一種無創(chuàng)式檢測懷孕中胎兒是否健康的系統(tǒng)及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從懷孕母體的外源性生物體鑒定胎兒健康狀態(tài)的生物標志物的方法，及其用于無創(chuàng)性確定胎兒健康狀態(tài)的用途。此外本發(fā)明還公開了用于所述方法的系統(tǒng)和試劑盒。其中所述的健康狀態(tài)為染色體異常，所述的染色體異常為21三體。
【專利說明】
一種無創(chuàng)式檢測懷孕中胎兒是否健康的系統(tǒng)及其應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及用于確定孕期胎兒是否健康的無創(chuàng)式方法。具體地，本發(fā)明涉及通過 在來自懷孕女性的生物樣本中評估與外源性生物體相關的生物標志物而用于檢測胎兒健 康狀態(tài)的方法。
【背景技術】
[0002] 目前介入式的產前診斷常見的有絨毛膜絨毛取樣和羊膜穿刺術，對胎兒和母親均 具有潛在風險。而無創(chuàng)式的則有用孕婦血清標志物和超聲波對胎兒產前篩查，但其靈敏性 和特異性廣受質疑。
[0003] 無創(chuàng)產前檢測(Noninvasive prenatal testing，NIPT)是指有別于傳統(tǒng)的絨毛取 樣、羊水穿刺和胎兒臍靜脈穿刺等侵入性產前檢測手段，通過對母體血漿中存在的胎兒遺 傳物質進行檢測，而直接對胎兒的健康情況作以檢測鑒定的方法。目前NIPT通常以孕婦外 周血為檢測樣本，擴增其中的胎兒游離DNA(CffDNA)后，采用高通量測序技術對其進行測序 和計數，并結合數學模型進行數據分析，從而判斷胎兒的染色體是否異常，其是目前下一代 基因測序(NGS)中市場化程度最高的臨床應用，中國NIPT的目標市場有望超過100億元。
[0004] 單純皰疹是一種常見的病毒性全身疾病，主要感染起源于外胚層的皮膚、黏膜、目艮 和神經系統(tǒng)。由于妊娠期處于免疫抑制狀態(tài)，易于受到單純皰疹病毒（herpes simplex Virus，HSV)感染，通過宮內或產道傳播影響胚胎發(fā)育，引發(fā)流產、早產、死胎、先天畸形、胎 兒生長受限(FGR)、新生兒感染和智力低下等不良妊娠結局。目前HSV感染率有增高趨勢。因 此，防治HSV感染，對減少不良妊娠結局和降低遠期致殘率，以及保護母嬰健康具有重要意 義。
[0005] 病原體HSV屬于皰疹病毒科的α亞科，為溶細胞性感染病毒。病毒顆粒呈球形，直徑 120~150nm，由核心、衣殼、被膜及包膜組成。核心含160kb、分子質量約為108ku的雙股DNA， 衣殼呈20面體對稱，外覆一層厚薄不勻的被膜，最外層為典型的脂質雙層包膜，上有突起。 HSV基因組DNA分子由共價連接的長片段(L)和短片段（S)組成，有72個基因，共編碼70多種 蛋白質。已經正式命名的病毒包膜糖蛋白有12種，如gB、gC、gD、gE、gG、gH、gK、gL、gM、gJ等。 它們是病毒殼粒表面的抗原決定簇，與識別宿主細胞膜受體、吸附和穿入細胞以及誘導宿 主的免疫反應等密切相關。根據生物學特性和抗原不同，HSV可分成HSV-I和HSV-Π 兩種血 清型，兩型約有50%的核苷酸序列相同，故兩型間存在著共同抗原和特異性抗原。HSV能在 二倍體細胞核內復制，產生明顯的細胞病變效應(cytopathiceffect，CPE)，核內出現嗜酸 性包涵體。病毒可通過細胞間橋直接擴散。感染細胞可與鄰近未感染的細胞融合形成多核 巨細胞。HSV-I主要通過直接、間接接觸或飛沫傳播，感染口腔、皮膚、黏膜、眼黏膜及中樞神 經系統(tǒng)，偶見于外生殖器。HSV-Π 通常為性傳播，引起生殖系統(tǒng)感染，偶見于口腔病變，也可 經胎盤宮內傳播或經產道傳播給新生兒。約90 %以上的人群曾感染過HSV，其中很大一部分 導致潛伏感染，病毒在體內可維持數年甚至終生。HSV- Π 感染較為普遍，目前發(fā)生率有逐年 增高趨勢。其發(fā)病率與年齡、社會經濟條件、多性伴等關系密切。有流行病學調查顯示:妊娠 期HSV感染率約為0.85 %~2.6 %。
[0006] Cheon等（Evidence for the relation of herpes simplex virus type Ito Down syndrome and Alzheimer's disease[J].Electrophoresis,200I,22(3):445-448.) 通過對唐氏綜合征患兒腦組織神經炎性細胞因子IL-6的研究，認為妊娠期HSV感染也可能 是引發(fā)唐氏綜合征的病因之一。
[0007] 目前，醫(yī)院里常用的用于檢測HSV的方法主要是通過利用基于酶聯(lián)免疫吸附 (ELISA)的方法檢測懷孕女性的外周血中針對所述病原體的抗體而進行評估的，從而間接 反映所述懷孕女性的感染狀態(tài)。這些方法對檢測胎兒感染一般是無效的。所述方法的一些 局限性為：1)只有少數已知的病原體可以被檢測到；2)每一個病原體需要相應的抗體檢測 試劑;3)所需要的血液量隨著所需檢測的病原體的數量而增加;4)這些方法非常耗時；以及 5)這些方法不利于批量測試。
[0008] 盡管最靈敏的直接檢測病原體存在的方法時病原體培養(yǎng)，但其非常耗時并具有較 高的失敗率。因此，還沒有看到病原體培養(yǎng)的大規(guī)模臨床應用。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明提供了無創(chuàng)式的孕期胎兒健康狀態(tài)的檢測方法，所述的方法為利用在來自 懷孕女性的生物樣本中，通過評估DNA分子來診斷所述的胎兒是否受到HSV的感染。
[0010] 本發(fā)明的一個方面提供一種檢測胎兒是否是健康狀態(tài)的檢測系統(tǒng)，所述的系統(tǒng)包 括a)核酸提取系統(tǒng);b)核酸檢測系統(tǒng);c)結果分析系統(tǒng)。其中所述的核酸檢測系統(tǒng)優(yōu)選為高 通量測序系統(tǒng)。
[0011] 另一個方面，本發(fā)明提將所述的系統(tǒng)制備用于確定胎兒染色體非整倍性的方法， 所述的方法為非診斷性的，所述方法包含:a)在來自懷孕女性的生物樣本中，評估來自外源 性生物體的多核苷酸;b)分析所述外源性多核苷酸與現有技術公開的序列對比及其同源性 情況;c)確定所述胎兒染色體是否具有非整倍性，其中所述的非整倍性為HSV感染導致。
[0012] 在一個實施方案中，所述胎兒是人類胎兒。在另一個實施方案中，所述分析是采用 至少1個正常對照進行的。在另一個實施方案中，所述生物樣本為選自由以下所組成的組： 血清、血液、積液、尿液、骨髓、腹水、盆腔沖洗液、胸腔積液、脊髓液、淋巴液、粘液、痰、唾液、 眼房水、鼻腔提取物、咽喉拭子、生殖道拭子、來自消化組織的細胞懸浮液、和糞便提取物。
[0013] 在一個實施方案中，所述胎兒非健康狀體為染色體的非整倍性。優(yōu)選的，所述的非 整倍性為選自由21三體性和21三體性所組成的組的常染色體異常
[0014] 在第三方面，本發(fā)明提供了一種用于鑒定胎兒的健康狀態(tài)的生物標志物的方法， 所述方法包含:a)在來自至少一個懷孕女性的生物樣本中，評估來自外源性生物體的多核 苷酸的同一性和/或水平;b)對所述外源性多核苷酸的所述的同一性和/或水平進行統(tǒng)計學 分析；以及c)如果統(tǒng)計學顯著相關性建立，則鑒定所述非人類的多核苷酸作為針對所述健 康狀態(tài)的生物標志物，其中，所述胎兒的所述健康狀態(tài)為無 HSV感染。
[0015] 在一些實施方案中，所述胎兒是人類胎兒。在一些實施方案中，所述統(tǒng)計分析是采 用至少1個正常對照進行的。在另一個實施方案中，所述生物樣本為選自由以下所組成的 組:血清、血液、積液、尿液、骨髓、腹水、盆腔沖洗液、胸腔積液、脊髓液、淋巴液、粘液、痰、唾 液、眼房水、鼻腔提取物、咽喉拭子、生殖道拭子、來自消化組織的細胞懸浮液、和糞便提取 物。在另一個實施方案中，所述外源性生物體為選自由以下所組成的組:病毒、細菌、真菌和 寄生蟲。在另一個實施方案中，述健康狀態(tài)為選自由以下所組成的組:基因異常、和發(fā)育異 常。
[0016]在第四方面，本發(fā)明提供了一組用于確定人類胎兒的21三體性的生物標志物，其 為HSV的核酸片段。
[0017]在第五方面，本發(fā)明提供了一種用于確定胎兒的健康狀態(tài)的方法，所述方法包含： a)在來自懷孕女性的生物樣本中，通過測序多核苷酸來評估來自外源性生物體的至少一個 生物標志物的同一性和/或水平;b)分析所述至少一個生物標志物的所述同一性和/或水 平；以及c)確定所述胎兒的所述健康狀態(tài)。在一些實施方案中，所述方法采用高通量測序。
[0018] 在一些實施方案中，所述胎兒為人類胎兒。在一些實施方案中，所述生物樣本為選 自由以下所組成的組:血清、血液、積液、尿液、骨髓、腹水、盆腔沖洗液、胸腔積液、脊髓液、 淋巴液、粘液、痰、唾液、眼房水、鼻腔提取物、咽喉拭子、生殖道拭子、來自消化組織的細胞 懸浮液、和糞便提取物。在一些實施方案中，步驟a)包含對來自所述生物樣本的無細胞DNA 進行純化。在一些實施方案中，對所述DNA進行擴增。在一些實施方案中，對所述DNA建立文 庫。在一些實施方案中，步驟b)包含將從步驟a)獲得的所述序列與所述生物標志物進行比 較。在一些實施方案中，在步驟b)之前，從步驟a)獲得的所述序列中去除與人類基因組序列 相匹配的序列。在一些實施方案中，所述外源性生物體為選自由以下所組成的組:HBV、HCV、 HI V、HSV、和梅毒。
[0019] 在第六方面，本發(fā)明提供了一種用于確定胎兒的健康狀態(tài)的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含： a)用于在來自懷孕女性的生物樣本中評估至少一個來自外源性生物體的多核苷酸的同一 性和/或水平的手段；以及b)用于分析所述外源性多核苷酸的同一性和/或水平的手段。在 一些實施方案中，所述胎兒的所述健康狀態(tài)為無 HBV感染。在一些實施方案中，所述小分子 可以與宿主代謝相關。在一些實施方案中，用于評估至少一種多核苷酸同一性和/或水平的 手段可以為測序裝置。在一些實施方案中，用于分析所述外源性多核苷酸同一性和/或水平 的手段可以為計算機。
[0020] 在第七方面，本發(fā)明提供了一種用于確定胎兒的健康狀態(tài)的試劑盒包含:a)本發(fā) 明所提供的生物標志物；以及b)如何使用所述生物標志物的說明書。
【附圖說明】
[0021] 圖1顯示了用于鑒定針對胎兒健康狀態(tài)的生物標志物的示例性過程。
【具體實施方式】
[0022] 為了便于理解，所述【具體實施方式】是為了有助于解釋技術方案而提供的，也就是 說，這些實施例只用于說明目的，而不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。除非特別說明，實施 方式并不表明具體條件，按照常規(guī)條件或生產商推薦的條件。
[0023] 實施例1確定作為針對唐氏綜合征的生物標志物的病毒
[0024]本實施例闡明了通過從懷孕女性獲取外周血（5mL)、提取游離DNA、利用新的高通 量技術測序，以及生物信息分析來無創(chuàng)性基因分析胎兒染色體非整倍性風險。外源性序列 與所述宿主生物體的序列相關。本結果表明外源性序列是與所述宿主生物體的健康狀態(tài)相 關的。
[0025] 在所述懷孕女性知情的情況下，研究人員獲取外周血樣本（12-24孕周）并利用條 形碼進行標記以便于信息分類和樣本管理。從所述外周血分離血清，并從所述血清中提取 游離DNA。構建DNA文庫然后進行高通量測序。測序結果與人類基因組序列進行比較。那些沒 有被比對到人類基因組序列的被分類為非人類序列。將非人類序列與已知的病毒序列進行 比較以獲得唯一比對序列。圖1顯示了本實施例中實驗步驟的流程圖。
[0026] 1)樣本收集
[0027]樣本來自懷有正常胎兒和21三體性胎兒的懷孕女性。在婦產科醫(yī)生的指導下，各 取5毫升母源外周血并收集于含有EDTA的管中。實驗者針對每個樣本進行標記，并按照分類 管理樣本。
[0028] 2)樣本分離
[0029]將血液樣本在4攝氏度下以1600g離心10分鐘，將上清液收集到新的管中。然后，將 經過處理的血液在攝氏度下以1600g進行10分鐘的第二次離心，并將上清液再次收集到管 中。最后的上清液儲藏在-80攝氏度指導直到進一步處理。
[0030] 3)提取 DNA
[0031]該步驟利用本領域常用的磁珠法DNA提取試劑盒進行。在確保所述DNA提取的結果 的前提下，磁珠法的DNA提取試劑盒(DP327)成本低并且易于自動化（彡80個樣本），。
[0032] 4)測序
[0033]根據生產商的DNA文庫構建標準操作程序（參見標準文庫構建指南http:// www. illumina. com/)，利用提取的DNA構建DNA文庫，然后在Illumina HiSeq2000TM上測序。 [0034] a)DNA文庫構建:將DNA打斷為一定大小的片段，進行末端修復，在所述DNA片段的 3'末端添加堿基A，對所述DNA連接接頭然后進行多聚酶鏈反應。終產物為兩端均已連接有 接頭的所述DNA測序片段。
[0035] b)測序芯片制備和測序:經處理的單鏈DNA片段所述芯片表面的引物通過互補堿 基在芯片(流動槽)上進行錨定。將無標記多核苷酸和酶加入到所述反應系統(tǒng)中以便進行橋 式PCR反應。利用固定在流動細胞表面的接頭作為一種模板，形成dsDNA (雙鏈DNA)橋，所述 dsDNA橋是由ssDNA(單鏈DNA)橋擴增而來。經過30個循環(huán)的擴增，每個單分子被擴增接近 1000倍以成為單克隆DNA簇，并進行線性化處理。
[0036] c)邊測序邊合成：向所述反應系統(tǒng)中加入DNA聚合酶d，所述接頭引物和標記有熒 光染料的四種三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)。由于四種dNTPs的所有3'末端羥基均使用化學 方式進行了保護，在每個循環(huán)過程中只加入單個dNTP。所述dNTP被加入到合成鏈中后，對所 有未使用的游離dNTP和DNA聚合酶進行洗脫。加入緩沖溶液以便于熒光激發(fā)，使用激光刺激 熒光信號，以優(yōu)選的設備進行記錄。最后，利用計算機分析產生所述測序結果。加入化學試 劑對熒光信號進行淬滅，并去除所述dNTP 3'-羥基保護基團以恢復其粘性，然后加入第二 核苷酸。重復所屬過程直到每個模板序列完全聚合為雙鏈。對每個循環(huán)收集的熒光信號結 果的分析顯示了每個模板DNA片段的序列。
[0037] 5)序列比對和統(tǒng)計分析
[0038] 利用Illumina HiSeq 2000TM對樣本進行測序并產生單末端、35bp或49bp的讀段， 其中每個個體具有少于IOX的測序深度。從NCBI數據庫(http://www.ncbi .nlm.nih.gov/) 下載所述人類參考基因組(Human Genome Build 37) ALAST與人類基因組的序列比，產生 非匹配序列，即指非人類序列。從所述NCBI數據庫下載病毒基因組，利用BLAST將所述非人 類序列比對到病毒基因組并產生唯一比對讀段。針對所述數據庫中的各個病毒計算并比較 所述唐氏綜合征樣本和正常對照樣本的讀段數，然后進行統(tǒng)計分析。針對HSV，N表示總樣本 數。Nl表示唐氏綜合征樣本數，Na表示序列讀段被唯一比對HSV基因組的唐氏綜合征樣本 數。相似地，Nf表示正常對照樣本數，Nd表示序列讀段可以被唯一比對到HSV基因組的正常 對照樣本數。
[0039] 表1統(tǒng)計表如下
[0042] 使用Fisher精確檢驗比較唐氏綜合征樣本和正常對照樣本之間的區(qū)別。檢驗公式 如下：
[0043:
[0044]如果p值小于等于0.01，該病毒被定義為名義上顯著，并且可以對胎兒健康有一些 影響。
[0045] 6)統(tǒng)計結果
[0046] 利用Fisher精確檢驗分析90例唐氏綜合征樣本和150例正常對照樣本以找到4個 具有顯著性的病毒，并利用所述相同的方法在153例唐氏綜合征樣本和551例正常對照樣本 中進行驗證。最終鑒定出2個顯示與唐氏綜合征胎兒顯著相關的候選病毒(表2)。 Γ 00471 串唐Ι?·?自會紅扁·荽相革的癥羞 [0049] 實施例2實施例中樣本的結果
[0050]選擇10例臨床HSV抗原陽性懷孕女性案例，其中5例確認為胎兒HSV抗原陽性和另 外5例為陰性。另外還選取了 5例HSV抗原陰性懷孕女性和胎兒作為陰性案例。從懷孕女性中 收集大約5毫升的外周血液，然后進行低速離心或靜態(tài)自然沉降上清液，并將上清液吸入新 的管子。依據HiSeq2000TM測序構建文庫的要求，利用TAKARA病毒基因組DNA/RNA提取試劑 盒提取母源血清游離DNA。所獲得的DNA片段的末端修復是利用T4DNA聚合酶、KlenowTM聚合 酶和T4多核苷酸酶進行的。添加末端A-殘基后，將市售可得的接頭（Illumina)連接到所述 DNA片段上。然后所述接頭連接DNA以標準多重引物進行14個循環(huán)PCR的再次擴增。使用 Agencourt AMPureTMXP磁珠對PCR產物進行純化。
[0051 ]對樣本進行純化，然后溶于25微升的EB緩沖液中。
[0052] 確定所創(chuàng)建的文庫是否測序儀器對于對片段分布的要求。然后通過Q-PCR方法進 行定量。用定制芯片與所述文庫雜交，并用Illumina HiSeq2000TM對雜交產物進行測序。裝 置參數的設定和操作方法依據Illumina操作手冊（可以從http : //www. illumina. com/ support/documentation. ilmn獲得）。
[0053] 測序數據結果如表3所示
[0054] 表3測序數據結果
[0056] 將所述讀段比對到HSV參考序列(NC_001806)。依據所述陽性樣本和陰性樣本獨特 讀段統(tǒng)計結果設置臨界值。所述臨界值用于確定哪個樣本具有HSV感染。本實施例中的方法 可以感染HSV的懷孕女性中檢測其胎兒是否具有HSV感染。其結果示于表4中。
[0057] 表4HBV感染的結果
[0060] "++"指所述母親和所述胎兒都被感染；"+」'指所述母親被感染而所述胎兒未被感 染；"一"指所述母親和所述胎兒都未被感染。
[0061 ]在我們檢測的15個樣本中，只有一例樣本與臨床數據不一致，由此證明了本申請 的方法的強大性能。
[0062]除非另外明確規(guī)定，在本文中使用的術語和短語及其變形應被解釋為開放的，與 限制相反。作為前述內容的例子:術語"包括"應被理解為意指"包括而不限于"等;術語"例 子"用于提供在討論中的項目的示例性實例，而不是其排他或限制性的列表；以及形容詞例 如"常規(guī)的"、"傳統(tǒng)的"、"正常的"、"標準的"、"已知的"和類似意義的術語不應被解釋為將 所描述的項目限制到給定的時間段，或限制到在給定時間可用的項目。但替代地，這些術語 應被理解為包括可以是現在或未來的任何時間可用的、已知的常規(guī)、傳統(tǒng)、正?；驑藴始?術。同樣，用連詞"和"連接的一組項目不應被理解為要求那些項目中的每一個都存在于該 組中，而更確切地應被理解為"和/或"，除非另外明確地規(guī)定。類似的，用連詞"或"連接的一 組術語不應被理解為要求在該組中相互排斥，而更確切地應被理解為"和/或"，除非另外明 確地規(guī)定。此外，雖然本發(fā)明的項目、元件或部件可以以單數形式進行描述或主張權利，復 數形式被設想為在其范圍內，除非明確地規(guī)定限于單數。例如，"至少一個"可以指單個或復 數個，而并不限于其中之一。擴展詞和短語例如"一個或多個"、"至少"、"但不限于"或其他 類似短語的存在不應被理解為意味著在這樣的擴展短語可能不存在的實例中較窄的情況 是預期的或所需的。
[0063]盡管已經參照附圖對本發(fā)明的實施例進行了詳細描述，可以理解的是各種變化和 需改對本領域的普通技術人是顯而易見的。這種變化和修改被理解為被包含在本發(fā)明的范 圍內。應理解的是，本發(fā)明的各個實施例只是通過舉例的方式被提出，而不是用以限制本發(fā) 明。同樣的，各個附圖可以描述本發(fā)明的示例性結構或其他配置，其被完成來幫助理解可包 括在本發(fā)明中的特征和功能。本發(fā)明不限于所示的示例性結構或配置，但可使用各種可選 的結構和配置來實現。此外，雖然上面按照各種示例性實施方式和實現描述了本發(fā)明，應理 解，在一個或多個單獨的實施方式中描述的各個特征和功能，其應用不限于他們被描述的 特定實施方式。相反，它們可單獨地或以某種組合應用于本發(fā)明的其他實施方式中的一個 或多個，而不管這樣的實施方式是否被描述以及這樣的特征是否被呈現為所描述的實施方 式的一部分。因此，本發(fā)明的廣度和范圍不應由上面描述的示例性實施方式中的任一個限 制。
【主權項】
1. 一組用于確定人類胎兒的21三體性的生物標志物，其為人單純皰疹病毒HSV。2. -種用于確定胎兒的健康狀態(tài)的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含： a) 用于在來自懷孕女性的生物樣本中評估至少一個來自外源性生物體的多核苷酸同 一性和/或水平的手段；以及 b) 用于分析所述外源性多核苷酸同一性和/或水平的手段， 其中所述胎兒的所述健康狀態(tài)為無 HSV感染。3. -種用于確定胎兒的健康狀態(tài)的試劑盒包含： a) 利用根據權利要求1所述的方法所識別的生物標志物；以及 b) 如何使用所述生物標志物的說明書。4. 權利要求1所述的標志物在制備檢測試劑盒中的應用，所述的應用為： a) 在來自懷孕女性的生物樣本中，評估至少一個來自外源性生物體的多核苷酸同一性 和/或水平； b) 分析所述外源性多核苷酸同一性和/或水平；以及 c) 確定所述胎兒的所述健康狀態(tài)， 其中所述胎兒的所述健康狀態(tài)為無 HSV感染。5. 根據權利要求4所述的應用，其中所述胎兒的所述健康狀態(tài)為無所述外源性生物體 感染。6. 根據權利要求4或5所述的應用，其中所述胎兒是人類胎兒。7. 根據權利要求4或5所述的應用，其中所述分析是采用至少1個正常對照進行的。8. 根據權利要求4或5所述的應用，其中所述生物樣本為選自由以下所組成的組:血清、 血液、積液、尿液、骨髓、腹水、盆腔沖洗液、胸腔積液、脊髓液、淋巴液、粘液、痰、唾液、眼房 水、鼻腔提取物、咽喉拭子、生殖道拭子、來自消化組織的細胞懸浮液、和糞便提取物。9. 根據權利要求4或5所述的應用，其中所述健康狀態(tài)為染色體異常，所述的染色體異 常為21三體。
【文檔編號】C12Q1/68GK106086243SQ201610628856
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年8月1日 公開號201610628856.2, CN 106086243 A, CN 106086243A, CN 201610628856, CN-A-106086243, CN106086243 A, CN106086243A, CN201610628856, CN201610628856.2
【發(fā)明人】王燕蕓, 張洪坤
【申請人】王燕蕓