檢測先天性角化不良癥nhp2基因第4號全外顯子序列突變位點的方法和引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測NHP2基因第4號全外顯子序列的方法、引物和試劑盒，包括擴增NHP2基因第4號全外顯子的正、反向引物和一對測序引物。將Touch?down PCR擴增和Sanger測序相結(jié)合，可快速檢測先天性角化不良癥患者體內(nèi)NHP2基因第4號全外顯子序列的突變情況，其中包含了位于4號全外顯子上的主要突變位點V126M、Y139H、X154R。
【專利說明】
檢測先天性角化不良癥NHP2基因第4號全外顯子序列突變位 點的方法和引物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及檢測NHP2基因第4號全外顯子序列 突變的引物、方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 先天性角化不良癥(dskeratosis eongenita，DC)是一種具有遺傳異質(zhì)性的骨髓 衰竭綜合征，發(fā)病率約為1/100萬。典型的DC患者約80%~90%具有皮膚黏膜異常三聯(lián)征， 表現(xiàn)為皮膚網(wǎng)狀色素沉著、指(趾）甲萎縮、口腔黏膜白斑。目前文獻報道可引起DC的突變基 因主要有CTCl，DKCl，TERC，TERT，TINF2，N0P10，NHP2及WRAP53。文獻報道，這些基因有3種遺 傳方式，分別為X-連鎖隱性遺傳、常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳。但目前仍約50% 患者遺傳特征不明確。X-連鎖隱性遺傳包括DKCl，常染色體顯性遺傳包括TERC及TINF2，常 染色體隱性遺傳包括CTCl，WRAP53，N0P10，NHP2，既可以作為常染色體顯性遺傳又可以作為 隱性遺傳的有TERT。NHP2位于5q35.3位點負責(zé)編碼端粒酶相關(guān)蛋白復(fù)合體組分蛋白的基 因。見^2蛋白是端粒酶相關(guān)蛋白復(fù)合體的核心蛋白之一，與(^81?51'；[11、1'10?10、6六1?1蛋白共同 參與了真核生物核糖體的合成，前體mRNA剪接和端粒的維持。Vul Iiamy等在先天性角化不 良癥患者中發(fā)現(xiàn)NHP2存在突變，該突變縮短了端粒酶的長度，并降低了TERC的表達量水平。
[0003] 近年來，通過全基因組測序，發(fā)現(xiàn)NHP2基因突變在先天性角化不良癥患者中非常 常見。文獻報道NHP2基因突變存在3個突變熱點，集中在第4外顯子中。突變熱點V126M (G376A)，能引起該基因第126密碼子纈氨酸到蛋氨酸的改變;突變熱點Y139H(T415C)，能引 起該基因第139密碼子酪氨酸到組氨酸的改變;突變熱點X154R(T460A)，該位點突變使終止 密碼子變成精氨酸，并使得氨基酸鏈的C端增長55個氨基酸。這些位點的變異能引起端粒酶 RNA水平減低及端粒長度明顯縮短，并降低了TERC的表達量水平。目前國內(nèi)文獻報道的DC病 例絕大多數(shù)為30歲左右皮膚受累的臨床病例，病例數(shù)較少，且較少進行基因檢測。因此有必 要進行相關(guān)基因的突變檢測，有必要先對患者進行V126M、Y139H、X154R突變進行篩選，有助 于對先天性角化不良癥的早期診斷，減少誤診、漏診，并進行治療。
[0004] 本發(fā)明采用Touch-down PCR擴增和Sanger測序法檢測NHP2基因第4號全外顯子序 列的突變，并且設(shè)計的引物可以擴展整個第4號全外顯子序列，包括待檢測的所有突變位 點。Touch-down PCR擴增可確保正、反向擴增引物與樣本DNA模板的結(jié)合發(fā)生在最互補的序 列之間，當(dāng)退火溫度降低到非特異性擴增發(fā)生的水平時，特異性擴增產(chǎn)物在此時已經(jīng)有一 個幾何數(shù)的起始優(yōu)勢，豐度較高，在剩余的擴增反應(yīng)中，特異性擴增產(chǎn)物與非特異擴增產(chǎn)物 產(chǎn)生競爭，但是因非特異性擴增產(chǎn)物豐度較低，特異性擴增產(chǎn)物始終優(yōu)先擴增，從而產(chǎn)生單 一的占主導(dǎo)地位的特異性擴增產(chǎn)物。而Sanger測序法是檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，檢測結(jié)果 準(zhǔn)確性高，并且很大程度上地節(jié)省了檢測成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供檢測NHP2基因第4號全外顯子序列的引物，其特征在于，包 括:擴增NHP2基因第4號全外顯子序列的正、反向引物;其堿基序列為：
[0006] NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTG
[0007] NHP2-R：AACAGCTATGACCATGAGGAGGACAGCCAGTCGTCCTG 〇
[0008] 進一步地，所述引物還包括一對測序引物，為通用引物M13,其堿基序列為
[0009] Ml3-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0010] M13-R:AACAGCTATGACCATG。
[0011] 進一步地，所述正、反向引物的使用濃度比為:NHP2-F:NHP2-R=1:1。
[0012] 進一步地，所述一對測序引物的使用濃度比為:M13-F:M13-R=1:1。
[0013] 進一步地，所述正、反向擴增引物的擴增反應(yīng)條件為：第一階段，95°C預(yù)變性 IOmin;第二階段，變性溫度94°C30sec，退火溫度64°C90sec，延伸溫度72°C30sec，循環(huán)16 次，每循環(huán)一次，所述退火溫度降低〇.5°C;第三階段，變性溫度94°C3〇 sec，退火溫度58°C 30sec，延伸溫度72°C3〇sec，循環(huán)24次;第四階段，72°C10min;第五階段，擴增反應(yīng)結(jié)束，擴 增產(chǎn)物在4°C下保存。
[0014] 本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測NHP2基因第4號全外顯子序列的方法，其包括 如下步驟：
[0015] (1)提取樣本 DNA;
[0016] (2)利用一對擴增引物NHP2-F和NHP2-R對(1)中的DNA進行擴增，獲得擴增產(chǎn)物； [0017] (3)利用一對測序引物M13-F和M13-R對(2)中的擴增產(chǎn)物進行測序，獲得所述擴增 廣物的基因序列；
[0018] (4)將(3)中的基因序列與NHP2基因野生型參考序列NHP2-ref進行比較，確定突變 位點是否存在，其特征在于，
[0019] NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTG [0020] NHP2-R：AACAGCTATGACCATGAGGAGGACAGCCAGTCGTCCTG [0021 ] Ml3-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0022] M13-R:AACAGCTATGACCATG。
[0023] 進一步地，步驟(2)中的擴增反應(yīng)條件為:第一階段，95°C預(yù)變性IOmin;第二階段， 變性溫度94°C30sec，退火溫度64°C90sec，延伸溫度72°C30sec，循環(huán)16次，每循環(huán)一次，所 述退火溫度降低〇.5°C;第三階段，變性溫度94°C30sec，退火溫度58°C3〇 sec，延伸溫度72°C 30sec，循環(huán)24次;第四階段，72°C10min;第五階段，擴增反應(yīng)結(jié)束，擴增產(chǎn)物在4°C下保存。 [0024]本發(fā)明的目的還在于提供一種檢測NHP2基因第4號全外顯子序列突變位點的試劑 盒，其特征在于，所述試劑盒包括樣本DNA抽提試劑;無水乙醇;檢測體系PCR反應(yīng)液、測序體 系反應(yīng)液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，其中檢測體系PCR反應(yīng)液包括一對擴增 產(chǎn)物NHP2-F和NHP2-R，測序體系反應(yīng)液包括一對測序引物Ml 3-F和Ml 3-R，其特征在于：
[0025] NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTG
[0026] NHP2-R：AACAGCTATGACCATGAGGAGGACAGCCAGTCGTCCTG
[0027] Ml3-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0028] M13-R:AACAGCTATGACCATG。
[0029] 進一步地，所述試劑盒包括NHP2基因野生型參考序列NHP2_ref。
[0030] 進一步地，所述測序純化液包括由蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶I組成的測序純化 液。
[0031] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明設(shè)計了擴增NHP2基因第4號全外顯子序列的正，反向引 物，構(gòu)建了穩(wěn)定的Touch-down PCR擴增體系，對整個第4號全外顯子序列進行擴增，包含待 檢測的所有突變位點，同時在擴增時，富集正、反向引物與模板正確配對的特異性擴增產(chǎn) 物，提高擴增特異性。此外，通過調(diào)整正、反向擴增引物的濃度、退火溫度等反應(yīng)條件，可使 擴增效率達到最佳，并采用Sanger測序法，對PCR擴增產(chǎn)物進行測序反應(yīng)擴增、純化后變性、 直接測序檢測NHP2基因第4號全外顯子序列中各突變位點的突變情況，具有靈敏度高、操作 簡單和成本低等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0032] 圖I NHP2基因 PCR擴增電泳結(jié)果圖。M為TAKARA DL2000。
[0033] 圖2樣本I NHP2基因 V126M檢測結(jié)果圖。
[0034] 圖3樣本2 NHP2基因 V126M檢測結(jié)果圖。
[0035] 圖4樣本3 NHP2基因 V126M檢測結(jié)果圖。
[0036] 圖5樣本I NHP2基因 Y139H檢測結(jié)果圖。
[0037] 圖6樣本2 NHP2基因 Y139H檢測結(jié)果圖。
[0038] 圖7樣本3 NHP2基因 Y139H檢測結(jié)果圖。
[0039] 圖8樣本I NHP2基因 X154R檢測結(jié)果圖。
[0040] 圖9樣本2 NHP2基因 X154R檢測結(jié)果圖。
[0041 ] 圖10樣本3 NHP2基因 X154R檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0042]下面結(jié)合具體實施例和附圖，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實施例中未說明 的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T常規(guī)采用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編 的《精編分子生物學(xué)實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。
[0043] 實施例1
[0044]檢測NHP2基因第4號全外顯子序列的引物，包括:擴增NHP2基因第4號全外顯子序 列的正、反向引物;其堿基序列為：
[0045] NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTG
[0046] NHP2-R：AACAGCTATGACCATGAGGAGGACAGCCAGTCGTCCTG 〇
[0047] 優(yōu)選地，所述引物還包括一對測序引物，為通用引物M13,其堿基序列為
[0048] Ml3-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
[0049] M13-R:AACAGCTATGACCATG。
[0050] 在檢測中，先利用上述正、反向引物對NHP2基因第4號全外顯子序列進行擴增，獲 得擴增產(chǎn)物，然后利用上述一對測序引物對擴增產(chǎn)物進行測序，獲得擴增產(chǎn)物的基因序列。
[0051] 檢測NHP2基因第4號全外顯子序列的試劑盒，包括:樣本DNA抽提試劑(例如使用天 根生物的試劑盒來抽提樣本DNA);無水乙醇;檢測體系PCR反應(yīng)液、測序體系反應(yīng)液、陽性對 照品、陰性對照品和空白對照品，其中
[0052] 檢測體系PCR反應(yīng)液包括：2 XPCR Buffer ;2mM dNTPs;KOD FX DNA Polymerase (lU/μΙ);擴增NHP2基因第4號全外顯子序列突變位點的正、反向引物NHP2-F(10ym)、NHP2-R (IOym)0
[0053] 測序體系反應(yīng)液包括:測序純化液、EDTA( 125mmol)、無水乙醇、75 %乙醇、HIDI (高 度去離子甲酰胺）、測序引物：NHP2_F(3 · 2μηι)、NHP2_R(3 · 2μηι)，以及Bigdye Terminator V3.1 (購買自美國Applied Biosystems公司），其中測序純化液包括奸堿性磷酸酶（SAP) 0.6U和核酸外切酶I (EXONI) 1.2U。
[0054]檢測體系PCR反應(yīng)液試劑配制如下：
[0058]陽性對照品：含有NHP2序列的溶液。
[0059] 陰性對照品:無 NHP2序列的溶液。
[0060] 空白對照品：2μ1生理鹽水或不加任何物質(zhì)。
[0061] 優(yōu)選地，該試劑盒還包括ΝΗΡ2基因野生型參考序列NHP2-ref，其堿基序列如下所 示：
[0062] ATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTGGTGACTTCCTGGCATACAGGTTGTACAGCTTTTTTCCAAACAGCACTTCTTTC CCCTCTGTAGGACCTGGGTGCAGCCGCAGGCTCCAAGCGCCCCACCTGTGTGATAATGGTCAAGCCCCATGAGGAGT ACCAGGAGGCTTACGATGAGTGCCTGGAGGAGGTGCAGTCCCTGCCCCTACCCCTATGAGGGGCTCCGGTAGCACCT GGGCACCTGCCGCTGGAAGCTATTGGGCTGGCAGCAGGACGACTGGCTGTCCTCCT。
[0063] 實施例2 [0064] 檢測流程：
[0065] (1)利用血液DNA抽提試劑盒(天根生物)提取血液樣本中的基因組DNA:
[0066] 1)抽取500uL血液加入1000 uL紅細胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛 倒混勾幾次。3000rpm離心5min，吸去上清，留下白細胞沉淀，加200uL緩沖液GA，振蕩至徹底 混勻。
[0067] 2)加入20μ 1蛋白酶K溶液，混勻。
[0068] 3)加入200μ1緩沖液GB，充分顛倒混勻，70 °C放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，簡短離心 以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0069] 4)加入200μ1無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心 以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0070] 5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管 中），12，000rpm( 13，400 X g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
[0071] 6)向吸附柱CB3中加入500μ1緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）， 12，000rpm( 13，400 X g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0072] 7)向吸附柱CB3中加入700μ1漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）， 12，000rpm( 13，400 X g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0073] 8)向吸附柱CB3中加入500μ1漂洗液PW，12，000rpm(13，400 X g)離心30秒，倒掉廢 液。
[0074] 9)將吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm(13，400 X g)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸 附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0075] 10)將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 100μΙ 洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12，000rpm( 13，400 X g)離心2分鐘，將溶液收集到離心管 中，獲得血液基因組DNA溶液。
[0076] (2)試劑配置:按檢測人份數(shù)配置檢測體系PCR反應(yīng)液各ΧμL，每人份18μ1分裝:X = 18μ1反應(yīng)液X (η份樣本+1份陽性對照+1份陰性對照+1份空白對照)η為檢測樣本數(shù)。
[0077] (3)加樣:將2ul步驟（1)中獲得的血液基因組DNA溶液加入到檢測體系PCR反應(yīng)液 中；對陽性對照實驗而言，直接加2ul陽性對照品；對陰性對照實驗而言，直接加2ul陰性對 照品；對空白對照實驗而言，加2ul生理鹽水或不加任何物質(zhì)。
[0078] (4)Touch-down PCR擴增:檢測在常規(guī)PCR儀上進行，獲得PCR擴增產(chǎn)物，可用儀器 包括ABI veriti(美國Applied Biosystems公司）等。反應(yīng)條件如下：
[0080] (5) Sanger 測序：
[0081]取9μ1 PCR擴增產(chǎn)物與2μ1測序純化液。按照以下程序進行純化，從而獲得純化產(chǎn) 物：
[0084] 將ΙμL純化產(chǎn)物分別與測序引物M13-F(3.2ym)和M13-R(3.2ym)按照如下體系進行 淚會.
[0089] 沉淀環(huán)節(jié)：
[0090] 向完成測序反應(yīng)的產(chǎn)物中加入2μ1 125mmol的EDTA，靜置5min;加入15ml無水乙 醇，漩禍混勾；3700rpm離心30min;倒置離心15sec，加入50ml 70%乙醇，漩禍混勾；3700印111 離心15min;倒置離心15sec，置于95°C金屬浴上；加入10μ1 HIDI后進行變性試驗。變性程 序：

[0093] 變性程序結(jié)束后，上測序儀(ABI3730)測序，獲得PCR擴增產(chǎn)物的基因序列。
[0094] (6)結(jié)果判斷:將(5)中獲得的基因序列與NHP2基因野生型參考序列NHP2-ref進行 比對，根據(jù)實際突變情況對結(jié)果進行報告。
[0095] 實施例3
[0096] 采用本發(fā)明核酸檢測試劑盒檢測臨床樣本。
[0097] 取送檢先天性角化不良癥患者抗凝血樣本20例，按實施例2所述檢測流程提取樣 本中的基因組DNA，配制試劑并檢測。
[0098]將2ul按照實施例2中所述檢測流程提取出的每份樣本基因組DNA溶液加入檢測體 系PCR反應(yīng)液中。同時做陽性、陰性和空白對照。用普通PCR儀檢測，時間為160分鐘。
[0099]電泳結(jié)果如圖1所示，表明本發(fā)明所述引物NHP2-F、NHP2-R對血液樣本能有效擴 增，且條帶單一。
[0100] 樣品1的NHP2基因 V126M正向測序結(jié)果如圖2所示，為野生型，未檢測出V126M突變。 [0101] 樣品2的NHP2基因 V126M正向測序結(jié)果如圖3所示，為野生型，未檢測出V126M突變。 [0102] 樣品3的NHP2基因 V126M正向測序結(jié)果如圖4所示，為野生型，未檢測出V126M突變。 [0103] 樣品1的NHP2基因 Y139H正向測序結(jié)果如圖5所示，為野生型，未檢測出Y139H突變。 [0104] 樣品2的NHP2基因 Y139H正向測序結(jié)果如圖6所示，為野生型，未檢測出Y139H突變。 [0105] 樣品3的NHP2基因 Y139H正向測序結(jié)果如圖7所示，為野生型，未檢測出Y139H突變。
[0106] 樣品1的NHP2基因 X154R正向測序結(jié)果如圖5所示，為野生型，未檢測出X154R突變。
[0107] 樣品2的NHP2基因 X154R正向測序結(jié)果如圖6所示，為野生型，未檢測出X154R突變。
[0108] 樣品3的NHP2基因 X154R正向測序結(jié)果如圖7所示，為野生型，未檢測出X154R突變。 [0109] 檢測結(jié)果如下表：

[0111]從檢測結(jié)果可以看出，本發(fā)明所述引物已經(jīng)把NHP2基因第4號外顯子全序列包括 在內(nèi)了，并且測序結(jié)果完全準(zhǔn)確。對陽性標(biāo)本的檢測表明本發(fā)明所述引物和方法及試劑盒 能夠檢測出NHP2基因突變。
【主權(quán)項】
1. 檢測NHP2基因第4號全外顯子序列的引物，其特征在于，包括:擴增NHP2基因第4號全 外顯子的正、反向引物;其堿基序列為： NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTG NHP2-R：AACAGCTATGACCATGAGGAGGACAGCCAGTCGTCCTG 〇2. 如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物還包括一對測序引物，為通用引物 Ml 3，其喊基序列為： NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGT NHP2-R:AACAGCTATGACCATG。3. 如權(quán)利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述正、反向引物的使用濃度比為： NHP2-F:NHP2-R=l:l〇4. 如權(quán)利要求1至2之一所述的引物，其特征在于，所述一對測序引物的使用濃度比為： M13-F:M13-R=l:l〇5. 如權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于，所述正、反向擴增引物的擴增反應(yīng)條件為:第 一階段，95°C預(yù)變性lOmin;第二階段，變性溫度94°C30sec，退火溫度64°C90sec，延伸溫度 72°C3〇 sec，循環(huán)16次，每循環(huán)一次，所述退火溫度降低0.5°C;第三階段，變性溫度94°C 30sec，退火溫度58°C30sec，延伸溫度72°C30sec，循環(huán)24次；第四階段，72°C10min;第五階 段，擴增反應(yīng)結(jié)束，擴增產(chǎn)物在4 °C下保存。6. -種檢測NHP2基因第4號全外顯子序列的方法，其包括如下步驟： (1)提取樣本〇嫩； ⑵利用一對擴增引物NHP2-F和NHP2-R對(1)中的DNA進行擴增，獲得擴增產(chǎn)物； (3) 利用一對測序引物Ml 3-F和Ml 3-R對⑵中的擴增產(chǎn)物進行測序，獲得所述擴增產(chǎn)物 的基因序列； (4) 將(3)中的基因序列與NHP2基因野生型參考序列NHP2-ref進行比較，確定突變位點 是否存在，其特征在于， NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTG NHP2-R：AACAGCTATGACCATGAGGAGGACAGCCAGTCGTCCTG NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGT NHP2-R:AACAGCTATGACCATG。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)的擴增反應(yīng)條件為:第一階段，95°C 預(yù)變性lOmin;第二階段，變性溫度94°C30sec，退火溫度64°C90sec，延伸溫度72°C30sec，循 環(huán)16次，每循環(huán)一次，所述退火溫度降低0.5°C;第三階段，變性溫度94°C3〇 sec，退火溫度58 °C30sec，延伸溫度72°C30sec，循環(huán)24次;第四階段，72°C10min;第五階段，擴增反應(yīng)結(jié)束， 擴增產(chǎn)物在4°C下保存。
【文檔編號】C12Q1/68GK106086215SQ201610663606
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月13日 公開號201610663606.2, CN 106086215 A, CN 106086215A, CN 201610663606, CN-A-106086215, CN106086215 A, CN106086215A, CN201610663606, CN201610663606.2
【發(fā)明人】單戰(zhàn), 林有升, 王淑一
【申請人】杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司