專利名稱：近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種將納米熒光標記材料結(jié)合到羥基磷灰石上的方法及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，尤其涉及將近紅外熒光量子點納米粒子連接到羥基磷灰石上，形成標記了近紅外熒光量子點的羥基磷灰石的復(fù)合粒子，屬于材料和生物醫(yī)學(xué)的交叉領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
羥基磷灰石是一種弱堿性磷酸的鈣鹽，是人體和動物骨骼與牙齒的主要無機成分，其化學(xué)式為Ga10(PO4)6(OH)2。羥基磷灰石晶體為六方斜棱柱形，骨中的小片狀羥基磷灰石尺寸約為(1.5-3.5nm)×(5.0-10.0nm)×(40.0nm-50.0nm)，為天然的納米結(jié)構(gòu)。
研究發(fā)現(xiàn)，人工合成的羥基磷灰石具有優(yōu)良的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性，是一種理想的骨替換材料。將納米級羥基磷灰石植入骨組織后，能與骨組織形成牢固的化學(xué)鍵結(jié)合，且具有骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，已廣泛應(yīng)用于缺損骨的修復(fù)，是目前植入材料研究的重點和熱點之一。羥基磷灰石的表面構(gòu)晶離子很容易通過離子交換或吸附作用吸附其周圍環(huán)境中的離子、分子和顆粒。在生物學(xué)領(lǐng)域，羥基磷灰石還常用來作為生物大分子分離純化的介質(zhì)。
Zaheer A等[Zaheer A，et al.In vivo near infraredfluorescence imaging of osteoblastic activity.NatureBiotechnology，2001，191148-1154]曾將近紅外熒光的有機染料分子連接到羥基磷灰石上，用于研究骨骼的生長、造骨細胞的轉(zhuǎn)移、冠狀動脈硬化及其他人類疾病的診斷中。該方法可以通過近紅外熒光適時地觀察到骨的生長情況、細胞轉(zhuǎn)移過程及組織的病變情況，給這些研究帶來了極大的方便。然而，近紅外有機染料具有其自身的缺陷，如染料的化學(xué)性質(zhì)不夠穩(wěn)定，熒光量子產(chǎn)率不高、熒光漂白速率快等。
此外，骨癌的熱療倍受人們關(guān)注。癌細胞在溫度達到43℃時即呈現(xiàn)死亡，而人體正常的健康細胞加熱到48℃亦能健康生存。然而，由于近紅外熒光的有機染料分子的光學(xué)穩(wěn)定性較差，不太適用長時間的激發(fā)而發(fā)熱，如果用于骨癌的熱療，則有其一定的局限性。
而近紅外熒光量子點納米粒子則可以克服有機熒光染料的這些缺陷，具有熒光量子產(chǎn)率高、光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在光的激發(fā)下可使其產(chǎn)生穩(wěn)定而持久的熱量等優(yōu)點。此外，還可以利用近紅外熒光量子點在光激發(fā)下產(chǎn)生熱效應(yīng)以及產(chǎn)生的具有高活性的·OH和·O2自由基來摧毀腫瘤細胞。
量子點納米粒子的應(yīng)用領(lǐng)域已經(jīng)涉及藥學(xué)、細胞生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、分子生物學(xué)等，其研究將對生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生巨大而深遠的影響。

發(fā)明內(nèi)容
針對已有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種近紅外納米熒光材料標記的羥基磷灰石；本發(fā)明的目的之二在于提供這種羥基磷灰石的制備方法；本發(fā)明的目的之三在于提供這種近紅外納米熒光材料標記的羥基磷灰石在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
本發(fā)明的發(fā)明目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石，其中近紅外熒光量子點納米粒子與羥基磷灰石的連接是在水相或有機相或水相與有機相的混合液中進行的，在該液相體系中，羥基磷灰石的濃度為5μg/mL～0.25g/mL，近紅外熒光量子點的濃度為1ng/mL～15mg/mL。
所述的近紅外熒光量子點為主要由II-VI族或III-V族元素組成的在近紅外區(qū)發(fā)射熒光的半導(dǎo)體納米微晶。包括單一半導(dǎo)體材料組成的近紅外熒光量子點納米粒子、以一種半導(dǎo)體納米粒子為核，另一種無機材料為殼的核-殼型近紅外熒光量子點納米復(fù)合粒子或近紅外熒光量子點量子阱結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合粒子中的一種或一種以上的組合。
所述的羥基磷灰石是一種弱堿性磷酸鈣鹽，包括人工合成的羥基磷灰石或動物的自然的羥基磷灰石，為針狀、或棒狀，或球狀、或圓餅狀、或其他不規(guī)則形狀。所述的磷酸鈣鹽，還包括磷灰石、磷酸鈣基骨水泥。所述的羥基磷灰石是通過水相合成或高溫固相合成的方法獲得的，包括水熱法、水解法、共沉淀法、溶膠-凝膠法、氣溶膠法、酸堿反應(yīng)法、噴霧干燥法、在微乳中合成、在脂質(zhì)體內(nèi)水相中合成、以及通過在濕空氣中高溫分解含鈣化合物的方法中的任意一種，或者是通過對動物體內(nèi)自然骨進行高溫煅燒獲得的，獲得的羥基磷灰石為針狀、或棒狀，或球狀。
所述的近紅外熒光量子點是指主要由II-VI族或III-V族元素組成的在近紅外區(qū)發(fā)射熒光的半導(dǎo)體納米微晶，包括單一半導(dǎo)體材料組成的近紅外熒光量子點納米粒子；以一種半導(dǎo)體納米粒子為核，另一種無機材料為殼的核-殼型近紅外熒光量子點納米復(fù)合粒子；以及近紅外熒光量子點量子阱結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合粒子中的一種或任意幾種的組合。近紅外熒光量子點納米粒子表面可修飾能增強粒子穩(wěn)定性的分子，如親水性高分子、疏水性高分子、表面活性劑等。
近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石的制備方法如下本發(fā)明將近紅外熒光量子點納米粒子通過吸附、離子交換、共價鍵合中的任意一種或幾種方法連接到羥基磷灰石上，形成標記了近紅外熒光量子點的羥基磷灰石的復(fù)合粒子。近紅外熒光量子點納米粒子與羥基磷灰石的連接是在液相體系如在水相或有機相或水相與有機相的混合液中進行的。
本發(fā)明提供的近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石的具體制備方法是將羥基磷灰石分散在水溶液或有機溶液如甲醇、乙醇、三氯甲烷等中，然后在惰性氣體保護或直接在空氣氣氛下向羥基磷灰石混懸液中加入近紅外熒光量子點的水溶液或有機溶液，攪拌1min～10天。通過羥基磷灰石表面的鈣離子或其他構(gòu)晶離子與近紅外熒光量子點表面的金屬離子如鎘離子等發(fā)生離子交換將近紅外熒光量子點吸附到羥基磷灰石表面?；蚴沽u基磷灰石表面與近紅外熒光量子點表面帶相異電荷，通過相異電荷的吸引將近紅外熒光量子點吸附到羥基磷灰石表面。
本發(fā)明的第二種方法是在羥基磷灰石表面修飾有機分子，在惰性氣體保護或直接在空氣氣氛下通過有機分子上的功能基團與近紅外熒光量子點發(fā)生化學(xué)鍵合或吸附作用將近紅外熒光量子點與羥基磷灰石進行連接，攪拌1min～10天。所述的在羥基磷灰石表面修飾的有機分子，是指帶有極性功能基團的有機分子，如帶有羥基、羧基、磺酸基、胺基、腈基以及能與金屬離子發(fā)生配位作用的O、N等中一種或幾種基團的高分子或小分子等有機分子，包括各種偶連劑和聚電解質(zhì)。修飾方法包括物理吸附和化學(xué)反應(yīng)。
本發(fā)明的第三種方法是將羥基磷灰石和近紅外熒光量子點一同分散于水相或分散于有機相或分散于有機溶液與水的混合液中，通過噴霧干燥獲得包埋近紅外熒光量子點的羥基磷灰石微球。噴霧干燥的條件為進風(fēng)溫度為30～250℃，出風(fēng)溫度根據(jù)進風(fēng)溫度和進料速度自動調(diào)節(jié)，進料速度為0.1～200mL·min-1，噴霧干燥室內(nèi)為惰性氣體或空氣。噴霧干燥前，可向混合溶液中加入生物相容性膠聯(lián)劑。獲得的產(chǎn)物可進一步干燥，或進一步加熱使膠聯(lián)劑分子發(fā)生變性。所述的生物相容性膠聯(lián)劑，是指帶有極性功能基團的有機分子，如帶有羥基、羧基、磺酸基、胺基、腈基以及能與金屬離子發(fā)生配位作用的O、N等中一種或幾種基團的高分子或小分子等有機分子?；旌弦褐?，膠聯(lián)劑濃度為0～20wt％。
當近紅外熒光量子點與羥基磷灰石作用之后，通過離心或過濾或透析或自身沉降或柱分離的方法除去未吸附的近紅外熒光量子點和其他雜質(zhì)。獲得的近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石復(fù)合粒子，是以水相存在的，或者是以干燥粉末狀態(tài)存在的。
近紅外熒光量子點連接到羥基磷灰石上之后，進行滅菌，滅菌方式為加熱滅菌或熱壓滅菌或濾過除菌或紫外燈輻照或其他無菌操作中的一種。
本發(fā)明所述的近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石，其應(yīng)用為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是用來研究骨骼的生長、造骨細胞的轉(zhuǎn)移、及其他人類疾病的診斷與治療。
本發(fā)明提供的近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石比現(xiàn)有的標記有機熒光染料的羥基磷灰石具有更大的優(yōu)越性，其發(fā)射的近紅外熒光具有熒光量子產(chǎn)率高、光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點，而且量子點在光激發(fā)下產(chǎn)生的熱效應(yīng)以及以及產(chǎn)生的具有高活性的·OH和·O2自由基還可以用來摧毀腫瘤細胞，可用于腫瘤的治療。本發(fā)明提供的近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石，具有重要的科學(xué)研究價值和廣闊的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體的實施例進一步說明本發(fā)明是如何實現(xiàn)的實施例1先在水溶液中合成納米級的羥基磷灰石精確稱取Ca(NO3)2·4H2O 7.8877g，用30mL去離子水溶解，并用氨水調(diào)節(jié)其pH＝10.5。精確稱取(NH4)2HPO42.6412g，用50mL去離子水溶解，亦用氨水調(diào)節(jié)其pH＝10.5。在70℃條件下將(NH4)2HPO4溶液滴加到Ca(NO3)2·4H2O溶液中，拌以磁力攪拌。滴完(NH4)2HPO4后繼續(xù)在70℃下攪拌3h，得到乳白色溶膠，自然冷卻后，通過離心使溶膠沉淀，用去離子水洗滌該沉淀3次。X-射線衍射(XRD)分析表明，獲得的產(chǎn)物為六方晶系的羥基磷灰石，透射電子顯微鏡(TEM)觀察結(jié)果表明，所獲得的產(chǎn)物為長度在50～240nm之間的針狀納米粒子。
合成近紅外熒光量子點在氮氣保護下，以氯化隔和碲氫化鈉以及一種具有配位能力的小分子為原料按一定的摩爾比在pH＝11的水溶液中反應(yīng)獲得棕色透明的碲化鎘(CdTe)納米粒子溶液，進一步熟化和鈍化處理，獲得熒光發(fā)射光譜的最大發(fā)射波長在680nm處，熒光拖尾到800nm。
在氮氣保護下將CdTe水溶液滴加到羥基磷灰石溶膠中，在混合體系中，羥基磷灰濃度為200μg/mL，CdTe濃度為20μg/mL，磁力攪拌，分別于1min，2h和10天取樣。
實驗發(fā)現(xiàn)，棕色透明的CdTe因吸附到羥基磷灰石溶膠上而發(fā)生沉淀。吸附1min的樣品，經(jīng)過離心，上清液為淡棕色，下層為棕色沉淀。吸附2h和10天的樣品，不經(jīng)過離心即沉淀完全，上層為無色澄清透明溶液，下層為棕色沉淀。在透射電子顯微鏡(TEM)下發(fā)現(xiàn)，納米針狀的羥基磷灰石表面吸附了細小的顆粒。熒光光譜檢測表明，吸附在羥基磷灰石上的CdTe仍然具有很強的熒光和很強的穩(wěn)定性。熒光發(fā)射光譜無明顯位移。
實施例2取實施例1制備的羥基磷灰石和CdTe溶液，分別經(jīng)過稀釋和濃縮處理，然后將它們混合，稀釋的混合體系中，羥基磷灰石的濃度為5μg/mL，CdTe的濃度為1ng/mL。濃縮的混合體系中，羥基磷灰石的濃度為0.25g/mL，近紅外熒光量子點的濃度為15mg/mL。振蕩30min，經(jīng)過離心，沉淀經(jīng)TEM觀察，結(jié)果羥基磷灰石上均吸附了納米顆粒，在濃縮的吸附產(chǎn)物中，羥基磷灰石已發(fā)生較嚴重聚集。
實施例3按實施例1制備濃度為500μg/mL的納米羥基磷灰石溶膠，然后在下列條件下進行噴霧干燥(1)進風(fēng)溫度為150℃，出風(fēng)溫度為95～105，進料速度為3mL/min，霧化盤轉(zhuǎn)速為20000r/min。
(2)進風(fēng)溫度為250℃，出風(fēng)溫度為100～110℃，進料速度為200mL/min，霧化盤轉(zhuǎn)速為20000r/min。
(3)進風(fēng)溫度為30℃，出風(fēng)溫度為25～30℃，進料速度為0.1mL/min，霧化盤轉(zhuǎn)速為20000r/min。
TEM觀察結(jié)果表明，獲得的干燥粉末為3～20μm的球形和圓餅形顆粒，顆粒中有大量細小的孔隙。
在氮氣保護和室溫條件下，將噴霧干燥的羥基磷灰石粉末分別分散到CdTe水溶液中，磁力攪拌2h。
結(jié)果棕色CdTe與羥基磷灰石一同沉淀，TEM觀察表明，羥基磷灰石表面可見有細小顆粒。熒光光譜檢測表明，吸附在球形和圓餅形的羥基磷灰石上的CdTe的熒光發(fā)射光譜亦無顯著位移。
實施例4按實施例1制備納米羥基磷灰石溶膠和納米CdTe水溶液，將這兩種納米粒子溶液與聚乳酸進行混合，混合液中聚乳酸濃度為0.5mg/mL。然后在空氣氣氛中以進風(fēng)溫度為150℃、出風(fēng)溫度為100～105℃、進料速度為3mL/min、霧化盤轉(zhuǎn)速為20000r/min的條件進行噴霧干燥。
結(jié)果得到約3～25μm球形和圓餅形顆粒粉末，粉末呈棕色。
實施例5按實施例1制備納米羥基磷灰石溶膠和納米CdTe水溶液，將這兩種納米粒子溶液與牛血清白蛋白(BSA)進行混合，混合液中BSA濃度為2mg/mL。然后在空氣氣氛中以進風(fēng)溫度為100℃、出風(fēng)溫度為80～85℃、進料速度為3mL/min、霧化盤轉(zhuǎn)速為20000r/min的條件進行噴霧干燥。獲得的粉末進一步在120℃加熱處理1h。
結(jié)果得到3～30μm球形和圓餅形顆粒粉末，大部分球形粒子中有凹陷或孔洞，粉末呈棕色。
實施例6按實施例2制備3～20μm的球形和圓餅形的羥基磷灰石顆粒，然后將200mg的多孔羥基磷灰石浸入到適量的熔融的平均分子量為10萬左右的聚乳酸中進行共混，得到高分子修飾增韌的羥基磷灰石復(fù)合粒子。然后將聚乳酸修飾的羥基磷灰石加入到80℃的CdTe水溶液中，氮氣保護下磁力攪拌15min。通過離心沉淀方式除去未結(jié)合到羥基磷灰石復(fù)合粒子上的CdTe納米粒子，收集沉淀，即得到標記了CdTe的羥基磷灰石。該羥基磷灰石表面呈淡棕色，可見CdTe已結(jié)合到羥基磷灰石復(fù)合粒子上。
實施例7以實施例1制備的為原料。
取Balb/C小鼠9只，在小鼠的左后腿部種上S180細胞，當腫瘤大小約為0.5～1cm時。將小鼠隨機分3組，每組3只。
對第1組小鼠剃去小鼠腫瘤部位的體毛，瘤中注射按實施例1制備的吸附了CdTe的羥基磷灰石納米復(fù)合粒子水溶液0.2mL，采用近紅外光激發(fā)腫瘤部位。
對第2組小鼠剃去小鼠腫瘤部位的體毛，瘤中注射按實施例1制備的吸附了CdTe的羥基磷灰石納米復(fù)合粒子水溶液0.2mL。
對第3組小鼠剃去小鼠腫瘤部位的體毛，然后不經(jīng)過任何其他處理。
結(jié)果，經(jīng)過10天的實驗處理后發(fā)現(xiàn)，第1組小鼠的腫瘤均明顯縮小，第2組小鼠的腫瘤生長也出現(xiàn)了一定程度的抑制，第3組小鼠的腫瘤明顯增大。本實施例表明，本發(fā)明提供的產(chǎn)品可以有效地摧毀腫瘤細胞，抑制腫瘤的生長。
權(quán)利要求
1.一種近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石，近紅外熒光量子點納米粒子與羥基磷灰石的連接是在水相或有機相或水相與有機相的混合液中進行的，在該液相體系中，羥基磷灰石的濃度為5微克每毫升到0.25克每毫升，近紅外熒光量子點的濃度為1納克每毫升到15毫克每毫升。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石，其特征在于所述的近紅外熒光量子點為主要由II-VI族或III-V族元素組成的在近紅外區(qū)發(fā)射熒光的半導(dǎo)體納米微晶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石，其特征在于所述的近紅外熒光量子點為單一半導(dǎo)體材料組成的近紅外熒光量子點納米粒子、以一種半導(dǎo)體納米粒子為核，另一種無機材料為殼的核-殼型近紅外熒光量子點納米復(fù)合粒子或近紅外熒光量子點量子阱結(jié)構(gòu)的納米復(fù)合粒子中的一種或一種以上的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石，其特征在于所述所述的羥基磷灰石為人工合成的羥基磷灰石或動物的自然的羥基磷灰石，為針狀、或棒狀，或球狀、或圓餅狀、或不規(guī)則形狀中的一種。
5.權(quán)利要求1、2、3或4所述的一種近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石的制備方法，其步驟為將近紅外熒光量子點納米粒子通過吸附、離子交換、共價鍵合中的任意一種或幾種方法連接到羥基磷灰石上，形成標記了近紅外熒光量子點的羥基磷灰石的復(fù)合粒子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石的制備方法，其特征在于將羥基磷灰石分散在水溶液或有機溶液中，然后在惰性氣體保護或直接在空氣氣氛下向羥基磷灰石混懸液中加入近紅外熒光量子點的水溶液或有機溶液，攪拌1min～10天，通過羥基磷灰石表面的鈣離子或其他構(gòu)晶離子與近紅外熒光量子點表面的金屬離子發(fā)生離子交換將近紅外熒光量子點吸附到羥基磷灰石表面，或使羥基磷灰石表面與近紅外熒光量子點表面帶相異電荷，通過相異電荷的吸引將近紅外熒光量子點吸附到羥基磷灰石表面。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石的制備方法，其特征在于在羥基磷灰石表面修飾有機分子，在惰性氣體保護或直接在空氣氣氛下通過有機分子上的功能基團如羥基、羧基、磺酸基、胺基、腈基以及能與金屬離子發(fā)生配位作用的O、N中的任意一種或幾種的組合與近紅外熒光量子點發(fā)生化學(xué)鍵合或吸附作用將近紅外熒光量子點與HAP進行連接，攪拌1min～10天。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石的制備方法，其特征在于將羥基磷灰石和近紅外熒光量子點共同分散于水相或分散于有機相或分散于有機溶液與水的混合液中，通過噴霧干燥獲得包埋近紅外熒光量子點的羥基磷灰石微球，噴霧干燥的進風(fēng)溫度為30～250℃，出風(fēng)溫度根據(jù)進風(fēng)溫度和進料速度自動調(diào)節(jié)，進料速度為0.1～200mL·min-1，噴霧干燥室內(nèi)為惰性氣體或空氣。
9.根據(jù)權(quán)利要求5～8所述的近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石的制備方法，其特征在于當近紅外熒光量子點與羥基磷灰石作用之后，通過離心或過濾或透析或自身沉降或柱分離的方法除去未吸附的近紅外熒光量子點和其他雜質(zhì)，獲得的近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石復(fù)合粒子是以水相或以干燥粉末狀態(tài)存在的，且近紅外熒光量子點連接到羥基磷灰石上之后，進行滅菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求1～4所述的近紅外熒光量子點標記的羥基磷灰石，應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其是用于研究骨骼的生長、造骨細胞的轉(zhuǎn)移、及其他人類疾病的診斷、治療尤其是骨癌的治療。
全文摘要
本發(fā)明公開了近紅外熒光量子點納米粒子標記的羥基磷灰石的制備方法及其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，本發(fā)明將近紅外熒光量子點納米粒子通過吸附、離子交換、共價鍵合等方法連接到羥基磷灰石上，使其能用于研究骨骼的生長、造骨細胞的轉(zhuǎn)移、冠狀動脈硬化及其他人類疾病的診斷與治療中。本發(fā)明近紅外熒光量子點納米粒子發(fā)射的近紅外熒光可穿透厘米級的組織，具有量子產(chǎn)率高，光學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的優(yōu)點。近紅外熒光量子點在光的激發(fā)下產(chǎn)生的熱效應(yīng)以及產(chǎn)生的具有高活性的·OH和·O
文檔編號C09K11/00GK1693410SQ200510025590
公開日2005年11月9日 申請日期2005年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月29日
發(fā)明者儲茂泉, 金鑫 申請人:同濟大學(xué)