快速鑒定辣椒雜交種純度的方法及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速鑒定辣椒雜交種純度的方法及其應(yīng)用，涉及辣椒雜交種的純度鑒定技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括以下步驟：A、提取辣椒雜交種子的DNA；B、以提取的DNA作為模板，配制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR體系，利用SSR引物對(duì)提取出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：94℃～96℃變性1～20s，55℃退火1～20s，72℃延伸1～20s，33～35個(gè)循環(huán)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；C、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離；D、根據(jù)電泳分離出的條帶，計(jì)算種子純度。本發(fā)明能夠?qū)F(xiàn)有的PCR所需時(shí)間縮短77.1％，大幅提高SSR方法測(cè)定種純的速度，能夠滿(mǎn)足大批量生產(chǎn)，同時(shí)無(wú)需使用昂貴進(jìn)口儀器，從而大幅降低早期投入與后期生產(chǎn)成本。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及辣椒雜交種純度鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速鑒定辣椒雜交種純 度的方法及其應(yīng)用。 快速鑒定辣椒雜交種純度的方法及其應(yīng)用
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，我國(guó)農(nóng)作物雜交種的純度需達(dá)到或超過(guò)法律規(guī)定的比例方可上市銷(xiāo)售。為 檢驗(yàn)雜交種的純度，現(xiàn)有大致三種方法:a.包括田間小區(qū)種植檢驗(yàn)法在內(nèi)的形態(tài)檢驗(yàn)法;b. 包括同工酶電泳法在內(nèi)的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)檢驗(yàn)法;c ·包括SSR(Simple Sequence Repeat， 簡(jiǎn)單重復(fù)序列)分子標(biāo)記技術(shù)在內(nèi)的DNA分子標(biāo)記檢驗(yàn)法。其中，SSR分子標(biāo)記檢驗(yàn)法因其重 復(fù)性和穩(wěn)定性?xún)?yōu)異，而在近年來(lái)應(yīng)用得越來(lái)越廣泛。SSR又稱(chēng)微衛(wèi)星序列，是指真核生物的 基因組中散布的大量串聯(lián)重復(fù)序列，其中2-4個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的短重復(fù)序列在不同品種之間 具有高度多態(tài)性，而這種SSR在結(jié)構(gòu)上的最大特點(diǎn)是兩端的序列保守，因此可設(shè)計(jì)與兩端保 守序列互補(bǔ)的引物，對(duì)SSR進(jìn)行PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增， 來(lái)揭示不同品種間SSR序列長(zhǎng)度的多態(tài)性。
[0003] 這其中的PCR步驟需使用到PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物A、引物B和DNA 模板在內(nèi)的6種組分，目前已有許多研究者進(jìn)行過(guò)對(duì)各組分用量的優(yōu)化嘗試，以期降低PCR 步驟中的試劑成本。但當(dāng)這一技術(shù)被研究機(jī)構(gòu)或企事業(yè)單位應(yīng)用到大批量生產(chǎn)實(shí)踐中時(shí)， 除經(jīng)濟(jì)成本外，往往也期望能控制時(shí)間成本。以當(dāng)下普遍使用的標(biāo)準(zhǔn)PCR程序?yàn)槔?94°C預(yù) 變性3min，（94°C變性40s，55°C退火40s，72°C延伸4〇8)，35個(gè)循環(huán)，72°(：延伸1〇1^11，此擴(kuò)增 條件運(yùn)行一次耗時(shí)約為1小時(shí)43分鐘。以一天8小時(shí)工作制計(jì)，一臺(tái)PCR儀僅可運(yùn)行4.7次，以 一塊96孔PCR板檢測(cè)96個(gè)樣品計(jì)，一天可檢測(cè)451個(gè)樣品。再以一個(gè)批次的種子需檢100粒 計(jì)，即一天檢4.5個(gè)批次。這對(duì)于種子大量生產(chǎn)的旺季期內(nèi)幾千個(gè)批次的檢驗(yàn)需求來(lái)說(shuō)，無(wú) 疑杯水車(chē)薪。為解決這一問(wèn)題，目前已有國(guó)外廠商推出快速PCR儀，通過(guò)加快升降溫速度來(lái) 縮短一次PCR運(yùn)行所需的時(shí)間。然而這樣一臺(tái)PCR儀比之普通型號(hào)的PCR儀要貴很多，普通 PCR儀約4萬(wàn)多，而快速PCR儀需12萬(wàn)左右，因?yàn)樗募訜崮K使用的是世界上導(dǎo)熱效果最好 的金屬-黃金。而且，使用快速PCR儀時(shí)，如想達(dá)到最佳效果，還需配套使用較貴的特殊設(shè)計(jì) 的PCR板，不利于大批量生產(chǎn)中的成本控制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了克服上述【背景技術(shù)】的不足，提供一種快速鑒定辣椒雜交種純 度的方法及其應(yīng)用，本發(fā)明能夠?qū)F(xiàn)有的PCR所需時(shí)間縮短77.1 %，大幅提高SSR方法測(cè)定 種純的速度，能夠滿(mǎn)足大批量生產(chǎn)，同時(shí)無(wú)需使用昂貴進(jìn)口儀器，從而大幅降低早期投入與 后期生產(chǎn)成本。
[0005] 本發(fā)明提供一種快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，包括以下步驟：
[0006] A、選取辣椒雜交種子，分別提取每一粒種子中的DNA;
[0007] B、以每一粒種子所提取的DNA作為模板，各配制一份聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR體系，利 用SSR引物對(duì)提取出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增;所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94 °C變性1~20s，55 °C 退火1~20s，72°C延伸1~20s，33~35個(gè)循環(huán)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0008] C、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離；
[0009] D、選取的辣椒雜交種子中，有一部分父本、母本種子，根據(jù)電泳分離出的條帶，判 斷雜交種、父本、母本，計(jì)算種子純度;雜交種純度的計(jì)算公式為:雜交種的數(shù)量/測(cè)定的種 子總數(shù)X 100%。
[0010]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C變性1~3s，55°C退火 1~3s，72°C延伸1~3s，33~35個(gè)循環(huán)。
[0011 ]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，選取的辣椒品種為藏式辣椒品種時(shí)，所述SSR引物的正 向引物序列如SEQ ID No:l所示，反向引物序列如SEQ ID No:2所示。
[0012]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟A的具體操作如下：
[0013] Al、選取至少100粒的辣椒雜交種子，浸種4小時(shí)，然后催芽36小時(shí)；
[0014] A2、選取健康的芽根作為提取材料，每個(gè)芽根截取Icm放入一個(gè)離心管中；每個(gè)離 心管的處理如下：
[0015] 將2乂〇^提取緩沖液預(yù)熱至65°(：后，取80(^提取緩沖液加入離心管中；使用磨 樣機(jī)磨碎材料，65°C水浴40min，水浴過(guò)程中搖勻離心管；向離心管中加入與提取緩沖液等 體積的氯仿，搖勻，靜置I Omin;將離心管放入離心機(jī)中以12000轉(zhuǎn)/分鐘的速率離心I Omin; [0016]另取一個(gè)干凈的離心管，吸取上清液到該離心管中，再向該離心管中加入400yL預(yù) 冷的異丙醇，在_20°C的溫度下放置1小時(shí);將該離心管放入離心機(jī)中以12000轉(zhuǎn)/分鐘的速 率離心10min，除去上清液，加入70 %乙醇洗滌沉淀后，除去上清液;烘干該離心管，加入40μ L水溶解該離心管內(nèi)的沉淀，得到辣椒雜交種子的DNA溶液。
[0017] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR體系包括:含Mg2+的10 X PCR緩沖 液、濃度為lmmol/L的三磷酸脫氧核糖核苷dNTP、濃度為0.5ymol/L的正向SSR引物、濃度為 0 · 5μπιο 1/L的反向 SSR引物、2 · 5ng/yL的DNA、0 · 025U/yL的Taq DNA聚合酶、雙蒸水。
[0018] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟C的具體過(guò)程如下：
[0019]配制濃度為3 %的瓊脂糖凝膠，制作膠板;將所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別點(diǎn)樣后，120V電 壓條件下電泳45分鐘，電泳結(jié)束后，將膠板放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。
[0020] 在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，步驟D中，所述判斷雜交種、父本、母本的具體過(guò)程如 下：
[0021] 電泳分離出的條帶中，父本、母本分別有不同的帶型，而子一代雜交種有父母本兩 條帶;如電泳分離出的條帶為雙條帶，則判定該種子為子一代雜交種，如為母本型條帶則判 定該種子為母本，如為父本型條帶則判定該種子為父本。
[0022] 本發(fā)明還提供上述的方法在藏式辣椒品種的辣椒雜交種純度鑒定中的應(yīng)用，包括 以下過(guò)程：
[0023]選取藏式辣椒的雜交種子，分別提取每一粒種子中的DNA;
[0024]以每一粒種子所提取的DNA作為模板，各配制一份聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR體系，利用 SSR引物對(duì)提取出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述SSR引物的正向引物序列如SEQ ID No: 1所示，反 向引物序列如SEQ ID如：2所示;所述?0財(cái)廣增的反應(yīng)條件為:94°(：變性18,55°(：退火18,72 °C延伸I s，35個(gè)循環(huán)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0025] 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離;選取的辣椒雜交種子中，有一部分 父本、母本種子，根據(jù)電泳分離出的條帶，判斷雜交種、父本、母本，計(jì)算種子純度;雜交種純 度的計(jì)算公式為:雜交種的數(shù)量/測(cè)定的種子總數(shù)X 100%。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：
[0027] 1、自從1985年P(guān)CR作為一種專(zhuān)利所屬的生物技術(shù)面世以來(lái)，科研工作者長(zhǎng)期依賴(lài) 于標(biāo)準(zhǔn)的PCR程序進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即94°C預(yù)變性3min，（94°C變性4〇8,55°(：退火4〇8,72°(：延伸 40s )，35個(gè)循環(huán)，72 °C延伸IOmin。該標(biāo)準(zhǔn)程序中使用的時(shí)間長(zhǎng)度，在各地不同的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)也 幾乎不做大幅度的更改。而本發(fā)明的目的正是要打破這種常規(guī)思路，大大壓縮運(yùn)行一次PCR 所需的時(shí)間。本發(fā)明將PCR程序中各個(gè)溫度下的溫育時(shí)間經(jīng)過(guò)調(diào)整，改為(94°C變性1~3s， 60°C退火1~3s，72°C延伸1~3s)，33~35個(gè)循環(huán)，并配合簡(jiǎn)單快捷的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行 檢測(cè)，提高了整套種純鑒定程序的速度。針對(duì)縮短PCR時(shí)間這一需求，目前已有廠商推出昂 貴的快速PCR儀和配套使用的特殊耗材，而本發(fā)明使用普通PCR儀與普通耗材即可，大幅降 低早期投入與后期生產(chǎn)成本。
[0028] 2、本發(fā)明所需的PCR時(shí)間最少為24分鐘，將現(xiàn)有的的PCR所需時(shí)間縮短77.1 %，節(jié) 約電力，提高機(jī)器利用率，每臺(tái)PCR儀每8小時(shí)可檢測(cè)的種子由原先的4.5個(gè)批次提高到19個(gè) 批次，增產(chǎn)322 %。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1是采用標(biāo)準(zhǔn)PCR程序得到的藏式辣椒雜交種子DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果 圖；
[0030] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖；
[0031] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例2中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖；
[0032]圖4是本發(fā)明實(shí)施例3中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖；
[0033]圖5是本發(fā)明實(shí)施例4中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖；
[0034]圖6是本發(fā)明實(shí)施例5中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0036]本發(fā)明實(shí)施例提供一種快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，包括以下步驟：
[0037] A、選取藏式辣椒品種的辣椒雜交種子，提取DNA;
[0038] 步驟A的具體過(guò)程如下：
[0039] Al、選取至少100粒藏式辣椒品種的辣椒雜交種子，浸種4小時(shí)，然后催芽36小時(shí)； [0040] A2、選取健康的芽根作為提取材料，每個(gè)芽根截取Icm放入一個(gè)離心管中；每個(gè)離 心管的處理如下：
[0041 ] 將2 X CTAB提取緩沖液預(yù)熱至65°C后，取800yL提取緩沖液加入離心管中；使用磨 樣機(jī)磨碎材料，65°C水浴40min，水浴過(guò)程中搖勻離心管；向離心管中加入與提取緩沖液等 體積的氯仿，搖勻，靜置I Omin;將離心管放入離心機(jī)中以12000轉(zhuǎn)/分鐘的速率離心I Omin; [0042]另取一個(gè)干凈的離心管，吸取上清液到該離心管中，再向該離心管中加入400yL預(yù) 冷的異丙醇，在_20°C的溫度下放置1小時(shí);將該離心管放入離心機(jī)中以12000轉(zhuǎn)/分鐘的速 率離心10min，除去上清液，加入70 %乙醇洗滌沉淀后，除去上清液;烘干該離心管，加入40μ L水溶解該離心管內(nèi)的沉淀，得到辣椒雜交種子的DNA溶液。
[0043] 2 X CTAB提取緩沖液的配制方法為:在一定量的水中加入100mL濃度為1Μ、ΡΗ為8.5 的三(羥甲基）氨基甲烷T(mén)ris-HCl，40ml濃度為(h5M、PH為8·0的乙二胺四乙酸EDTA，81·816g 的氯化鈉 NaCl，混勻后加20g的十六烷基三甲基溴化銨CTAB，溶解，定容至IL，得到上述的2 X CTAB提取緩沖液。
[0044] B、以每一粒種子所提取的DNA作為模板，各配制一份的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR體系， 利用SSR引物對(duì)提取出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增;PCR擴(kuò)增條件為:94 °C變性1~20s，55 °C退火1~ 20s，72°C延伸1~20s，33~35個(gè)循環(huán)，循環(huán)前不進(jìn)行94°C預(yù)變性過(guò)程，循環(huán)后也不進(jìn)行72°C 延伸過(guò)程;優(yōu)選的，PCR擴(kuò)增條件為:94°C變性1~3s，55°C退火1~3s，72°C延伸1~3s，33~ 35個(gè)循環(huán)，循環(huán)前不進(jìn)行94°C預(yù)變性過(guò)程，循環(huán)后也不進(jìn)行72°C延伸過(guò)程;PCR擴(kuò)增的過(guò)程 中，采用的擴(kuò)增儀為杭州博日LifeEco基因擴(kuò)增儀，該擴(kuò)增儀具有兩種溫控模式，BLOCK模式 和TUBE模式，本方法中，控溫模式設(shè)置為BLOCK模式。
[0045] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR體系中，與藏式辣椒品種的辣椒雜交種子DNA相匹配的SSR引 物名稱(chēng)為CA117,其正向引物序列如SEQ ID No:l所示，反向引物序列如SEQ ID No:2所示； [0046] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR體系的體積可以為20yL，每一份20yL的PCR體系具體包括:2yL 含Mg2+的10XPCR緩沖液、2μL濃度為10mmOl/L的三磷酸脫氧核糖核苷dNTP、2μL濃度為5μ mol/L的CA117正向引物、度為5ymol/L的CA117反向引物、50ng的DNA、0.5U的Taq DNA 聚合酶，剩余的為雙蒸水。
[0047] C、將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離；
[0048] 步驟C的具體過(guò)程如下：
[0049] 配制濃度為3 %的瓊脂糖凝膠，制作膠板;將所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別點(diǎn)樣后，120V電 壓條件下電泳45分鐘，電泳結(jié)束后，將膠板放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。
[0050] D、根據(jù)電泳分離出的條帶，計(jì)算種子純度；
[0051] 步驟D的具體過(guò)程為：電泳分離出的條帶中，父本、母本分別有不同的帶型，而子一 代雜交種有父母本兩條帶;如電泳分離出的條帶為雙條帶，則判斷該種子為子一代雜交種， 如為母本型條帶則判斷該種子為母本，如為父本型條帶則判斷該種子為父本;雜交種純度 的計(jì)算公式為:子一代雜交種的數(shù)量/測(cè)定的種子總數(shù)X 1〇〇%。
[0052]下面通過(guò)8個(gè)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。
[0053] 實(shí)施例1:
[0054]本實(shí)施例提供一種快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，包括以下步驟：
[0055]選取至少100粒藏式辣椒品種的辣椒雜交種子，浸種4小時(shí)，然后催芽36小時(shí);選取 健康的芽根作為提取材料，每個(gè)芽根截取Icm放入離心管中，共收集100管;每個(gè)離心管的處 理如下：
[0056] 將2 X CTAB提取緩沖液預(yù)熱至65°C后，取800yL提取緩沖液加入離心管中；使用磨 樣機(jī)磨碎材料，65°C水浴40min，水浴過(guò)程中搖勻離心管；向離心管中加入與提取緩沖液等 體積的氯仿，搖勻，靜置I Omin;將離心管放入離心機(jī)中以12000轉(zhuǎn)/分鐘的速率離心I Omin; [0057]另取一個(gè)干凈的離心管，吸取上清液到該離心管中，再向該離心管中加入400yL預(yù) 冷的異丙醇，在_20°C的溫度下放置1小時(shí);將該離心管放入離心機(jī)中以12000轉(zhuǎn)/分鐘的速 率離心10min，除去上清液，加入70 %乙醇洗滌沉淀后，除去上清液;烘干該離心管，加入40μ L水溶解該離心管內(nèi)的沉淀，得到辣椒雜交種子的DNA溶液。
[0058]以每一粒種子所提取的DNA作為模板，各配制一份的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR體系，利 用SSR引物對(duì)提取出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增;PCR擴(kuò)增條件為:94 °C變性20s，55 °C退火20 s，72 °C 延伸20s，33個(gè)循環(huán)，循環(huán)前不需要進(jìn)行94°C預(yù)變性過(guò)程，循環(huán)后也不需要進(jìn)行72°C延伸過(guò) 程；
[0059]聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR體系中，與藏式辣椒品種的辣椒雜交種子DNA相匹配的SSR引 物名稱(chēng)為CA117,其正向引物序列如SEQ ID No:l所示，反向引物序列如SEQ ID No:2所示； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR體系的體積為20yL，包括：2yL含Mg2+的10 X PCR緩沖液、2yL濃度為 lOmmol/L的三磷酸脫氧核糖核苷dNTP、2yL濃度為5ymol/L的CA117正向引物、2yL濃度為5μ mol/L的CA117反向引物、50ng的DNA、0.5U的Taq DNA聚合酶，剩余的為雙蒸水。
[0060] 配制濃度為3%的瓊脂糖凝膠，制作膠板;將100管PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別點(diǎn)樣后，120V 電壓條件下電泳45分鐘，電泳結(jié)束后，將膠板放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。
[0061] 電泳分離出的條帶中，父本、母本分別有不同的帶型，而子一代雜交種有父母本兩 條帶;參見(jiàn)圖1所示，如電泳分離出的條帶為雙條帶，則判斷該種子為子一代雜交種，如為母 本型條帶則判斷該種子為母本，如為父本型條帶則判斷該種子為父本;雜交種純度的計(jì)算 公式為:子一代雜交種的數(shù)量/100 X100 %。
[0062] 實(shí)施例2:
[0063]本實(shí)施例提供一種快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，其中，
[0064] PCR擴(kuò)增條件為：94 °C變性2s，55 °C退火20s，72 °C延伸20s，34個(gè)循環(huán)，循環(huán)前不需 要進(jìn)行94°C預(yù)變性過(guò)程，循環(huán)后也不需要進(jìn)行72°C延伸過(guò)程；
[0065] 除PCR擴(kuò)增條件外，本實(shí)施例中的其余步驟均與實(shí)施例1相同；
[0066] 本實(shí)施例中的電泳分離結(jié)果參見(jiàn)圖3所示。
[0067] 實(shí)施例3:
[0068]本實(shí)施例提供一種快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，其中，
[0069] PCR擴(kuò)增條件為:94°C變性2s，55°C退火2s，72°C延伸20s，35個(gè)循環(huán)，循環(huán)前不需要 進(jìn)行94°C預(yù)變性過(guò)程，循環(huán)后也不需要進(jìn)行72°C延伸過(guò)程；
[0070]除PCR擴(kuò)增條件外，本實(shí)施例中的其余步驟均與實(shí)施例1相同；
[0071 ]本實(shí)施例中的電泳分離結(jié)果參見(jiàn)圖4所示。
[0072] 實(shí)施例4:
[0073]本實(shí)施例提供一種快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，其中，
[0074] PCR擴(kuò)增條件為:94°C變性2s，55°C退火2s，72°C延伸2s，34個(gè)循環(huán)，循環(huán)前不需要 進(jìn)行94°C預(yù)變性過(guò)程，循環(huán)后也不需要進(jìn)行72°C延伸過(guò)程；
[0075] 除PCR擴(kuò)增條件外，本實(shí)施例中的其余步驟均與實(shí)施例1相同；
[0076] 本實(shí)施例中的電泳分離結(jié)果參見(jiàn)圖5所示。
[0077] 實(shí)施例5:
[0078]本實(shí)施例提供一種快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，其中，
[0079] PCR擴(kuò)增條件為:94°C變性ls，55°C退火ls，72°C延伸ls，35個(gè)循環(huán)，循環(huán)前不需要 進(jìn)行94°C預(yù)變性過(guò)程，循環(huán)后也不需要進(jìn)行72°C延伸過(guò)程；
[0080]除PCR擴(kuò)增條件外，本實(shí)施例中的其余步驟均與實(shí)施例1相同；
[0081 ]本實(shí)施例中的電泳分離結(jié)果參見(jiàn)圖6所示。
[0082] 實(shí)施例6:
[0083]本實(shí)施例提供一種快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，其中，
[0084] PCR擴(kuò)增條件為:94°C變性3s，55°C退火ls，72°C延伸ls，33個(gè)循環(huán)，循環(huán)前不需要 進(jìn)行94°C預(yù)變性過(guò)程，循環(huán)后也不需要進(jìn)行72°C延伸過(guò)程；
[0085]除PCR擴(kuò)增條件外，本實(shí)施例中的其余步驟均與實(shí)施例1相同。
[0086] 實(shí)施例7:
[0087]本實(shí)施例提供一種快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，其中，
[0088] PCR擴(kuò)增條件為:94°C變性ls，55°C退火3s，72°C延伸ls，34個(gè)循環(huán)，循環(huán)前不需要 進(jìn)行94°C預(yù)變性過(guò)程，循環(huán)后也不需要進(jìn)行72°C延伸過(guò)程；
[0089] 除PCR擴(kuò)增條件外，本實(shí)施例中的其余步驟均與實(shí)施例1相同。
[0090] 實(shí)施例8:
[0091 ]本實(shí)施例提供一種快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，其中，
[0092] PCR擴(kuò)增條件為:94°C變性ls，55°C退火ls，72°C延伸3s，35個(gè)循環(huán)，循環(huán)前不需要 進(jìn)行94°C預(yù)變性過(guò)程，循環(huán)后也不需要進(jìn)行72°C延伸過(guò)程；
[0093]除PCR擴(kuò)增條件外，本實(shí)施例中的其余步驟均與實(shí)施例1相同。
[0094]電泳分離結(jié)果分析：
[0095] 對(duì)采用標(biāo)準(zhǔn)PCR程序得到的藏式辣椒雜交種子DNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離， 結(jié)果參見(jiàn)圖1所示。將現(xiàn)有技術(shù)與本實(shí)施例的PCR反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行對(duì)比，圖2~6中的條帶逐漸 變暗，但是仍然可以清楚分辨。參見(jiàn)圖6所示，圖中"Om/lslsls/Om"表示優(yōu)化后的PCR程序： 94°C預(yù)變性0min;94°C變性ls，55°C退火ls，72°C延伸ls，35個(gè)循環(huán);72°C延伸Omin。其余的 以此類(lèi)推?？梢钥闯觯瑢?shí)施例5中的PCR擴(kuò)增條件是在滿(mǎn)足電泳條帶清晰度的前提下用時(shí)最 少的PCR擴(kuò)增條件。
[0096] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)行各種修改和變型，倘若這些修改和變 型在本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則這些修改和變型也在本發(fā)明的保護(hù)范圍 之內(nèi)。
[0097]說(shuō)明書(shū)中未詳細(xì)描述的內(nèi)容為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的現(xiàn)有技術(shù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，其特征在于，包括以下步驟： A、 選取辣椒雜交種子，分別提取每一粒種子中的DNA; B、 以每一粒種子所提取的DNA作為模板，各配制一份聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR體系，利用SSR 引物對(duì)提取出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增;所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94 °C變性1~20 s，55 °C退火1 ~20s，72 °C延伸1~20s，33~35個(gè)循環(huán)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； C、 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離； D、 選取的辣椒雜交種子中，有一部分父本、母本種子，根據(jù)電泳分離出的條帶，判斷雜 交種、父本、母本，計(jì)算種子純度;雜交種純度的計(jì)算公式為:雜交種的數(shù)量/測(cè)定的種子總 數(shù) X100%〇2. 如權(quán)利要求1所述的快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的 反應(yīng)條件為:94°C變性1~3s，55°C退火1~3s，72°C延伸1~3s，33~35個(gè)循環(huán)。3. 如權(quán)利要求1所述的快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，其特征在于:選取的辣椒品種 為藏式辣椒品種時(shí)，所述SSR引物的正向引物序列如SEQ ID No: 1所示，反向引物序列如SEQ ID No:2所示。4. 如權(quán)利要求1所述的快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，其特征在于，步驟A的具體操 作如下： A1、選取至少100粒的辣椒雜交種子，浸種4小時(shí)，然后催芽36小時(shí)； A2、選取健康的芽根作為提取材料，每個(gè)芽根截取lcm放入一個(gè)離心管中；每個(gè)離心管 的處理如下： 將2XCTAB提取緩沖液預(yù)熱至65°C后，取800yL提取緩沖液加入離心管中；使用磨樣機(jī) 磨碎材料，65°C水浴40min，水浴過(guò)程中搖勻離心管；向離心管中加入與提取緩沖液等體積 的氯仿，搖勻，靜置lOmin;將離心管放入離心機(jī)中以12000轉(zhuǎn)/分鐘的速率離心10min; 另取一個(gè)干凈的離心管，吸取上清液到該離心管中，再向該離心管中加入400yL預(yù)冷的 異丙醇，在_20°C的溫度下放置1小時(shí);將該離心管放入離心機(jī)中以12000轉(zhuǎn)/分鐘的速率離 心lOmin，除去上清液，加入70%乙醇洗滌沉淀后，除去上清液;烘干該離心管，加入40yL水 溶解該離心管內(nèi)的沉淀，得到辣椒雜交種子的DNA溶液。5. 如權(quán)利要求1所述的快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，其特征在于，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR體系包括:含Mg2+的10 X PCR緩沖液、濃度為lmmo 1/L的三磷酸脫氧核糖核苷dNTP、濃度為 0.5ymol/L 的正向 SSR 引物、濃度為 0.5ymol/L 的反向 SSR 引物、2.5ng/yL 的 DNA、0.025U/yL 的 Taq DNA聚合酶、雙蒸水。6. 如權(quán)利要求1所述的快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，其特征在于，步驟C的具體過(guò) 程如下： 配制濃度為3 %的瓊脂糖凝膠，制作膠板;將所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別點(diǎn)樣后，120V電壓條 件下電泳45分鐘，電泳結(jié)束后，將膠板放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。7. 如權(quán)利要求1所述的快速鑒定辣椒雜交種純度的方法，其特征在于，步驟D中，所述判 斷雜交種、父本、母本的具體過(guò)程如下： 電泳分離出的條帶中，父本、母本分別有不同的帶型，而子一代雜交種有父母本兩條 帶;如電泳分離出的條帶為雙條帶，則判定該種子為子一代雜交種，如為母本型條帶則判定 該種子為母本，如為父本型條帶則判定該種子為父本。8.如權(quán)利要求1所述的方法在藏式辣椒品種的辣椒雜交種純度鑒定中的應(yīng)用，其特征 在于，包括以下過(guò)程： 選取藏式辣椒的雜交種子，分別提取每一粒種子中的DNA; 以每一粒種子所提取的DNA作為模板，各配制一份聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR體系，利用SSR引 物對(duì)提取出的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述SSR引物的正向引物序列如SEQ ID No: 1所示，反向引 物序列如SEQ ID No : 2所示;所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:94°C變性1 s，55 °C退火1 s，72 °C延 伸Is，35個(gè)循環(huán)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離；選取的辣椒雜交種子中，有一部分父 本、母本種子，根據(jù)電泳分離出的條帶，判斷雜交種、父本、母本，計(jì)算種子純度;雜交種純度 的計(jì)算公式為:雜交種的數(shù)量/測(cè)定的種子總數(shù)X100%。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106086225SQ201610720358
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年8月25日
【發(fā)明人】戴祖云, 劉永忠, 周阜宣, 趙傳奇
【申請(qǐng)人】安徽江淮園藝種業(yè)股份有限公司