duì)未來的珊瑚生態(tài)研究或者給同行、相關(guān)領(lǐng)域 學(xué)者在在這一方面的研究將具有啟發(fā)和幫助。
[0058]本發(fā)明建立檢測這五種共生藻的目的主要是為了更加全面的建立評(píng)價(jià)海洋珊瑚 和藻類生態(tài)研究的指標(biāo)。
[0059]本發(fā)明有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0060] 1.本發(fā)明運(yùn)用珊瑚共生藻的游離狀態(tài)與內(nèi)寄生狀態(tài)的群落結(jié)構(gòu)相關(guān)指標(biāo)能綜合 評(píng)價(jià)反應(yīng)珊瑚生活環(huán)境的狀況，具有很強(qiáng)的敏感性，能更全面地反映珊瑚的健康狀況。
[0061] 2.本發(fā)明應(yīng)用Taqman PCR技術(shù)既有高度的特異性及敏感性，能獲得客觀全面的共 生藻群落結(jié)構(gòu)與多樣性，更直接全面地反映共生藻的生物地理分布及物種多樣性程度。 [0062] 3.對(duì)各類海水野外樣品和水族館的實(shí)驗(yàn)樣品采集的海水都可以準(zhǔn)確測定，在時(shí)間 和空間動(dòng)態(tài)都能進(jìn)行長期和短期的監(jiān)測，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0063] 4.本發(fā)明采用相對(duì)定量PCR的方法檢測珊瑚的優(yōu)勢(shì)共生藻類群是否發(fā)生替換現(xiàn) 象，引入珊瑚白化警示系數(shù)H，對(duì)評(píng)價(jià)珊瑚所處的海洋環(huán)境的變化及珊瑚的健康狀態(tài)，一定 程度上具有的指導(dǎo)和警示意義。
【附圖說明】
[0064] 圖1是野外珊瑚基于GPS定位的采集位點(diǎn)圖。
[0065] 圖2是DNA標(biāo)準(zhǔn)提取方法圖。
[0066] 圖3是海水游離共生藻的檢測(A，B)及細(xì)胞數(shù)量豐度計(jì)算結(jié)果(C)圖。
[0067] 圖4是健康珊瑚和白化珊瑚的珊瑚白化警示系數(shù)H的比較圖。
【具體實(shí)施方式】
[0068] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附 圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例 中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明 書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0069] 實(shí)施例1:珊瑚樣品的采集與共生藻的準(zhǔn)備培養(yǎng)試驗(yàn)
[0070] 野外珊瑚樣品的采集:于海南島的東、西海域，采集健康的盔型珊瑚樣品（采集樣 品的GPS位置，見圖1 )，將部分樣品敲碎或者切成小塊，保存于液氮中。
[0071] 水族館樣品的采集：已經(jīng)在水族館環(huán)境中培養(yǎng)大約半年的盔型珊瑚樣品，采集健 康和白化的珊瑚樣品，切成小快，于液氮中低溫保存。
[0072] 另外收集水族館的海水樣品100ml，設(shè)置6次重復(fù)，作為檢測游離共生藻的檢測實(shí) 驗(yàn)材料。
[0073] 共生藻純培養(yǎng)：珊瑚共生藻的藻株ITO 10(Clade A)，WZD 17(Clade C) ,SGAl (Clade D)和Symka(Clade F)光照培養(yǎng)于f/2培養(yǎng)基，27°C，光周期為12h光照：12h黑暗，培 養(yǎng)一個(gè)月，通過離心收集藻類細(xì)胞（以上藻種菌均保藏于中國海洋微生物菌種保藏管理中 心(MCCC)，MCCC屬于國家級(jí)公益性微生物資源共享平臺(tái)）。
[0074] 實(shí)施例2. DNA樣品的標(biāo)準(zhǔn)提取
[0075]圖2為珊瑚，海水樣品及共生藻培養(yǎng)物的DNA標(biāo)準(zhǔn)提取方法示圖。按照?qǐng)D2所示步驟 來進(jìn)行DNA樣品的標(biāo)準(zhǔn)提取即可。
[0076]以海洋生物DNA提取試劑盒（北京天根生物科技有限公司）作為DNA提取方法的實(shí) 施。提取步驟如此下：以例1中采集的珊瑚樣品，切成~5mm2,0.1-0.2g的珊瑚組織，取數(shù)塊 置入2. Oml的EP管中，隨后加入500μ1裂解液GA得到珊瑚樣品。
[0077]通過離心收集后的藻類細(xì)胞，轉(zhuǎn)入2.Oml EP管中，加入500μ1裂解液GA得到共生藻 樣品。
[0078]取500ml海水樣品過濾，采用直徑0.45μπι的尼龍膜，過濾完后將過濾膜卸下，剪碎 置入2. Oml EP離心管，同樣加入500μ1裂解液GA，得到水樣過濾樣品。
[0079]將上述的珊瑚樣品，共生藻樣品及水樣過濾樣品分別加入50μ1的蛋白酶K(20mg/ ml )，震蕩15s，將EP管置于56°C加熱器裂解Ih。再加入500μ1 GB buffer于上述混合液中，再 于70 °C加熱IOmin，使細(xì)胞徹底，釋放出DNA。繼續(xù)離心10，000轉(zhuǎn)/minlmin，吸取Iml上清液轉(zhuǎn) 移至新的EP管中，加入無水乙醇500μ1，震蕩混勻。將全部的液體轉(zhuǎn)移入CB3柱并離心過柱， DNA吸附于CB3中，分別以600μ1⑶Buffer清洗過柱一次，500μ1 PW Buffer清洗兩次。最后 用100μΙ TE洗脫DNA JNA的濃度經(jīng)紫外分光光度計(jì)260mm測定，用雙蒸水調(diào)節(jié)DNA濃度至 20ng/yl〇
[0080] 實(shí)施例3:定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0081 ]表1.實(shí)驗(yàn)所設(shè)及針對(duì)珊瑚宿主和共生藻的引物探針組合表
[0084] 注:其中Y和W為堿兼并堿基，Y代表C或T，W代表AST。
[0085] 上述Taqman探針的5 '端、3 '端分別用FAM報(bào)導(dǎo)熒光染料和TAMRA淬滅基團(tuán)標(biāo)記。擴(kuò) 增反應(yīng)總體積為20yL，其中上下游引物(Forward，Reverse) 200nM，探針(probe) IOOnM，10μ1 AceQ?qPCR Probe Master Mix(Vazyme,南京），模板ΙμΙΙΤΟ 10(Clade A),WZD 17(Clade C)，SGAl(Clade D)和Symka(Clade F)經(jīng)10倍系列稀釋的DNA，（以上藻種菌均保藏于中國海 洋微生物菌種保藏管理中心(MCCC)，MCCC屬于國家級(jí)公益性微生物資源共享平臺(tái)），余下用 雙蒸水補(bǔ)足20yL，置RG 6000(QIAGEN)熒光定量PCR系統(tǒng)運(yùn)行分析，在每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束 時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測，熒光模式設(shè)為Green。反應(yīng)程序?yàn)?:95°C5min;95°C10s，60°C30s，45個(gè) 循環(huán)。
[0086] 根據(jù)珊瑚共生藻株ITO 10(Clade A),WZD 17(Clade C),SGAl(Clade DMPSymka (Clade F)的DNA樣品在6個(gè)稀釋度（HT1~HT5)稀釋。各種藻株以相應(yīng)的探針引物組合(所 設(shè)及引物探針組合見表1)進(jìn)行定量PCR，結(jié)果所得的Ct值與對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)呈線性關(guān)系，繪 制對(duì)應(yīng)共生藻類型的標(biāo)準(zhǔn)曲線，各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的DNA稀釋倍數(shù)的IoglO值應(yīng)與Ct值線性函數(shù)關(guān) 系良好，R 2X). 99，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為理想。
[0087]實(shí)施例4:海水樣品的游離共生藻的檢測與豐度計(jì)算
[0088]水族館收集的海水樣品100ml，設(shè)置6次重復(fù)，過0.45μπι濾膜提取的DNA，經(jīng)表1的引 物探針組合檢測，結(jié)果見表2及圖3。圖3可以看出，除了Clade B的Ct為0(陰性）以外，clade A，C，D和F的檢測結(jié)果均大于0,表明水族館的海水中經(jīng)檢測含有A，C，D和F四種共生藻的類 型。定量PCR檢測結(jié)果得到的Ct值經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式換算所對(duì)應(yīng)藻類細(xì)胞的個(gè)數(shù)。以Clade C藻類細(xì)胞的計(jì)算為例，其檢測結(jié)果為Ct = 24.45,由圖3的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出DNA的稀釋倍數(shù)Y與 Ct值(X)的關(guān)系為:Y = -0.2701X+4.3801。計(jì)算出所含的Clade C含有的DNA總量：
[0089] [DNA總量(pg) ] = 2 X IO4X 10(4·38Q1-Q·27Q1Gt); δ可以通過紫外分光光度計(jì)直接測定 得到，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的計(jì)算，各種藻類標(biāo)準(zhǔn)品的最高濃度盡量調(diào)整一致，可都稀釋至終 濃度為20ng/ul。
[0090]依據(jù)LaJeunesse et al · (J.Phycol .41,880-886,2005)，流式細(xì)胞儀分析的結(jié)果， 珊瑚的共生藻Clade C的基因組大小介于3.Opg/細(xì)胞，計(jì)算對(duì)應(yīng)的細(xì)胞總數(shù)為：
[0091] [Clade C細(xì)胞數(shù)]= [DNA總量(pg)]/3.0(pg);
[0092] 綜合考慮所用測試海水為500ml的體積，DNA提取的總體積為100μΙ及定量PCR所用 的體積為ΙμL，計(jì)算clade C的共生藻豐度為：
[0093] Clade C(個(gè)數(shù)）/(mL海水）= (2Χ104Χ 10(4.3801-0.2701χ24. 45))/3·0Χ100/1·0 + 500 =8(個(gè)細(xì)胞)/m海水=8,000(個(gè)細(xì)胞)/海水。
[0094]以同樣的方法計(jì)算出Clade A，C，D和F的細(xì)胞個(gè)數(shù)，計(jì)算結(jié)果詳見表2。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果 顯示水族館的海水樣品中共生藻C和D型豐度最高，每升海水分別可達(dá)11789.17±5270.82 和8052.01 ±1700.56細(xì)胞數(shù)，A和F型豐都較低，每升海水分別為71.93 ±52.08和2.62 土 1.30個(gè)細(xì)胞。而在我們這次采集的海水樣品中沒有檢測出B型共生藻。綜上，說明本發(fā)明所 用的方法可以準(zhǔn)確檢測和計(jì)算出各種珊瑚游離共生藻的豐度。
[0095]表2.海水游離共生藻的檢測結(jié)果及細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)算結(jié)果表
[0097] 實(shí)施例5:珊瑚組織內(nèi)共生藻的檢測與相對(duì)豐度計(jì)算
[0098] 海南島的東、西海域，采集健康的盔型珊瑚樣品及水族館采集健康和白化珊瑚樣 品DNA，以表1中的珊瑚PAX的探針引物組合及針對(duì)所有的共生藻的探針引物組合進(jìn)行定量 PCR，每個(gè)樣品重復(fù)三次，記錄每個(gè)樣品的Ct值，經(jīng)檢測所有的珊瑚樣品PAX基因的Ct都介于 25~40,說明所提取的珊瑚DNA含量符合定量PCR的檢測要求。除海南東海域的部分樣品未 能檢測出Clade D以外，其余的珊瑚樣品能檢測出Clade C和D兩種類型共生藻，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見 表3，各個(gè)樣品之間進(jìn)行顯著型分析(3?55,41^￥4分析，？〈0.05)，檢測得到(：1 &(16(：和0兩種 類型的共生藻的Ct值，在健康和白化珊瑚中均存在顯著性差異(見表3)。
[0099]表3:海南東海域和水族館采集的珊瑚樣品的結(jié)果表
[0101] 表格中考慮到定量PCR實(shí)驗(yàn)不同批次的機(jī)械誤差和實(shí)驗(yàn)的誤差的影響，做相對(duì)定 量分析建議共生藻的特異性ITS檢測和珊瑚內(nèi)參PAX檢測為同一次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，ACt(PAX-Clade C)，表示為同一批次定量PCR實(shí)驗(yàn)，PAX內(nèi)參的Ct值與共生藻Clade C探針的Ct值之 差。同樣ACt(PAX-Clade D)表示為同一批次定量PCR實(shí)驗(yàn)，PAX內(nèi)參的Ct值與共生藻Clade D探針的Ct值之差。在本次實(shí)驗(yàn)中，只檢測到C與D兩種共生藻，其他類型的藻為檢測到。
[0102] 由于考慮到珊瑚樣品的差異及提取DNA效率等差異，故采用相對(duì)定量的方法計(jì)算 各種共生藻的相對(duì)含量更加準(zhǔn)確。
[0103] 即珊瑚樣品的共生藻的相對(duì)豐度為:ACt = CtPAX-Ct Clade-specific ITS
[0104] 經(jīng)計(jì)算得到的結(jié)果見表三，健康珊瑚樣品（包括海南東，西海域的樣品及水族館的 樣品）中，共生藻Clade C的相對(duì)豐度大于Clade D。然而，在白化的珊瑚樣品中結(jié)果卻是D大 于C，即白化珊瑚中Clade D的相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于Clade C,這一結(jié)果與國外大量的研究結(jié)果一 致，說明珊瑚在'白化'的過程中優(yōu)勢(shì)的內(nèi)寄生共生藻出現(xiàn)了替換的現(xiàn)象，即優(yōu)勢(shì)共生藻由C 變成了D，也說明了珊瑚的健康狀況與內(nèi)寄生共生藻的群落有直接的關(guān)系。珊瑚共生藻出現(xiàn) 了替換的現(xiàn)象，與珊瑚的白化有直接相關(guān)性。
[0105] 進(jìn)一步計(jì)算各樣品的珊瑚白化警示系數(shù)H，見圖4。以珊瑚樣品Hl為例，計(jì)算珊瑚白 化警示系數(shù)H，H=(Ct pax-Ct C)/(Ct pax-Ct D) = 11.21/6.14=1.83，H>1,表明珊瑚為正 ?；蛘呓】禒顟B(tài)。而珊瑚樣品Bl，計(jì)算H=(Ct pax-Ct C)/(Ct pax-Ct D)=5.79/19.77 = 0.29，H〈1，表明珊瑚已經(jīng)白化或者有白化的可能。結(jié)果與珊瑚形態(tài)學(xué)表現(xiàn)的觀察一致。
[0106] 本發(fā)明使用的定量PCR檢測及相對(duì)豐度的計(jì)算方法可以成功準(zhǔn)確的測定珊瑚內(nèi)寄 生的共生藻的豐度。由此采用相對(duì)定量PCR的方法檢測珊瑚的優(yōu)勢(shì)共生藻類群是否發(fā)生替 換現(xiàn)象，引入珊瑚白化警示系數(shù)H，對(duì)評(píng)價(jià)珊瑚所處的海洋環(huán)境的變化及珊瑚的健康狀態(tài)， 一定程度上具有的指導(dǎo)和警示意義。
[0107] 盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，可以理解的是，上述實(shí)施例是示例 性的，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨 的情況下在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于建立珊瑚游離和內(nèi)寄生共生藻豐度W及珊瑚白化警示系數(shù)Η的技術(shù)指標(biāo)的 方法，其特征在于，方法為： 珊瑚生長的海域海洋環(huán)境游離狀態(tài)共生藻豐度指標(biāo)建立、 珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度指標(biāo)的建立、 珊瑚白化警示系數(shù)Η的建立。2. 權(quán)利要求1所述用于建立評(píng)價(jià)海洋環(huán)境游離共生藻、珊瑚體內(nèi)寄生共生藻豐度和珊 瑚白化警示系數(shù)Η的技術(shù)指標(biāo)的方法，其特征在于，所述珊瑚生長的海域海洋環(huán)境游離狀態(tài) 共生藻豐度指標(biāo)建立為： 1) 海水樣品的采集，即珊瑚生長海域水深3-5米，通過水柱取lOOmL海水，不同海水位點(diǎn) 重復(fù)二次； 2) 海水樣品的過濾膜處理； 3) 海水游離共生藻總DNA樣品的快速提??； 4) 海水游離共生藻通過巧光定量PCR進(jìn)行種類鑒定及豐度的測定。3. 權(quán)利要求1所述用于建立評(píng)價(jià)海洋環(huán)境游離共生藻、珊瑚體內(nèi)寄生共生藻豐度和珊 瑚白化警示系數(shù)Η的技術(shù)指標(biāo)的方法，其特征在于，所述珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度指 標(biāo)的建立為： 1) 珊瑚樣品的采集及前處理； 2) 珊瑚及內(nèi)寄生共生藻總DNA的快速提取； 3) 珊瑚體內(nèi)寄生共生藻通過巧光定量PCR進(jìn)行種類鑒定及豐度的測定。4. 權(quán)利要求2或3所述用于建立評(píng)價(jià)海洋環(huán)境游離共生藻、珊瑚體內(nèi)寄生共生藻豐度和 珊瑚白化警示系數(shù)Η的技術(shù)指標(biāo)的方法，其特征在于，所述海水游離共生藻豐度的測定或珊 瑚體內(nèi)寄生共生藻定量PCR的種類鑒定及豐度的測定步驟為： 假設(shè)任意一種共生藻類型clade A，B，C，D或F的標(biāo)準(zhǔn)品從最高濃度Sng/ul，經(jīng)系列10倍 的稀釋，對(duì)應(yīng)共生藻的探針與引物組合進(jìn)行定量PCR，標(biāo)準(zhǔn)品定量PCR結(jié)果的Ct即X值與標(biāo)準(zhǔn) 品DNA稀釋倍數(shù)為10的底數(shù)值Ig之間為線性函數(shù)關(guān)系： Yklade A，B，C，D或F)=aX+b; 根據(jù)所述各類型共生藻的Ct值計(jì)算出各類型共生藻的DNA總量的公式為： [dm含量(pg)] = δX1000X10aα+b，其中δ為經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定所得的標(biāo)準(zhǔn)品的最 高濃度;不超過20ng/ul; [細(xì)胞總數(shù)(個(gè)）] = [DNA含量(pg)]/§;其中§為不同種類共生藻單細(xì)胞基因組DM的質(zhì) 量，大小通常介于3.0~5.化g/細(xì)胞； 最后得到細(xì)胞豐度： I鍊，毅聲潑' C:奪》IMl海來-[麵薇穗穀{奪> ]X養(yǎng)單M; 其中VI為實(shí)驗(yàn)樣品提取所得DNA總量的體積ul，V2為定量PCR所用的DNA的體積ul，M代 表用于提取DM的海水體積ml。5. 權(quán)利要求1所述用于建立評(píng)價(jià)海洋環(huán)境游離共生藻、珊瑚體內(nèi)寄生共生藻豐度和珊 瑚白化警示系數(shù)Η的技術(shù)指標(biāo)的方法，其特征在于，所述珊瑚白化警示系數(shù)Η的建立為： 1)通過所述珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度確定珊瑚體內(nèi)寄生狀態(tài)的共生藻豐度最 大的類型為clade滬檢測結(jié)果為clade A，B，C，D或F中豐度最大的一個(gè)類型。 2) 通過所述珊瑚生長的海域海洋環(huán)境游離狀態(tài)共生藻豐度，鑒定海水中存在的游離共 生藻中，除巧外的其他類型cladew，檢測結(jié)果為除clade 9外，可為clade A，B，C，D或F中的 一個(gè)或者多個(gè)類型。 3) 待診斷評(píng)估的珊瑚樣品，提取總DNA，分別運(yùn)用針對(duì)PAX(珊瑚內(nèi)參）、Cladep及Clade ω探針與引物組合進(jìn)行巧光定量PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果記錄為Ctpax，ΓΥ滬及^ ω。計(jì)算珊瑚白化警 示系數(shù)Η:計(jì)算珊瑚白化警示系數(shù)Η的值，預(yù)測當(dāng)珊瑚白化警示系數(shù)H〉1時(shí)，表明珊瑚共生藻 clade f為優(yōu)勢(shì)種群，珊瑚趨于正常狀態(tài)；當(dāng)1時(shí)，警示珊瑚共生藻優(yōu)勢(shì)種群由clade 口替換 為cladew現(xiàn)象，表明珊瑚所處的海洋環(huán)境出現(xiàn)變化，在一定的程度上警示珊瑚已經(jīng)白化或 者有白化的可能性。6. 權(quán)利要求4或5所述用于建立評(píng)價(jià)海洋環(huán)境游離共生藻、珊瑚體內(nèi)寄生共生藻豐度和 珊瑚白化警示系數(shù)Η的技術(shù)指標(biāo)的方法，其特征在于，所述探針與引物組合的序列如SEQ ID 顯：1-3，沈〇10顯：4-6,56〇10顯：7-9,56〇10顯：1〇-12,56〇10^):13-15和56〇10 NO: 16-18所示;其中SEQ ID N0:2,5,8,11，14,17為探針序列，其5'端和3'端分別帶有不同 的巧光標(biāo)記。7. 權(quán)利要求6所述用于建立評(píng)價(jià)海洋環(huán)境游離共生藻、珊瑚體內(nèi)寄生共生藻豐度和珊 瑚白化警示系數(shù)Η的技術(shù)指標(biāo)的方法，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)品是為clade A，B，C，D或F型珊 瑚共生藻的純DNA樣品。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106086200SQ201610531787
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月4日
【發(fā)明人】林鎮(zhèn)躍, 陳建明, 陳明諒
【申請(qǐng)人】國家海洋局第三海洋研究所