專利名稱：?；酋０被〈亩啻渭谆玖献鳛闊晒馊玖虾?或標記物的用途的制作方法
近年來，開發(fā)出了越來越靈敏和易于操作的檢測方法，這些方法尤其是用于僅有少量物質(zhì)供分析的生物技術(shù)中。在此，例如熒光檢測方法的用途廣泛增加。熒光染料被用作標記物來標記生物物質(zhì)如蛋白質(zhì)、DNA、RNA、碳水化合物、脂肪或整個細胞。但是，由于許多被標記物質(zhì)本身在400-500nm具有熒光性質(zhì)，因此所用標記染料應(yīng)該在超過500nm、通常在500至1200nm的波長處吸收。此外，在該波長區(qū)域中，可以提供廉價的激光二極管作為光源。
現(xiàn)有技術(shù)已知的熒光染料經(jīng)常是被親水或酸性基團取代，以確保在水中、在中性或略呈堿性pH條件下的溶解度。這使得主要在含水基質(zhì)中操作的生物材料標記更容易。此外，染料應(yīng)該是光穩(wěn)定的，以使其甚至可用于包括較長輻射的測量方法。但是，許多染料在較長波長處的吸收不具有足夠的光穩(wěn)定性。
染料與生物樣品共價結(jié)合或通過吸收結(jié)合在生物樣品上。例如，蛋白質(zhì)的巰基和游離氨基是使染料分子共價偶合的活性基團。此外，親水或親脂染料可以通過吸收與蛋白質(zhì)的親水或疏水區(qū)域結(jié)合。離子型染料還可以通過離子的相互反應(yīng)吸收到蛋白質(zhì)上。
迄今花青染料(Waggoner等，Bioconjugate Chemistry，4，105-111(1993)，US 5,268,486，WO 97/13810)已經(jīng)頻繁地用于趨于形成聚集體的生物分析。除了單體之外，根據(jù)染料的化學(xué)環(huán)境(例如pH)，可以形成H-聚集體和J-聚集體。這被開發(fā)用于照相術(shù)，因為與單體的吸收相比，聚集體的吸收向藍移或者紅移。然而對于生物標記，這種聚集效應(yīng)是不希望的，因為如此也會產(chǎn)生一個或多個額外的吸收帶。
如果用不同染料標記的樣品在不同的波長被激發(fā)，則經(jīng)常需要進行多重分析。為了獲得令人滿意的激發(fā)與發(fā)射信號分離，染料共軛物的吸收一定不能重疊。如此，染料的峰形、可復(fù)寫性和不依賴于pH和溶解的吸收是重要的。頻繁使用的花青染料形成聚集體的趨勢還因淬火降低了熒光的強度。發(fā)射射線或者被直接吸收，或者無輻射能量損失。
現(xiàn)有技術(shù)已知的用于生物標記的染料，即花青染料，屬于多次甲基染料。此外，WO 97/40104公開了例如方形酸衍生物作為生物標記染料。
本發(fā)明的目的是提供作為熒光標記物的、或與現(xiàn)有技術(shù)已知花青染料相比具有改進性質(zhì)的染色用新的熒光染料。尤其是，在生物緩沖系統(tǒng)中的溶解度和光穩(wěn)定性得到改善，并且尤其減少了形成聚集體的趨勢。然而，與此同時，本發(fā)明化合物還具有高量子產(chǎn)率和較高的消光系數(shù)。
本發(fā)明提供了多次甲基染料，其含有至少一個式(I)?；酋０被鶊F 其中n表示1、2、3、4、5、6、7、8或9，Y、A表示吸電子基團，優(yōu)選C＝O或-SO2-，并且R表示任選被取代的烷基或芳基，并且包含至少一種下式化合物(a) (b)-(CH2)nNCS， -(CH2)nNCO， 或 本發(fā)明還提供了含有至少一個式(I)?；酋０被亩啻渭谆玖显谌旧?或生物分子標記中的用途。
本發(fā)明的多次甲基染料不僅僅用于染色，也通過形成共價鍵用于生物標記，除了式(I)基團之外，本發(fā)明的多次甲基染料還具有至少一個能形成該共價鍵的基團；按照本發(fā)明，該基團優(yōu)選為(a)(b)-(CH2)nNCS，-(CH2)nNCO， 或
因此，本發(fā)明還提供了含有至少一個式(I)?；酋０被椭辽僖粋€能形成共價鍵的選自下列化合物的基團的多次甲基染料通過共價結(jié)合標記生物分子的用途(a)(b)-(CH2)nNCS，-(CH2)nNCO， 或 對于本發(fā)明的應(yīng)用目的，生物分子應(yīng)該理解為是指蛋白質(zhì)以及DNA和/或RNA。此外，對于本發(fā)明的應(yīng)用目的，細胞也可以考慮作為生物分子。還包括具有生物作用的小的有機分子。
除了式(I)化合物之外、還具有選自式(a)至(n)之一基團的多次甲基染料迄今是現(xiàn)有技術(shù)中未知的，因此是新化合物。由于能夠形成共價鍵，它們尤其適用于生物標記。
對于本發(fā)明的應(yīng)用目的，除非另外指明，吸電子基團優(yōu)選應(yīng)該理解為是指如在March，Advanced Organic Chemistry，3rd Ed.，S.17和S.238中所述的基團。
對于本發(fā)明的應(yīng)用目的，除非另外指明，烷基應(yīng)該理解為是指直鏈或支鏈、環(huán)狀或鏈狀、取代或未取代的烴。烷基尤其是具有1-12個碳原子的烷基，例如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、新戊基和2-乙基己基。當然，這些基團可以進一步被取代，特別優(yōu)選的是被羧基羰基取代。
對于本發(fā)明的應(yīng)用目的，除非另外指明，芳基應(yīng)該理解為是指芳族烴基，優(yōu)選5-或6-元環(huán)系，可以是單環(huán)或稠環(huán)系。它們可以是取代或未取代的環(huán)系。尤其優(yōu)選的是例如苯基和萘基。
當本發(fā)明染料用于生物系統(tǒng)例如蛋白質(zhì)共軛物或生物緩沖介質(zhì)中時，出人意料地發(fā)現(xiàn)，與US 5,268,486、WO 96/00902、WO 97/13810和WO 97/40104中所述的具有烷基磺酸基或烷基羧酸基的花青或方形酸染料相比，本發(fā)明多次甲基染料的聚集趨勢能夠減少。
本發(fā)明所用染料的另一優(yōu)點是多次甲基染料的發(fā)色性質(zhì)不因取代基而改變。迄今為止，例如，通過向作為發(fā)色團一部分的芳基系統(tǒng)中引入磺基，已經(jīng)實現(xiàn)了改善花青染料溶解度的官能化。由于取代基具有吸電子作用，還產(chǎn)生了光譜性質(zhì)的遷移。未取代?；ㄇ嗳玖系墓庾V性質(zhì)已有描述，并且因此可以例如通過引入?；撬峄蛊渲苯佑糜谏锓治?。因此可以使花費的時間最佳化并用于篩選實驗。
再者，與烷基羧酸基相比，具有?；酋０被娜玖暇哂懈呦庀禂?shù)。這就使得當染料用作標記物時具有進一步的優(yōu)點。
如果該染料作為標記物與例如蛋白質(zhì)或抗體共價結(jié)合，則共軛物的特征在于染料/蛋白質(zhì)含量的摩爾比。為了得到令人滿意的信號，必須有一定量的染料與蛋白質(zhì)結(jié)合。染料的消光系數(shù)越高并且因此其強度越高，染料作為熒光標記物的靈敏度就越高，因為在吸收＜0.05時熒光強度是消光系數(shù)的函數(shù)。
F＝φKloεcdφ＝量子產(chǎn)率Io＝照射樣品的光強度ε＝消光系數(shù)c＝樣品濃度d＝路徑長度但是，由于在其空間緊密時染料淬火，因此染料/蛋白質(zhì)的比例不應(yīng)太高。這就導(dǎo)致熒光強度損失。因此，具有高消光系數(shù)的染料尤其適于用作熒光標記物。甚至少量的染料即可以以低染料/蛋白質(zhì)含量摩爾比提供強熒光信號。而且，使淬火過程最小化。
適合本發(fā)明使用的多次甲基染料尤其是在下文的優(yōu)選實施方案中更詳細描述的花青染料、部花青、rhodacyanines、苯乙烯染料、方形酸染料和巴豆酸染料，它們的特征在于對于本發(fā)明的應(yīng)用，它們具有至少一個式(I)的取代基。在另一具體實施方案中，式(1)至(5)的多次甲基染料還可以彼此相連，這就使得兩種或多種相同或不同的染料可以彼此相連。優(yōu)選的本發(fā)明多次甲基染料是下式所示的那些，除了式(I)的取代基之外，它們還含有至少一個選自下列化合物基團的取代基(a)(b)-(CH2)nNCS，-(CH2)nNCO， 或 1.花青染料根據(jù)本發(fā)明，合適的花青染料尤其是式1a、1b和/或1c所示的那些 式1-a其中Ra10至Ra110彼此獨立地可以表示任何取代基，n表示0、1、2、3或4，Ya11、Ya12和Ya13彼此獨立地可以表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳環(huán)或雜環(huán)，并且Aa11和Ba11彼此獨立地表示O、S、Se、Te、N-Ra111、C(Ra112)(Ra113)或-C(Ra114)＝C(Ra115)-，其中Ra11至Ra115彼此獨立地可以表示H、具有最多20個碳原子的任選被取代的烷基、任選被取代的芳基或任選被取代的鏈烯基，條件是，取代基Ra10至Ra115中的至少一個選自下列基團-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l(wèi)表示1-6之間的數(shù)，Z表示NH或N-，并且R優(yōu)選表示任選被取代的烷基或芳基。
特別優(yōu)選的用于本發(fā)明的式1a化合物如下所列。優(yōu)選的式1a化合物 式1-b其中Rb10至Rb110彼此獨立地可以表示任何取代基，m表示0、1、2、3或4，并且Yb11、Yb12和Yb13彼此獨立地可以表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳環(huán)或雜環(huán)，條件是，取代基Rb11至Rb110中的至少一個選自下列基團-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l(wèi)表示1-6之間的數(shù)，Z表示NH或N-，并且R優(yōu)選表示任選被取代的烷基或芳基。
在一個優(yōu)選的具體實施方案中，下列取代基形成也可任選稠合的5-或6元碳環(huán)或雜環(huán)取代基Rb11與Rb12和/或Rb14，取代基Rb12與Rb13和/或Rb11，取代基Rb14與Rb15和/或Rb11，取代基Rb18與Rb19和/或Rb17，取代基Rb17與Rb16和/或Rb18，取代基Rb19與Rb110和/或Rb18。特別優(yōu)選的式1b化合物 式1-c其中Rc11至Rc110彼此獨立地可以表示任何取代基，m表示0、1、2、3或4，Yc11，Yc12和Yc13彼此獨立地可以表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳環(huán)或雜環(huán)，并且Bc11表示O、S、Se、Te、N-Rc111、C(Rc112)(Rc113)或-C(Rc114)＝C(Rc115)-，其中Rc11至Rc115彼此獨立地表示H、具有最多20個碳原子的任選被取代的烷基、任選被取代的芳基或任選被取代的鏈烯基，條件是，取代基Rc10至Rc115中的至少一個選自下列基團-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l(wèi)表示1-6之間的數(shù)，Z表示NH或N-，并且R優(yōu)選表示任選被取代的烷基或芳基。
在一個優(yōu)選的具體實施方案中，下列取代基形成也可任選稠合的5-或6元碳環(huán)或雜環(huán)取代基Rc11與Rc12和/或Rc14，取代基Rc12與Rc13和/或Rc11，取代基Rc14與Rc15和/或Rc11。
取代基Rc17至Rc110可以優(yōu)選形成可以含有最多4個環(huán)、并且可任選帶有多個取代基的碳環(huán)或雜環(huán)系的剩余原子。Rc18與Rc19可以形成π鍵，并且Rc17和Rc110可以表示取代基。特別優(yōu)選的式1c化合物 2.部花青特別適用于本發(fā)明目的的是式2a和/或2b的部花青 式2a其中Ra21至Ra25彼此獨立地表示任何取代基，Ya21、Ya22、Ya23、Ya24彼此獨立地可以表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳環(huán)或雜環(huán)，m表示0、1、2、3、4，o表示0、1、2，F(xiàn)a21和Ca21彼此獨立地表示C＝O、C＝S或C(Ra27)＝，Ba21和Da21彼此獨立地表示任選被取代的C、N、O或S，Ra26表示O、S或另一任選被取代的5-或6-元雜環(huán)，k、i和j彼此獨立地表示0或1，Ra27表示H或任選被取代的烷基或芳基，Aa21表示O、S、Se、Te、N-Ra28、C(Ra29)(Ra210)、-C(Ra211)＝C(Ra212)-，其中Ra28至Ra212表示H或具有最多20個碳原子的任選被取代的烷基、芳基或鏈烯基，條件是，取代基Ra21至Ra25或Ra27至Ra212中的至少一個選自下列基團-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l(wèi)表示1-6之間的數(shù)，Z表示NH或N-，并且R優(yōu)選表示任選被取代的烷基或芳基。
取代基Ra22至Ra25優(yōu)選形成可以含有最多4個環(huán)、并且可任選帶有多個取代基的碳環(huán)或雜環(huán)系的剩余原子。Ra22與Ra25一起可以形成π鍵，并且Ra23和Ra24可以表示取代基。特別優(yōu)選的式2a化合物 式2-b其中Rb21至Rb25彼此獨立地表示任何取代基，Yb21、Yb22、Yb23、Yb24彼此獨立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳環(huán)或雜環(huán)，m表示0、1、2、3或4，o表示0、1、2、3或4，F(xiàn)b21和Cb21彼此獨立地表示C＝O、C＝S或C(Rb27)＝，Bb21和Db21彼此獨立地表示任選被取代的C、N、O或S，Rb26表示O、S或另一任選被取代的5-或6-元雜環(huán)，k、i和j彼此獨立地表示0或1，Rb27表示H或任選被取代的烷基或芳基，下列取代基可以優(yōu)選形成也可任選稠合的5-或6元碳環(huán)或雜環(huán)取代基Rb23與Rb24和/或Rb22，取代基Rb22與Rb21和/或Rb23，取代基Rb24與Rb25和/或Rb23。Ab21表示O、S、Se、Te、N-Rb28、C(Rb29)(Rb210)、-C(Rb211)＝C(Rb212)-，Rb28至Rb212可以表示H或具有最多20個碳原子的任選被取代的烷基或任選被取代的芳基或任選被取代的鏈烯基，或下列取代基之一，條件是，取代基Rb21至Rb25或Rb27至Rb212中的至少一個選自下列基團-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l(wèi)表示1-6之間的數(shù)，Z表示NH或N-，并且R優(yōu)選表示任選被取代的烷基或芳基。特別優(yōu)選的式2b化合物 Rhodacyanines對于本發(fā)明的目的，所用rhodacyanines尤其是式3a和/或3b化合物。 式3-a其中Ra31至Ra311彼此獨立地表示任何取代基，Ya31、Ya32、Ya33、Ya34、Ya35彼此獨立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳環(huán)或雜環(huán)，p和r彼此獨立地表示0、1或2，Qa31表示O；N(Ra312)、S或Se，Aa31、Ba3彼此獨立地表示O、S、Se、Te、N-Ra313、C(Ra314)(Ra315)或-C(Ra316)＝C(Ra317)-，其中Ra312至Ra317表示H、具有最多20個碳原子的任選被取代的烷基、芳基或鏈烯基、或任何取代基，條件是，取代基Ra31至Ra317中的至少一個選自下列基團-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l(wèi)表示1-6之間的數(shù)，Z表示NH或N-，并且R優(yōu)選表示任選被取代的烷基或芳基。
在一個優(yōu)選的具體實施方案中，取代基Ra32至Ra35或Ra36至Ra39形成可以含有最多4個環(huán)、并且可任選帶有多個取代基的碳環(huán)或雜環(huán)系的剩余原子。Ra32與Ra35或Ra36與Ra39一起可以形成π鍵，并且Ra33和Ra34或Ra37與Ra38可以表示取代基。特別優(yōu)選的式3a化合物 式3-b其中Rb31至Rb311彼此獨立地表示任何取代基，Yb31、Yb32、Yb33、Yb34、Yb55彼此獨立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳環(huán)或雜環(huán)，p和r彼此獨立地表示0、1或2，Qb31表示O；N(Rb312)、S或Se，Ab31、Bb31彼此獨立地表示O、S、Se、Te、N-Rb313、C(Rb314)(Rb315)或-C(Rb316)＝C(Rb317)-，其中Rb311至Rb317表示H、具有最多20個碳原子的任選被取代的烷基、芳基或鏈烯基、或任何取代基，條件是，取代基Rb31至Rb317中的至少一個選自下列基團-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l(wèi)表示1-6之間的數(shù)，Z表示NH或N-，并且R優(yōu)選表示任選被取代的烷基或芳基。
在一個優(yōu)選的具體實施方案中，取代基Rb36至Rb39形成可以含有最多4個環(huán)、并且可任選帶有多個取代基的碳環(huán)或雜環(huán)系的剩余原子。Rb36與Rb39一起可以形成π鍵，并且Ra37與Ra38可以表示取代基。下列取代基可以形成也可任選稠合的5-或6元碳環(huán)或雜環(huán)取代基Rb33與Rb32和/或Rb34，取代基Rb32與Rb33和/或Rb31，取代基Rb34與Rb35和/或Rb33。特別優(yōu)選的式3b化合物 苯乙烯基染料特別優(yōu)選的用于本發(fā)明目的的苯乙烯基染料是式4a、4b、4c和/或4d化合物 式4-a其中Ra41至Ra411彼此獨立地表示任何取代基，Ya41和Ya42彼此獨立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳環(huán)或雜環(huán)，Aa4表示O、S、Se、Te、N-Ra412、C(Ra413)(Ra414)或-C(Ra415)＝C(Ra416)-，其中Ra412至Ra416表示H、具有最多20個碳原子的任選被取代的烷基、芳基或鏈烯基、或任何取代基，條件是，取代基Ra41至Ra416中的至少一個選自下列基團-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l(wèi)表示1-6之間的數(shù)，Z表示NH或N-，并且R優(yōu)選表示任選被取代的烷基或芳基。
在一個優(yōu)選的具體實施方案中，取代基Ra48至Ra411形成可以含有最多4個環(huán)、并且可任選帶有多個取代基的碳環(huán)或雜環(huán)系的剩余原子。Ra48與Ra411一起可以形成π鍵，并且Ra49和Ra410可以表示取代基。
下列取代基可以形成也可任選稠合的5-或6元碳環(huán)或雜環(huán)取代基Ra45與Ra46或Ra45與Ra44，或者Ra46與Ra41，和/或Ra41與Ra42和/或Ra44與Ra43。特別優(yōu)選的式4a化合物 式4-b其中Rb41至Rb411彼此獨立地表示任何取代基，Yb41和Yb42彼此獨立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳環(huán)或雜環(huán)，n表示0、1、2、3、4或5，條件是，取代基Rb41至Rb411中的至少一個選自下列基團-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l(wèi)表示1-6之間的數(shù)，Z表示NH或N-，并且R優(yōu)選表示任選被取代的烷基或芳基。
在一個優(yōu)選的具體實施方案中，下列取代基可形成也任選稠合的5-或6元碳環(huán)或雜環(huán)取代基Rb45與Rb46和/或Rb45與Rb44，或者Rb46與Rb41，和/或Rb41與Rb42和/或Rb44與Rb43。
取代基Rb49與Rb410和/或Rb48，取代基Rb410與Rb411和/或取代基Rb48與Rb47。特別優(yōu)選的式4b化合物 式4-c其中Rc41至Rc410彼此獨立地表示任何取代基，Yc41和Yc42彼此獨立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳環(huán)或雜環(huán)，Ac41表示O、S、Se、Te、N-Rc411、C(Rc412)(Rc413)或-C(Rc414)＝C(Rc415)-，其中Rc411至Rc416表示H、具有最多20個碳原子的任選被取代的烷基、芳基或鏈烯基、或任何取代基，并且n表示0、1、2、3、4或5，條件是，取代基Rc41至Rc415中的至少一個選自下列基團-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l(wèi)表示1-6之間的數(shù)，Z表示NH或N-，并且R優(yōu)選表示任選被取代的烷基或芳基。
在一個優(yōu)選的具體實施方案中，下列取代基可以形成也任選稠合的5-或6元碳環(huán)或雜環(huán)取代基Rc45與Rc46或Rc45與Rc44，或者Rc46與Rc41，和/或Rc41與Rc42和/或Rc44與Rc43。取代基Rc47至Rc410形成可以含有最多4個環(huán)、并且可任選帶有多個取代基的碳環(huán)或雜環(huán)系的剩余原子。Rc47與Rc410一起可以形成π鍵，并且Rc48和Rc49可以表示取代基。特別優(yōu)選使用的式4c化合物 式4-d其中Rd41至Rd410彼此獨立地表示任何取代基，Yd41和Yd42彼此獨立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳環(huán)或雜環(huán)，n可以表示0、1、2、3、4或5，條件是，取代基Rd41至Rd410中的至少一個選自下列基團-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l(wèi)表示1-6之間的數(shù)，Z表示NH或N-，并且R優(yōu)選表示任選被取代的烷基或芳基。
在一個優(yōu)選的具體實施方案中，下列取代基可以形成也任選稠合的5-或6元碳環(huán)或雜環(huán)取代基Rd45與Rd46和/或Rd45與Rd44，和/或Rd46與Rd41，和/或Rd41與Rd42和/或Rd44與Rd43。
取代基Rd49與Rd410，和/或取代基Rd48與Rd47。特別優(yōu)選使用的式4d化合物 5.方形酸對于本發(fā)明目的，優(yōu)選使用的方形酸是式5a、5b和/或5c化合物 式5-a其中Ra51至Ra510彼此獨立地可以表示任何取代基，Ya51至Ya54彼此獨立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳環(huán)或雜環(huán)，s和t彼此獨立地表示0、1、2或3，k表示1或2，Ya52表示O、S或＝NRa511，Ya53表示O-Ra512、S-Ra513或N(Ra514)(Ra515)，其中Ra511至Ra515彼此獨立地可以表示任何取代基，Aa51和Ba51彼此獨立地表示O，S，Se，Te，N-Ra516，C(Ra517)(Ra518)或-C(Ra519)＝C(Ra520)-，其中Ra516至Ra520表示任何取代基，優(yōu)選H、具有最多20個碳原子的任選被取代的烷基、芳基或鏈烯基，條件是，取代基Ra51至Ra520中的至少一個選自下列基團-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l(wèi)表示1-6之間數(shù)，Z表示NH或N-，并且R優(yōu)選表示任選被取代的烷基或芳基。
在一個優(yōu)選的具體實施方案中，取代基Ra52至Ra55或Ra56至Ra59形成可以含有最多4個環(huán)、并且可任選帶有多個取代基的碳環(huán)或雜環(huán)系的剩余原子。Ra52與Ra55和/或Ra56與Ra59一起可以形成π鍵，并且Ra53和Ra54或Ra57與Ra58可以表示取代基。特別優(yōu)選的式5a化合物 式5-b其中Rb51至Rb512彼此獨立地可以表示任何取代基，Yb51至Yb54彼此獨立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳環(huán)或雜環(huán)，s和t彼此獨立地表示0、1、2或3，k表示1或2，Yb52表示O、S或＝NRb513，Yb53表示O-Rb514、S-Rb515或N(Rb516)(Rb517)，其中Rb513至Rb517彼此獨立地可以表示任何取代基，條件是，取代基Rb51至Rb517中的至少一個選自下列基團-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l(wèi)表示1-6之間的數(shù)，Z表示NH或N-，并且R優(yōu)選表示任選被取代的烷基或芳基。
在一個優(yōu)選的具體實施方案中，下列取代基可以形成也任選稠合的5-或6元碳環(huán)或雜環(huán)取代基Rb55與Rb56和/或Rb55與Rb54，和/或Rb56與Rb51，和/或Rb51與Rb52和/或Rb54與Rb53。
取代基Rb59與Rb58或Rb510與Rb511，取代基Rb511與Rb512和/或取代基Rb58與Rb57。特別優(yōu)選的式5b化合物 式5-c其中Rc51至Rc511彼此獨立地可以表示任何取代基，Yc51至Yc54彼此獨立地表示取代或未取代的C或N，其中取代基也可以形成5-或6-元脂族或芳族碳環(huán)或雜環(huán)，s和t彼此獨立地表示0、1、2或3，k表示1或2，Yc52表示O、S或＝NRc512，Yc53表示O-Rc513、S-Rc514或N(Rc515)(Rc516)，Ac51表示O，S，Se，Te，N-Rc517，C(Rc518)(Rc519)或-C(Rc520)＝C(Rc521)-，其中Rc512至Rc521表示任何取代基，優(yōu)選H、具有最多20個碳原子的任選被取代的烷基、芳基或鏈烯基，條件是，取代基Rc51至Rc521中的至少一個選自下列基團-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l(wèi)表示1-6之間的數(shù)，Z表示NH或N-，并且R優(yōu)選表示任選被取代的烷基或芳基。
在一個優(yōu)選的具體實施方案中，下列取代基形成也任選稠合的5-或6元碳環(huán)或雜環(huán)取代基Rc55與Rc56和/或Rc55與Rc54，和/或Rc56與Rc51，和/或Rc51與Rc52和/或Rc54與Rc53。
取代基Rc57至Rc510優(yōu)選形成可以含有最多4個環(huán)、并且可任選帶有多個取代基的碳環(huán)或雜環(huán)系的剩余原子。Rc58與Rc59一起可以形成π鍵，并且Rc57與Rc510可以表示取代基。特別優(yōu)選的式5c化合物
對于本發(fā)明的應(yīng)用目的，取代基應(yīng)該理解為是指例如鹵素、尤其是例如F、Cl或Br，還有烷氧基、烷硫基、芳氧基、芳硫基、酰氨基、烷基磺酰氨基、烷基氨磺酰基、烷基氨基甲?；?、芳基磺酰氨基、芳基氨磺?；?、芳基氨基甲?；?、烷基、鏈烯基、芳基、雜芳基、亞芳基、雜亞芳基、亞烷基、烷氧羰基、脲基或氰基。還優(yōu)選取代和未取代的環(huán)烷基以及取代或未取代的芳基，特別是苯基；特別優(yōu)選的取代基是任選被取代的烷基、芳基、磺基烷基、羧基烷基、-(CH2)1-SO2-Z-SO2-R、-(CH2)1-CO-Z-SO2-R、-(CH2)1-SO2-Z-CO-R和-(CH2)1-N(R)-SO3-，其中l(wèi)表示1至6之間的數(shù)，Z表示NH或N-，并且R優(yōu)選表示任選被取代的烷基或芳基。
對于本發(fā)明的目的，鏈烯基應(yīng)該理解為是指直鏈或支鏈、環(huán)狀或鏈狀、取代或未取代的不飽和烴基，例如乙烯基、2-丙烯基、異丙烯基。
對于本發(fā)明的應(yīng)用目的，碳環(huán)或雜環(huán)系應(yīng)該理解為是指由4、5、6、7或8個碳原子組成的環(huán)系，其中最多3個碳原子可以被雜原子例如N、O、SE或S置換。該環(huán)系可以是脂族或芳族環(huán)；優(yōu)選的是，2、3或4個相同或不同的環(huán)可以以稠合環(huán)系存在。對于本發(fā)明的應(yīng)用目的，碳環(huán)芳族基團應(yīng)該理解為是指，優(yōu)選5-或6-元稠合和/或取代的環(huán)系，特別是苯基和萘基。不飽和雜環(huán)系應(yīng)該理解為是指，優(yōu)選5-或6-元環(huán)系，它可以是單環(huán)的形式，也可以是稠環(huán)系。此處，適合的雜原子尤其是N、S和O。環(huán)系優(yōu)選具有1-3個雜原子，雜原子可以相同或不同。優(yōu)選的環(huán)是呋喃基、吲哚基、噻吩基、吡咯基和咔唑基。這些基團可以是未取代的，或者優(yōu)選是被取代的。此處，碳環(huán)芳族基團和不飽和雜環(huán)基可以作為它們的一部分以取代基的形式存在，還可以包括不同環(huán)系的稠合。本發(fā)明特別優(yōu)選的式1-5之一的化合物如下所列 按照本發(fā)明，染料還可以與抗體共軛，并用于例如流動細胞分析。這些多次甲基染料的一個優(yōu)點是，它們事實上可以對500至900nm范圍內(nèi)的任何波長量身定作。結(jié)果是可以進行多色檢測。在流動細胞分析中，例如，在各種情況下，不同的抗體可以用一種熒光染料標記，然后使用合適的檢測系統(tǒng)在一個試驗中同時檢測。然后這種特定的抗體識別出細胞上的不同表位。使用該系統(tǒng)，還可以進行定量分析。因此，每一試驗使用多熒光標記抗體得到更高的信息含量。這意味著價格優(yōu)勢，尤其例如對于臨床實驗。
此外，對通過熒光共振能轉(zhuǎn)移而相互反應(yīng)的生物分子進行標記還可以進行定性和/或定量檢測方法。
本發(fā)明還提供了上述染料在標記DNA，RNA或核苷酸類似物如PNA中的用途，由此，它們可用于核酸分析。在此，通常，活性染料分子與核苷酸、核苷、核苷酸類似物或低聚核苷酸或其類似物結(jié)合。該結(jié)合是通過與活性染料反應(yīng)的核苷酸或其類似物的親核基團發(fā)生的。常規(guī)的親核基團是氨基、硫羥基、羥基或其他基團?；钚曰鶊F通常是羧基的衍生物，例如N-羥基琥珀酰亞胺酸酯、異硫氰酸酯、馬來酰亞胺或碘乙酰胺衍生物。此外，親核基團可以與磷酰胺酸酯(phosphoamidite)基反應(yīng)，在染料分子與生物分子之間形成共價鍵。
在另一應(yīng)用中，染料還可以連接到固相例如聚合物珠上，或者結(jié)合到其中。聚合物珠可以被官能化，并且作為其一部分用作生物分析的熒光標記物。
如上所述，含有式(I)基團的多次甲基染料是照相術(shù)中已知的；它們可以例如按照EP 0534283、EP 0530511、DE 1081311中所述方法獲得。
相反，含有式(I)基團、并且同時含有能使其形成共價鍵的基團的多次甲基染料選自下列化合物(a)(b)-(CH2)nNCS，-(CH2)nNCO， 這些化合物是新的，并且在現(xiàn)有技術(shù)中從未描述過。因此，下面將描述獲得這些“活化”染料的合成方法制備本發(fā)明染料F和J的合成方法1.合成F A將0.15mol 3，4-二羥基-3-環(huán)丁烯-1，2-二酮在150mL無水乙醇中加熱回流12小時。
濃縮反應(yīng)混合物。
所得的油狀物經(jīng)柱色譜純化。
流動相甲基叔丁基醚/異辛烷50∶50
固定相AMICON 35-70 mic。
產(chǎn)率48％ C將0.055mol A、0.0068mol B和0.0078mol三乙胺在50mL無水乙醇中煮沸回流。35分鐘后，加入0.107mol三乙胺。3.5小時后，使該混合物冷卻。加入乙酸乙酯，并在劇烈攪拌后傾析該混合物。重復(fù)這些步驟3次，得到油狀物(C)。水解成D將油狀物C在0.145mol (C4H9)4NOH(1M甲醇溶液)中加熱回流。30分鐘后，使該混合物冷卻。加入500mL丙酮和16mL濃鹽酸。濾出沉淀的固體。產(chǎn)量28g E將0.63mol 2，3，3-三甲基假吲哚和0.5mol Br(CH2)5COOH在少量乙腈中加熱回流3小時。反應(yīng)混合物的溫度為130℃。加入0.5mol乙酸，并使該混合物冷卻至100℃。然后加入250mL甲乙酮，并將該混合物在冰浴中再冷卻至15℃。濾出沉淀的固體，并在50℃干燥。
產(chǎn)率75％ G將3.5mol苯基肼-4-磺酸和1.9L乙酸在105℃加熱。30分鐘后，滴加4.8mol 3-甲基-2-丁酮。1小時50分鐘后，加熱除去溶劑，并加入在3.5L甲醇中的4.2mol乙酸鉀。該混合物進一步在冰浴中冷卻，并濾出沉淀的固體。用乙酸乙酯洗滌。
產(chǎn)率77％ H將26.8mol氯乙酰氯和25.5mol甲磺酰胺在10.2L乙酸丁酯中緩緩煮沸回流。8小時后，使該混合物冷卻至20℃。濾出沉淀的固體，并在4L乙酸丁酯中攪拌。沉淀的固體在裝有通風(fēng)機以幫助干燥的櫥柜內(nèi)于50℃干燥。
產(chǎn)率74％ B將2.5mol G和2.5mol H在1.3L環(huán)丁砜中、于130℃加熱。5小時50分鐘后，使該混合物冷卻至50℃。加入2.5L丙酮，并將該混合物進一步冷卻至室溫。濾出沉淀的固體，并用丙酮洗滌。在1.6L溫?zé)岬娜ルx子水中攪拌該沉淀的固體。加入1.6L乙醇，并使該混合物冷卻。濾出沉淀的固體，并用乙醇洗滌。產(chǎn)率53％ F在裝有迪安-斯榻克分水器的燒瓶中，將4.7g D、3.5g E和1.4mL三乙胺在正丁醇/甲苯中煮沸回流。2.5小時后，使該混合物冷卻。該混合物用水萃取3次。濃縮反應(yīng)混合物，然后再溶解于乙醇中。加入3g乙酸鉀，并將該混合物過濾。將沉淀的固體溶解在水中，加入丙酮。傾析出溶劑，加入更多丙酮。重復(fù)這些步驟直至出現(xiàn)沉淀。濾出沉淀的固體。2.合成J I將0.1mol G和0.12mol Br(CH2)5COOH在35mL環(huán)丁砜中于130℃加熱。3小時后，加入100mL二甲基乙酰胺，并使該混合物冷卻至室溫。濾出沉淀的固體，并在濾器上用二甲基乙酰胺洗滌。在丙酮中將沉淀的固體煮沸。冷卻后，將該混合物過濾，并在裝有通風(fēng)機以幫助干燥的櫥柜中、于50℃干燥。產(chǎn)率90％ J將4.7g D和3.5g I在80mL正丁醇/吡啶(7∶1)中煮沸回流2小時10分鐘。將該混合物冷卻至室溫，濾出沉淀的固體。在濾器上，用正丁醇或丙酮洗滌該固體。將濾出的固體溶解在7mL去離子水和30ml乙腈中，并在攪拌下加入乙腈。傾析出液相，并在攪拌下加入更多的乙腈。傾析出液相，并將所得油狀物與40mL飽和氯化鈉溶液一起攪拌。離心該細分散的懸浮液，并傾析出液相。將沉淀的固體溶解在甲醇中，并濾出氯化鈉。濃縮濾液。產(chǎn)物在50℃干燥。產(chǎn)率1.57g(18.5％)由具有羧基官能團的多次甲基染料制備琥珀酰亞氨基酯的一般方法本發(fā)明描述了由具有至少一個羧基官能團的多次甲基染料制備琥珀酰亞氨基酯。然后，這些酯可用于標記生物分子如蛋白質(zhì)、抗體或核酸。
將0.05mmol染料和碳酸二琥珀酰亞氨基酯(1.5當量/羧基)溶解在40mL DMF中，并加入一刮勺尖二甲氨基吡啶。該混合物在40℃攪拌3小時。冷卻后，將上清液分成1ml的等份量，裝入玻璃小瓶中。減壓蒸發(fā)溶劑，并在4℃避光貯藏該產(chǎn)物直至使用。
粗產(chǎn)物直接用于標記蛋白質(zhì)。標記蛋白質(zhì)的一般方法為了進行標記，將粗產(chǎn)物(1等份)溶解在1ml DMF中。將50μl該溶液吸移至在0.1M碳酸鹽緩沖液(pH9.2)中的1.5mL(＝1mg)抗-HSA溶液中。然后在室溫攪拌反應(yīng)溶液2小時。
然后，使用預(yù)先用PBS(pH7.4)平衡好的Sephadex G50柱進行凝膠滲透色譜，從未結(jié)合的染料中分離共軛物。用染料標記低聚核苷酸的一般方法本發(fā)明染料還可用于標記DNA或RNA核苷酸或核苷酸類似物。 染料K將50mmol活性染料，例如異硫氰酸酯K溶解在50ml DMF或乙腈中。首先將10nmol NH2-低聚核苷酸加至150μl 50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.2)中，并用移液管緩緩加入75nmol染料。在25℃和避光條件下攪拌該溶液3-5小時。純化低聚核苷酸用C8柱通過RP-HPLC從未結(jié)合的染料和未標記的DNA中純化未標記的低聚核苷酸。用線性梯度、例如70％水至100％甲醇洗脫30分鐘。
收集在254nm和染料最大吸收處同時吸收的餾分，并減壓除去溶劑。
為了進一步使用修飾的低聚核苷酸，可以通過用乙醇沉淀從過量的鹽中將其分離。
實施例表1示出了在相似的染料/蛋白質(zhì)摩爾比時染料的相對量子產(chǎn)率。所用蛋白質(zhì)是HSA(人血清白蛋白)。
表1
測定染料/蛋白質(zhì)的摩爾系數(shù)用Pierce的BCA方法(文獻Bradford，M.M.；Anal.Biochem.(1976)72，248-254)。預(yù)先已經(jīng)制作了抗HSA的校準曲線。
通過吸收光譜測定染料濃度。測定量子產(chǎn)率測定相對于Cy5的量子產(chǎn)率。測定消光系數(shù)假定Beer’s定律適用，測定消光系數(shù)。用活化染料F標記抗-HSA為了進行標記，將粗產(chǎn)物(1等份)溶解在1ml DMF中。將50μl該溶液移入在碳酸鹽緩沖液(pH9.2)中的1.5mL(＝1mg)抗-HSA溶液中。在室溫和避光條件下攪拌反應(yīng)溶液2小時。
使用Sephadex G25柱凝膠滲透色譜，從未結(jié)合的染料中分離共軛物。所用的洗脫緩沖液是PBS，pH7.4。
按照類似的方法制備列于表1中的其他染料的蛋白質(zhì)共軛物。
表1示出了本發(fā)明染料比起例如Cy5具有較高的量子產(chǎn)率和消光系數(shù)。因此，它們尤其適于用作生物分析的熒光標記物。
與迄今常用的多次甲基染料相比，本發(fā)明染料的染料共軛物顯示出較低的形成聚集體的趨勢。其證據(jù)列在表2中。
表2
在單體最大吸收中的吸收強度是單體在溶液中濃度的相對度量，對于聚集體的濃度也是如此?？梢詫Ρ绕饐误w向藍移的聚集體最大吸收中的吸收強度進行修正。
表2示出了單體和聚集體最大吸收的強度比。鹽濃度增加導(dǎo)致聚集體形成。與CY5相比，本發(fā)明的染料J顯示聚集體的形成非常低。方形酸染料如Sq-1至Sq-3在聚集體形成方面具有不穩(wěn)定的特性，聚集體的形成隨著鹽濃度的增加而增加。
相反，本發(fā)明的染料F和J具有穩(wěn)定的特性。光穩(wěn)定性通過將染料溶液暴露在日光下測定光穩(wěn)定性。溶液的吸收在1.4至1.60.D.之間變化。測量隨著時間推移吸收的減少以測定染料的光穩(wěn)定性。由于染料的處理還包括染料暴露于日光下過程中的手工操作步驟，所以選擇這些條件。如果是CY5，這種下降明顯清晰可見的，甚至在30分鐘后。吸收下降了12％。本發(fā)明染料則不出現(xiàn)這種情況，因此后者由于能維持穩(wěn)定的吸收而對使用者也是更有利的。
權(quán)利要求
1.多次甲基染料，含有至少一個式(I)的取代基， 其中n表示1、2、3、4、5、6、7、8或9；Y、A表示吸電子基團，優(yōu)選C＝O或-SO2-，并且R表示任選被取代的烷基或芳基，并且包括至少一種選自下列的取代基(a) (b)-(CH2)nNCS， -(CH2)nNCO， 或
2.權(quán)利要求1的化合物，其特征在于，多次甲基染料是花青染料、部花青、rhodacyanines、苯乙烯染料、方形酸染料和/或巴豆酸染料。
3.權(quán)利要求1或2所述的至少一種化合物通過共價結(jié)合標記生物分子的用途。
4.至少一種含有式(I)基團的多次甲基染料在生物分子染色中的用途。
5.至少一種下列化合物在標記生物分子中的用途 Naphthole Croconium染料 Naphthole Squaraines
全文摘要
本發(fā)明涉及新的多次甲基染料,其中含有至少一個式(I)的?；酋０被椭辽僖环N權(quán)利要求書中所示式(a)至(n)化合物的基團,在式(I)中,n、Y、A和R的含義如權(quán)利要求書中所示。本發(fā)明多次甲基染料適于用作染料和/或標記物,尤其是用于生物分子染色或標記。
文檔編號C09B23/02GK1369062SQ00811340
公開日2002年9月11日 申請日期2000年7月24日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月5日
發(fā)明者G·德羅維爾, M·米斯菲爾德特, L·西蒙 申請人:拜爾公司