豬圓環(huán)病毒2型的pcr檢測方法、所用引物及檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種豬圓環(huán)病毒2型的PCR檢測方法、所用引物及檢測試劑盒，所述PCR檢測方法操作簡單、技術(shù)要求低，適合于臨床檢測。所述PCR檢測方法，包括以下步驟：（1）以樣品中提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中PCR擴(kuò)增的引物序列為：上游5?TGGGATGATCTACTGAGAC?3；下游5?ATTTCATATGGAAATTCAG?3；（2）對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳；（3）分析、判定結(jié)果，樣品出現(xiàn)268bp擴(kuò)增條帶，且陰性對(duì)照無相應(yīng)的擴(kuò)增條帶時(shí)，結(jié)果為陽性。
【專利說明】豬圓環(huán)病毒2型的PCR檢測方法、所用引物及檢測試劑盒
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒2型的PCR檢測方法、所用引物及檢測試劑盒。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus , PCV)是已發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒，屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的成員，為單鏈環(huán)狀病毒。PCV有I型(PCVl)和2型(PCV2)兩種基因型，其中PCVl不致病，而PCV2是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原之一。PMWS于1997年在加拿大首次被發(fā)現(xiàn)，發(fā)病豬主要表現(xiàn)為生長遲緩，皮膚蒼白，呼吸困難伴有死亡。在我國，2000年郎洪武通過ELISA的方法檢測從北京、河北、山東、天津、江西、吉林、河南7省采集的559份各類豬血清樣品，發(fā)現(xiàn)其檢出陽性率42.9%，且抗體陽性率隨著豬年齡的增長而升高。其后2002年11月至2002年8月，王忠田采用PCR的方法對(duì)北京、天津、廣東等地的12個(gè)規(guī)?；B(yǎng)豬場PCV2感染發(fā)病群的55份組織病料進(jìn)行了PCV2的檢測，發(fā)現(xiàn)12個(gè)豬場中11個(gè)發(fā)病豬群主要表現(xiàn)為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，I個(gè)為皮炎和腎病綜合征。由此可見該病在我國的一些規(guī)?；i場普遍存在。
[0005]PCV2主要損傷感染豬的免疫器官，引起機(jī)體免疫功能的下降及紊亂，其常與豬細(xì)小病毒、豬肺炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等微生物協(xié)同作用，發(fā)揮其致病性。PCV2引起的疾病主要有斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎和腎病綜合癥、繁殖與呼吸綜合征、滲出性皮炎等，在整個(gè)發(fā)病過程中PCV2常起到主要作用。
[0006]由于目前尚無針對(duì)該病的有效預(yù)防和控制措施，且該病常以亞臨床感染的形式存在，所以做好該病的診斷對(duì)該病的監(jiān)控尤為重要。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]發(fā)明目的
本發(fā)明的目的是提供一種豬圓環(huán)病毒2型的PCR檢測方法，操作簡單、技術(shù)要求低，適合于臨床檢測。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于所述豬圓環(huán)病毒2型的PCR檢測方法的引物。
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供與上述檢測方法相應(yīng)的檢測試劑盒。
[0011]發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種豬圓環(huán)病毒2型的PCR檢測方法，包括以下步驟:
(I)以樣品中提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中PCR擴(kuò)增的引物序列為:
上游 5-TGGGATGATCTACTGAGAC-3 ；
下游 5-ATTTCATATGGAAATTCAG-3 ；
(2 )對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳； (3)分析、判定結(jié)果，樣品出現(xiàn)268bp擴(kuò)增條帶，且陰性對(duì)照無相應(yīng)的擴(kuò)增條帶時(shí)，結(jié)果為陽性。
[0012]優(yōu)選的，PCR擴(kuò)增的條件及程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min; 94°C變性30s，43_56°C梯度退火30s，72°C延伸30s，共36個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸6min。進(jìn)一步優(yōu)選的，PCR擴(kuò)增的條件及程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min; 94°C變性30s，49°C退火30s，72°C延伸30s，共36個(gè)循環(huán)，最后72°C 延伸 6min。
[0013]優(yōu)選的，PCR反應(yīng)體系為:
PCR緩沖液；
MgCh 終濃度 2.5mmol/L；dNTP 終濃度(h2mmol/L;
TaqDNA聚合酶I unit;
上下游引物終濃度均為0.5ymol/l ；
模板2.Ομ? ；
加ddH20(雙蒸水)至終體積50μ1。
[0014]其中，TaqDNA聚合酶的終濃度為本領(lǐng)域常規(guī)參數(shù)，模板的終濃度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員經(jīng)試驗(yàn)確定，以能獲得有效的PCR擴(kuò)增反應(yīng)為目標(biāo)。所述有效的PCR擴(kuò)增反應(yīng)是指當(dāng)DNA模板中含有足量目標(biāo)DNA序列可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物的量足以被檢出，顯示結(jié)果為陽性。
[0015]所述陰性對(duì)照可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行選擇，優(yōu)選的，所述PCR檢測方法以豬偽狂犬病病毒作為陰性對(duì)照。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的第二方面，還提供了用于所述豬圓環(huán)病毒2型的PCR檢測方法的引物，其序列為:
上游 5-TGGGATGATCTACTGAGAC-3 ；
下游5-ATTTCATATGGAAATTCAG-3。
[0017]根據(jù)本發(fā)明的第三方面，還提供了一種用于豬圓環(huán)病毒2型的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括:
PCR緩沖液；
引物對(duì)，序列為:
上游 5-TGGGATGATCTACTGAGAC-3，
下游 5-ATTTCATATGGAAATTCAG-3 ；
MgCl2;
dNTP；
Taq DNA聚合酶；
CldH2O;
陰性對(duì)照；
DNA Ladder0
[0018]優(yōu)選的，所述陰性對(duì)照為豬偽狂犬病病毒。
[0019]本發(fā)明所述豬圓環(huán)病毒2型的PCR檢測方法操作簡單，技術(shù)要求較低，便于臨床檢測或流行病學(xué)調(diào)查，所檢測的泰州地區(qū)67份疑似PMffS的病料，其中42份表現(xiàn)為陽性，其陽性率可達(dá)62.6%。
[0020]
【附圖說明】
[0021]圖1是實(shí)施例1的PCR擴(kuò)增電泳圖，其中，M:1OObp DNA Ladder; 1、2:PCV2擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖2是敏感性試驗(yàn)的PCR擴(kuò)增電泳圖，其中，M:1OObp DNA Ladder; 1、2、3、4、5、6、7分別代表稀釋 I O—1、I O—2、I O—3、I O—4、I O—5、I O—6、I O—7倍數(shù)的 PCV2擴(kuò)增產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下邊結(jié)合實(shí)施例作具體的說明。
[0023]1.1主要試劑及儀器
基因組DNA快速抽提試劑盒、10bp DNA LadderX DNA Loading Dye、dNTP Mix均為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品；TaqDNA聚合酶為Fermentas產(chǎn)品，型號(hào)EP0404，濃度為lu/μ1;25πιΜ MgCl2及 10 X Buffer為Fermentas產(chǎn)品；PCR擴(kuò)增儀(PTC-200rev)、JS-380A自動(dòng)凝膠圖像分析儀、Mikro200R冷凍高速離心機(jī)、DYY-7C型電泳儀、DYCP-3IDN瓊脂糖水平電泳槽、恒溫箱、微量移液器等。
[0024]1.2引物的設(shè)計(jì)及合成
參照GenBank上發(fā)表的PCV2全基因序列JX682407和發(fā)明人分離鑒定的5株P(guān)CV2序列(GenBank登錄號(hào)::KC788750、KF039888、KF039889、KF039890、KF039891)，設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增PCV2片段的特異性引物，擴(kuò)增片段位于717-985bp，長度為268bp，引物的序列為:
上游 5-TGGGATGATCTACTGAGAC-3 ；
下游5-ATTTCATATGGAAATTCAG-3。
[0025]引物的合成由上海生工生物工程有限公司合成，-20°C冰箱保存?zhèn)溆?，濃度均?5ymol/L0
[0026]1.3 DNA模板的提取
采集有PMffS典型癥狀發(fā)病豬的脾臟、淋巴結(jié)和肺等病變組織，按照基因組DNA快速抽提試劑盒的說明書操作。提取的DNA模板-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0027]實(shí)施例1
以豬偽狂犬病病毒為陰性對(duì)照，以1.3提取的DNA為模板，用上述特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為:10 X Buffer和25mM的MgCl2各5μ1，2.5mmol/L dNTP 4μ1，TaqDNA聚合酶Ιμ?，上下游引物各Ιμ?，模板2.Ομ?，加(IdH2O至終體積50μ1，混勻后放入PCR擴(kuò)增儀中。反應(yīng)的程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min; 94°C變性30s，采用43_56°C范圍內(nèi)不同溫度退火30s，72°C延伸30s，共41個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸6min，發(fā)現(xiàn)退火溫度為49°C時(shí)擴(kuò)增效果最好。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖上進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察。在約268bp處見一特異性條帶，與預(yù)期的大小一致。結(jié)果如圖1(圖1中的I為退火溫度為49°C時(shí)的擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果，2為陰性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果)。
[0028]將PCR產(chǎn)物按DNA凝膠回收試劑盒的要求進(jìn)行回收，將回收產(chǎn)物送去生物公司進(jìn)行測序，測序的結(jié)果與GenBank中的PCV2序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示擴(kuò)增的條帶為PCV2序列。
[0029]
實(shí)施例2特異性測定
以1.3提取的DNA、豬瘟脾淋苗、豬偽狂犬病病毒的DNA、豬大腸桿菌的DNA為模板，用上述所設(shè)計(jì)的PCV2的特異性引物按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行擴(kuò)增，電泳、觀察結(jié)果。結(jié)果顯示，所設(shè)計(jì)的引物僅能擴(kuò)增出PCV2的DNA片段，約268bp，而其它擴(kuò)增結(jié)果均沒顯示條帶。其中豬瘟脾淋苗圩大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司商品疫苗，豬偽狂犬病病毒的DNA和豬大腸桿菌的DNA由
【申請人】按照現(xiàn)有技術(shù)分離鑒定保存。
[0030]
實(shí)施例3敏感性測定
將1.3提取的DNA作不同程度的稀釋，分別用實(shí)施例1的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后以1yL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，檢測PCR方法的敏感性。結(jié)果如圖2所示，說明DNA模板在經(jīng)過10—MO—7稀釋后，采用所述優(yōu)化的條件擴(kuò)增仍能在10—4時(shí)擴(kuò)出片段，表明其敏感性較高。
[0031]
實(shí)施例4 PCR檢測方法的驗(yàn)證試驗(yàn)
采用實(shí)施例1的方法，對(duì)發(fā)明人分離鑒定的5株P(guān)CV2(發(fā)明人最近幾年從蘇中地區(qū)(泰州市及周圍地區(qū))發(fā)病豬場分離到多株不同生物學(xué)特性的PCV2毒株，并對(duì)其進(jìn)行了 Cap基因序列測定(GenBank登錄號(hào):KC788750、KF039888、KR)39889、KF039890、KF039891)和進(jìn)化樹分析)的PKl5細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行了PCV2的檢測，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(豬偽狂犬病病毒PKl5細(xì)胞培養(yǎng)物)，計(jì)算與病毒分離鑒定方法檢測結(jié)果的符合率。結(jié)果顯示，2種方法檢測5株P(guān)CV2和陰性對(duì)照，陰性和陽性結(jié)果完全符合，符合率為100%。
[0032]
實(shí)施例5 PCR檢測方法的應(yīng)用
采用實(shí)施例1的方法，對(duì)江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院收集的泰州周邊地區(qū)發(fā)病豬的疑似病料進(jìn)行了 PCV2的檢測。
[0033]
采用實(shí)施例1的擴(kuò)增條件，對(duì)所采的67份疑似PMWS的病料行了 PCV2的檢測。結(jié)果顯示，其中42份表現(xiàn)為陽性，其陽性率可達(dá)62.6%。
[0034]
PCV2的基因組全長為1767bp或1768bP<3PCV2侵害宿主后，能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞的凋亡和抑制淋巴細(xì)胞的增殖，造成淋巴細(xì)胞的缺失及亞群的變化，使機(jī)體免疫系統(tǒng)低下，不能及時(shí)的對(duì)免疫原進(jìn)行有效的免疫應(yīng)答，易引起繼發(fā)感染。因此常與豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌等混合感染，加重其危害性。迄今為止，對(duì)于PCV2感染的控制仍然缺乏有效的措施，市場上還沒有較好的疫苗和藥物來防治該病。因此，建立快速、簡易的診斷方法，對(duì)加強(qiáng)該病的監(jiān)控及預(yù)防有著極其重要的意義。
[0035]PCR技術(shù)已在多個(gè)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，其具有較強(qiáng)的靈敏度、準(zhǔn)確度和特異性，能夠快速的進(jìn)行診斷，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測方法的費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的缺點(diǎn)。本發(fā)明根據(jù)GenBank中已發(fā)布的PCV2的序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，通過對(duì)其反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了 PCV2的PCR檢測方法，具有較好的特異性和敏感性，并對(duì)泰州及周邊地區(qū)的67份臨床病料進(jìn)行了檢測，其陽性率可達(dá)62.6%，說明PCV2對(duì)該地區(qū)存在一定危害性。該方法的建立有利于規(guī)?；i場對(duì) PCV2的監(jiān)控，為提早預(yù)防PCV2的發(fā)病提供基礎(chǔ)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種豬圓環(huán)病毒2型的PCR檢測方法，其特征在于，順序包括以下步驟: (I)以樣品中提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中PCR擴(kuò)增的引物序列為: 上游 5-TGGGATGATCTACTGAGAC-3 ； 下游 5-ATTTCATATGGAAATTCAG-3 ； (2 )對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳； (3)分析、判定結(jié)果，樣品出現(xiàn)268bp擴(kuò)增條帶，且陰性對(duì)照無相應(yīng)的擴(kuò)增條帶時(shí)，結(jié)果為陽性。2.如權(quán)利要求1所述的PCR檢測方法，其特征在于，所述PCR檢測方法以豬偽狂犬病病毒作為陰性對(duì)照。3.如權(quán)利要求1所述的PCR檢測方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增的條件及程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min; 94°C變性30s，43-56°C梯度退火30s，72°C延伸30s，共36個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸6min04.如權(quán)利要求3所述的PCR檢測方法，其特征在于，PCR擴(kuò)增的條件及程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min; 94°C變性30s，49°C退火30s，72°C延伸30s，共36個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸6min。5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的PCR檢測方法，其特征在于，PCR反應(yīng)體系為: PCR緩沖液； MgCh 終濃度 2.5mmol/L； dNTP終濃度0.2臟01/1; TaqDNA聚合酶I unit; 上下游引物終濃度均為0.5ymol/l ； 模板2.0μ1; 加ddH20至終體積50 μ?ο6.一種用于豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測方法的引物，其序列為: 上游 5-TGGGATGATCTACTGAGAC-3 ； 下游5-ATTTCATATGGAAATTCAG-3。7.—種用于豬圓環(huán)病毒2型的PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: PCR緩沖液； 引物對(duì)，序列為: 上游 5-TGGGATGATCTACTGAGAC-3， 下游 5-ATTTCATATGGAAATTCAG-3 ； MgCl2; dNTP； Taq DNA聚合酶；CldH2O; 陰性對(duì)照； DNA Ladder08.如權(quán)利要求7所述的PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述陰性對(duì)照為豬偽狂犬病病毒。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK106086238SQ201610524436
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年7月1日
【發(fā)明人】曹軍平, 董亞青, 郭廣富, 朱愛萍
【申請人】江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院