專利名稱：一種草酸青霉菌、其菌劑及其制備方法、以及其制劑在解磷防病提高土壤肥力方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物、微生物菌劑及其應(yīng)用，特別是涉及一種草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)、草酸青霉菌菌劑及其制備方法、以及草酸青霉菌在制備解磷防病并提高土壤肥力菌劑的應(yīng)用，尤其是能產(chǎn)生水溶性物質(zhì)草酸和檸檬酸(2-羥基-1，2，3-丙烷三羧酸)的草酸青霉菌及其菌劑、菌劑的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磷是植物必需的營養(yǎng)元素之一，土壤中全磷濃度在0.02％～0.5％范圍，平均約為0.05％。但是土壤中95％以上的磷為無效形式，不能為植物吸收利用，因此，我國74％的耕地土壤缺磷。當(dāng)季作物施用的磷肥，其利用率僅為5％～25％，大部分施入土壤中的磷被固定為不可利用態(tài)。因此，研究土壤中磷素的有效化過程，對(duì)提高土壤肥力、節(jié)約能源、降低農(nóng)用開支以及對(duì)環(huán)保均有極其重要的意義。二十世紀(jì)30年代，前蘇聯(lián)從土壤中分離到解磷巨大芽孢桿菌(B.megatherium phospherium)，50年代Sperber在“自然”雜志上發(fā)表文章肯定了土壤細(xì)菌在磷素礦化中的作用；50至60年代，我國開展了解磷細(xì)菌的研究，并在大面上進(jìn)行試驗(yàn)和應(yīng)用；在繼后的實(shí)際應(yīng)用中，多數(shù)實(shí)例表明磷細(xì)菌具有解磷和增產(chǎn)作用，但有不穩(wěn)定現(xiàn)象。這種現(xiàn)象在國外有許多報(bào)告，因此，對(duì)解磷微生物的研究和利用一直是國內(nèi)外所關(guān)注的問題。90年代以來，國外連續(xù)對(duì)解磷真菌的研究表明，其解磷效率及穩(wěn)定性均優(yōu)于解磷細(xì)菌，并已開始向產(chǎn)業(yè)化方向發(fā)展。Kucey等人1989年評(píng)述了微生物在解磷方面的作用。Torre等人1993年評(píng)述了由真菌礦化磷素的機(jī)制。1992年Cunningham等研究了比拉氏青霉(Penicillium bilaii)的解磷作用及機(jī)制。晚近，1996年Vassilev等對(duì)變幻青霉Penicillium variabile、1999年Whitelaw等對(duì)放射青霉Penicillium radicum、1999年Reyes等對(duì)皺青霉Penicillium rugulosum等的解磷作用作過報(bào)道。2001年Reyes等報(bào)道了皺青霉Penicillium rugulosum野生菌株及UV-誘變菌株礦化磷的作用及應(yīng)用前景。從以上這些研究可以看出，對(duì)解磷微生物研究熱點(diǎn)已從細(xì)菌轉(zhuǎn)向真菌，尤其是向青霉菌的研究和開發(fā)方向發(fā)展。Cunningham和Kuiack對(duì)青霉菌解磷機(jī)制研究證明，檸檬酸和草酸的生成是該菌解磷的機(jī)制(“Production ofCitric and Oxalic Acids and Solubilization of Calcium Phosphate byPenicillium bilaii”，此文發(fā)表于Applied and Environmental.Microbiology，May 1992，p.1451-1458；)。1993 Torre等研究了常見青霉Penicillium frequentans分化礦石的生物化學(xué)機(jī)制并證明，草酸、檸檬酸和葡萄糖酸的產(chǎn)生是關(guān)鍵因素(“Biochemical mechanisms of stone alterationcarried out by filamentous fungi licing in monuments”，此文發(fā)表于Biogeochemistry 19129-147，1993；)。Kucey等評(píng)述了微生物提高植物可利用磷素的研究進(jìn)展(Microbially mediated increases in plant-acailablephosphorus，此文發(fā)表于Advances in agronomy，vol，42，199-228；)。2001年Reyes等研究了皺青霉Penicillium rugulosum的野生菌株及紫外線誘變菌株分解磷礦石提高植物可利用磷含量(Solubilizaton of phosphate rocksand minerals by a wild-type strain and two UV-induced mutants ofPenicillium rugulosum”，此文發(fā)表于Soil Biology & Biochemistry 331741-1747)。1982年，Windels和Kommedahl利用草酸青霉Penicilliumoxalicum處理豌豆種子防治豌豆出苗前爛種和苗期病害(Rhizosphereeffects of pea seed treatment with Penicillium oxalicum”，此文發(fā)表于Phytopathology 72198-194)。
在國外，對(duì)Penicillium bilaii已進(jìn)行了生物學(xué)、生物化學(xué)及生產(chǎn)工藝研究，在澳大利亞及加拿大已登記商品化生產(chǎn)和應(yīng)用。
綜上所述，目前國內(nèi)外用于解磷的真菌或細(xì)菌僅提及解磷作用，并未涉及其防病作用；而用于防病的有益真菌或細(xì)菌，也未見涉及其磷解作用。經(jīng)查新，我國與本項(xiàng)研究相關(guān)的報(bào)告尚未發(fā)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微生物、微生物菌劑及其應(yīng)用，特別是涉及一種草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)、含草酸青霉菌的菌劑及其制備方法、以及由草酸青霉菌制備的解磷防病并提高土壤肥力菌劑的應(yīng)用。尤其是能產(chǎn)生水溶性物質(zhì)草酸和檸檬酸(2-羥基-1，2，3-丙烷三羧酸)的草酸青霉菌及其菌劑、菌劑的制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明克服了目前用于解磷真菌或細(xì)菌僅涉及解磷作用，并未涉及其防病作用，或用于防病的有益真菌或細(xì)菌，而未見涉及其磷解作用的菌劑的缺點(diǎn)。本發(fā)明提供的草酸青霉菌菌劑同時(shí)具有解磷和防病作用。
本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的使用的微生物用來生產(chǎn)本發(fā)明所述的菌劑是一種新的微生物，屬于真菌的青霉屬，草酸青霉菌種(Penicillium oxalicum)。名稱為BGP-01，簡(jiǎn)稱BGP-01菌。它能產(chǎn)生水溶性物質(zhì)草酸和檸檬酸(2-羥基-1，2，3-丙烷三羧酸)，此水溶性物質(zhì)是溶解非有效磷和防病的主要機(jī)制。BGP-01分離自河北省無農(nóng)事活動(dòng)的山地土壤及耕作土壤上的植物根際。該菌株已于2003年3月1日保藏在中國微生物保藏中心，保藏號(hào)為CGMCC 0891。
草酸青霉菌的分離方法分離的方法為平板稀釋分離法，用磷酸三鈣選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，測(cè)量消解圈，應(yīng)用高壓液相色譜，證明該菌能夠產(chǎn)生水溶性物質(zhì)草酸和檸檬酸(2-羥基-1，2，3-丙烷三羧酸)。
BGP-01菌株具有以下性質(zhì)1、形態(tài)特征該菌分生孢子梗直立(100-200um)、無色、有分隔、具有刷狀小梗、小梗叢生于分枝頂端呈花瓶狀、分生孢子常鏈狀生長(zhǎng)、球形至橢圓形、無色至著色、光滑(4.5-6.5×3.0-4.0um)。
2、菌落情況該菌在馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上菌落邊緣白色，孢子形成后黃綠至深綠色。
本發(fā)明所述草酸青霉菌BGP-01的制備，所述制備可以為液體培養(yǎng)，也可以為固體培養(yǎng)，可使培養(yǎng)基中含有常用于微生物培養(yǎng)的碳源、氮源及其它營養(yǎng)液。其中碳源可為淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、肌醇、甘露醇等。氮源可為胨、大豆粉、肉膏、麥皮、尿素、玉米漿、銨鹽、硝酸鹽，及其他有機(jī)鹽或無機(jī)鹽含氮化合物。至于其他營養(yǎng)源則可適當(dāng)添加一些無機(jī)鹽。例如食鹽、磷酸鹽類及鉀、鈣、鋅、錳、鐵之類的金屬鹽。
優(yōu)選為馬鈴薯，葡萄糖，瓊膠粉，水配置的PDA培養(yǎng)基。將草酸青霉菌BGP-01(微生物包藏號(hào)為CGMCC No.0981)接種于該培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)條件適宜的生長(zhǎng)溫度為20-25℃，適宜的PH值為4.0-8.0，優(yōu)選的PH值為7.0，一般可在PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。
培養(yǎng)的草酸青霉菌BGP-01菌株，貯存在-20℃冰箱內(nèi)。
本發(fā)明還提供另一種所述草酸青霉菌的培養(yǎng)基，用于工業(yè)培養(yǎng)此真菌，所述培養(yǎng)基組分為淀粉、植物蛋白、植物脂肪、粗纖維，優(yōu)選為玉米粉、豆餅粉、麩皮粉、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、花生油。
所述培養(yǎng)基各組分的配方包括玉米粉1.5-4.5％、豆餅粉1.5-4.5％、麩皮粉1.5-4.5％、K2HPO41.9-2.4％、KH2PO40.5-1.0％、MgSO40.005-0.1％、花生油0.2-0.4％、水。
最隹配方為玉米粉3％、豆餅粉3％、麩皮粉3％、K2HPO42.15％、KH2PO40.8％、MgSO40.075％、花生油0.3％、其余為水。
本發(fā)明的一種草酸青霉菌菌劑所述菌劑包括草酸青霉菌BGP-01及其發(fā)酵基物、吸附劑、填充物、水。用于防治多種土傳病害并且通過溶解土壤中非有效磷而提高土壤肥力。
所述填充物可以選用磷礦粉。
所述吸附劑可以選用蛭石、草炭。
本發(fā)明所述草酸青霉菌菌劑的制備方法，至少包括如下步驟1)菌種活化；2)種子罐發(fā)酵；3)生產(chǎn)罐深層發(fā)酵；4)轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)；5)收集孢子。
所述草酸青霉菌菌劑制備方法還進(jìn)一步包括1)培養(yǎng)斜面菌株和在茄瓶中培養(yǎng)種子菌株；2)加入填料后攪拌、供氣、發(fā)酵；3)固體發(fā)酵基物滅菌；4)均勻加入發(fā)酵菌劑，保溫培養(yǎng)；5)水洗過濾收集孢子；6)加入吸附劑、填充物，充分混勻；7)檢驗(yàn)，包裝。
所述種子罐到生產(chǎn)罐的草酸青霉菌菌種接種量為3～5％，優(yōu)選為4％；起始PH為7.2～8.0，優(yōu)選PH為7.5。
所述草酸青霉菌菌劑制備方法工藝條件為所述培養(yǎng)基PH為6.6～8.0，優(yōu)選為7；所述發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)溫度為20～25℃，優(yōu)選為23℃，PH保持在6.4～8.0，優(yōu)選為7，通風(fēng)量為1∶0.5～0.8，優(yōu)選為0.6，罐壓為1.5～2.0/cm2，優(yōu)選為1.8/cm2攪拌速度為220rpm，72～96小時(shí)，優(yōu)選為80小時(shí)發(fā)酵完畢。
所述加入的填充料選自蛭石、草炭，優(yōu)選配比為1∶1。
本發(fā)明所述草酸青霉菌菌劑可使用該技術(shù)領(lǐng)域中已知農(nóng)藥所通用的固相、液相及乳化分散劑等各種載體，并能制成顆粒劑、粉劑、乳化劑、可濕性粉劑、片劑、油劑、噴霧劑、煙霧劑等任意劑型。一般而言，各制劑中有效成分的配比在乳劑及可濕性粉劑中為10-90％；在、粉劑及油劑等中為0.1-10％；可根據(jù)不同的使用目的而適量增減。
本發(fā)明還提供了一種草酸青霉菌在制備植物解磷防病提高土壤肥力菌劑方面的應(yīng)用。
本發(fā)明具有以下有益效果和優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供的草酸青霉菌菌劑同時(shí)具有解磷和防病作用，優(yōu)于目前國內(nèi)外用于解磷的真菌或細(xì)菌有解磷作用，并未涉及其防病作用；或用于防病的有益真菌或細(xì)菌，也未見提及其磷解作用。
1)在解磷方面與現(xiàn)有國內(nèi)使用的磷細(xì)菌相比，其解磷效果穩(wěn)定。
2)在防病方面與現(xiàn)有國內(nèi)使用的磷細(xì)菌相比，其有獨(dú)特的防病作用。
經(jīng)過與磷礦粉混和發(fā)酵制備過程，本發(fā)明的菌株具有以下效果可使有效磷的含量提高135.32ppm；在PDA培養(yǎng)基上經(jīng)過對(duì)多種重要植物病原菌進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明菌株對(duì)它們有顯著抑制作用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1草酸青霉菌BGP-01的制備，步驟如下以馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊膠粉15g，水1000ml的比例制成培養(yǎng)基。將草酸青霉菌BGP-01(微生物包藏號(hào)為CGMCC No.0981)接種于該培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件生長(zhǎng)溫度為23℃，PH值為7.0。
培養(yǎng)的草酸青霉菌BGP-01菌株，貯存在-20℃冰箱內(nèi)。
實(shí)施例2草酸青霉菌劑的制備本發(fā)明所述的草酸青霉菌菌劑包括草酸青霉菌BGP-01及其發(fā)酵基物、吸附劑、填充物、水。
所述的培養(yǎng)基組分為玉米粉3％、豆餅粉3％、麩皮粉3％、K2HPO42.15％、KH2PO40.8％、MgS040.075％、花生油0.3％。
制備步驟如下制備斜面種子菌株，制備茄瓶種子菌株，種子罐培養(yǎng)，發(fā)酵罐發(fā)酵，加填充料培養(yǎng)，收集孢子，加入助劑，檢驗(yàn)，包裝。
具體步驟如下1、制備斜面種子菌株以實(shí)施例1，PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的草酸青霉菌BGP-01菌株，貯存在-20℃冰箱內(nèi)，使用前取出并活化(即將純菌種接種在平板上培養(yǎng))兩次。
2、在茄瓶中制備種子菌株將上述培養(yǎng)的菌株用PDA培養(yǎng)基在250毫升茄瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為23℃，96小時(shí)生長(zhǎng)良好時(shí)用滅水菌洗下，作為種子罐的接種物。
3、按種子罐體積的2/3投培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成為玉米粉3％、豆餅粉3％、麩皮粉3％、K2HPO42.15％、KH2PO40.8％、MgSO40.075％、花生油0.3％。起始PH7.5。
4、從種子罐向生產(chǎn)罐接種，接種量4％，開始發(fā)酵。發(fā)酵條件控制培養(yǎng)溫度為23℃，通風(fēng)量為1∶0.6，罐壓為1.8/cm2，攪拌速度為220rpm，接種72小時(shí)后每隔4小時(shí)取樣一次，觀察菌體生長(zhǎng)狀況、是否有污染，待發(fā)現(xiàn)孢子生成后，液體發(fā)酵完成，將發(fā)酵物均勻混合于蛭石、草炭中，比例為1∶1。進(jìn)行固體發(fā)酵。待孢子充分形成后，水洗法收集孢子。加磷礦粉填充料，檢驗(yàn)，包裝。
質(zhì)量檢驗(yàn)按產(chǎn)品企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定，菌數(shù)達(dá)到20億/克。
經(jīng)過與磷礦粉混和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明的菌株具有以下效果可使有效磷的含量提高135.32ppm；在PDA培養(yǎng)基上經(jīng)過對(duì)多種重要植物病原菌進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明菌株對(duì)它們有顯著抑制作用。
有效磷含量測(cè)定方法1、土壤速效磷測(cè)定方法——碳酸氫鈉法(根據(jù)Olsen et.al.，1954Eestimation of available P in soils by extraction with sodiumbicarbonate.USDA circ.939.)2、磷礦粉速效磷測(cè)定方法——釩鉬黃比色法(根據(jù)魯如坤等《土壤化學(xué)分析方法》1999年372頁)對(duì)主要土傳植物病原菌的測(cè)定方法及結(jié)果測(cè)定方法采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法，根據(jù)抑菌圈的大小記錄抑菌作用的強(qiáng)弱。以下為草酸青霉菌對(duì)主要土傳病原菌抑制作用的測(cè)定結(jié)果；

注上表“+”號(hào)代表抑制強(qiáng)度，共分五級(jí)，由“0”至“4”。“0”表示無抑制作用，“4”表示完全抑制。
權(quán)利要求
1.一種草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)(微生物包藏號(hào)為CGMCCNo.0891)，所述該菌分生孢子梗直立，高度為100-200um、無色、有分隔、具有刷狀小梗、小梗叢生于分枝頂端呈花瓶狀、分生孢子常鏈狀生長(zhǎng)、球形至橢圓形、無色至著色、光滑，大小為4.5-6.5×3.0-4.0um；菌落邊緣白色，孢子形成后黃綠至深綠色。
2.一種草酸青霉菌的培養(yǎng)基，為由包括馬鈴薯、葡萄糖、瓊膠粉、水配置成的PDA培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基PH為4.0-8.0；生長(zhǎng)溫度為20-25℃。
3.一種草酸青霉菌的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基組分包括玉米粉1.5-4.5％、豆餅粉1.5-4.5％、麩皮粉1.5-4.5％、K2HPO41.9-2.4％、KH2PO40.5-1.0％、MgSO40.005-0.1％、花生油0.2-0.4％、水。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的草酸青霉菌的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基組分為玉米粉3％、豆餅粉3％、麩皮粉3％、K2HPO42.15％、KH2PO40.8％、MgSO40.075％、花生油0.3％、其余為水。
5.一種草酸青霉菌劑，包括權(quán)利要求書1所述草酸青霉菌及其發(fā)酵基物、吸附劑、填充物、水。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的草酸青霉菌劑，所述發(fā)酵基物可以為玉米粉、豆餅粉、麩皮粉、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4，所述填充物可以為磷礦粉，所述吸附劑可以為蛭石和草炭混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的草酸青霉菌劑，所述吸附劑蛭石和草炭混合比例為1∶1。
8.一種草酸青霉菌劑的制備方法，至少包括如下步驟菌種活化，種子罐發(fā)酵，生產(chǎn)罐深層發(fā)酵，轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)，收集孢子。方法工藝條件為所述草酸青霉菌培養(yǎng)基PH為6.6～8.0；所述發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)溫度為20～25℃，PH保持在6.4～8.0，通風(fēng)量為1∶0.5～0.8，罐壓為1.5～2.0/cm2，攪拌速度為220rpm，72～96小時(shí)發(fā)酵完畢；所述種子罐到生產(chǎn)罐的草酸青霉菌菌種接種量為3～5％，起始PH為7.2～8.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的草酸青霉菌菌劑制備方法，所述步驟還進(jìn)一步包括培養(yǎng)斜面菌株和培養(yǎng)茄瓶種子菌株；加入填料后攪拌、供氣、發(fā)酵；固體發(fā)酵基物滅菌；均勻加入發(fā)酵菌劑，保溫培養(yǎng)；水洗過濾收集孢子；加入吸附劑、填充物，充分混勻；檢驗(yàn)，包裝。方法工藝條件為所述草酸青霉菌培養(yǎng)基PH為7；所述發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)溫度為23℃，PH為7，通風(fēng)量為1∶0.6，罐壓為1.8/cm2，80小時(shí)發(fā)酵完畢。所述種子罐到生產(chǎn)罐的草酸青霉菌菌種接種量為4％，起始PH為7.5。
10.一種草酸青霉菌在制備植物解磷防病提高土壤肥力菌劑方面的應(yīng)用，所述菌劑可加入輔料制成農(nóng)藥所通用的顆粒劑、粉劑、乳化劑、可濕性粉劑、片劑、油劑、噴霧劑、煙霧劑等任意劑型。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物、微生物菌劑及其應(yīng)用，特別是涉及一種草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)、草酸青霉菌菌劑及其制備方法、以及草酸青霉菌在制備植物解磷防病并提高土壤肥力菌劑的應(yīng)用，尤其是能產(chǎn)生水溶性物質(zhì)草酸和檸檬酸(2－羥基－1，2，3－丙烷三羧酸)的草酸青霉菌及其制劑、菌劑的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明同時(shí)具有解磷和防病作用，在解磷方面，與現(xiàn)有國內(nèi)使用的磷細(xì)菌相比，其解磷效果穩(wěn)定；在防病方面，與現(xiàn)有國內(nèi)使用的磷細(xì)菌相比，其有獨(dú)特的防病作用。本發(fā)明可使有效磷的含量提高135.32ppm；在PDA培養(yǎng)基上經(jīng)過對(duì)多種重要植物病原菌進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明菌株對(duì)它們有顯著抑制作用，本發(fā)明在我國為首次報(bào)道。
文檔編號(hào)C09K17/00GK1524949SQ0310522
公開日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2003年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月24日
發(fā)明者唐文華, 余永年, 王祺 申請(qǐng)人:唐文華