專利名稱：細(xì)胞鋅離子檢測用的氟硼染料熒光探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)胞鋅離子檢測用熒光分子探針。
背景技術(shù)：
鋅離子是生物體中的一種二價金屬離子，也是生物體中繼鐵之后第二富集的過渡金屬。大量的鋅離子都集中在神經(jīng)組織中，如在腦組織中的濃度是0.1-0.5mM。盡管生物體中大部分的鋅離子都與蛋白質(zhì)緊緊結(jié)合，但在某些細(xì)胞中仍然存在著“游離鋅池”，游離鋅的濃度在各種哺乳細(xì)胞內(nèi)低至納摩爾級。迄今為止，人們已經(jīng)認(rèn)識到鋅在生命過程中起著許多不同的作用。其中最重要也是最廣為人知的作用就是在金屬蛋白中作為一種構(gòu)造因子。同時，鋅離子通過金屬調(diào)整蛋白直接參與調(diào)整基因表達(dá)。還有生物體內(nèi)外的大量證據(jù)都說明鋅在細(xì)胞凋亡中是一種重要的調(diào)整元素。另外，鋅離子存在于大部分的DNA和RNA聚合酶中。鋅離子能夠從突觸囊中釋放出來并通過電位調(diào)控型鈣離子信道進(jìn)入細(xì)胞，這表明游離鋅離子還具有神經(jīng)調(diào)節(jié)功能。
對金屬離子的檢測已經(jīng)存在很多方法，比如原子吸收、電子順磁共振等，但是這些方法不能夠?qū)ι矬w內(nèi)離子進(jìn)行實(shí)時檢測，且這些方法測定時樣品的預(yù)處理比較復(fù)雜，所以應(yīng)用受到一定的限制。由于熒光探針法具有靈敏度高、選擇性好、反應(yīng)時間快、能夠進(jìn)行實(shí)時區(qū)域離子測試，而受到普遍的重視。理想的鋅離子熒光分子探針應(yīng)具有以下性質(zhì)化學(xué)-光穩(wěn)定性高、激發(fā)波長在可見光區(qū)(≥400nm)、對鋅離子熒光有選擇性和敏感性好、快速響應(yīng)、對細(xì)胞pH環(huán)境不敏感、脂溶性兼水溶性、對細(xì)胞毒害作用小。
目前存在能夠進(jìn)行細(xì)胞鋅離子檢測用熒光探針主要有以下兩類喹啉衍生物鋅離子熒光探針是一種開發(fā)比較早且適于細(xì)胞檢測的探針，6-甲氧基-8-對甲苯磺酰胺喹啉(TSQ)[Frederickson，C.J.；Kasarskis，E.J.；Ringo，D.；Frederickson，R.E.A quinoline fluorescence method for visualizing and assaying histochemicallyreactive zinc(bouton zinc)in the brain，J.Neurosci.Methods，1987，20，91-103.]是第一例用于大腦、心臟及其它組織切片中鋅離子濃度檢測的熒光分子探針。但這類探針激發(fā)波長處于紫外區(qū)(～350nm)，容易被生物本體自熒光干擾，并且短的激發(fā)波長還會對細(xì)胞產(chǎn)生傷害。因此這種探針的應(yīng)用受到了一定的限制。
熒光素衍生物鋅離子熒光探針是近年來發(fā)展比較多的一類探針，這類探針因?yàn)閾碛屑ぐl(fā)波長在可見區(qū)(～500nm)，量子產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)而受到重視。具有代表性的探針是zinpyr系列探針[Burdette，S.C.；Frederickson，C.J.；Bu，W.；Lippard，S.J.ZP4，an Improved Neuronal Zn2+Sensor of the Zinpyr Family，J.Am.Chem.Soc.，2003，125，1778-1787.]及ZnAF系列探針[Hirano，T.；Kikuchi，K.；Urano，Y.；Higuchi，T.；Nagano，T.Improvement and Biological Applications of FluorescentProbes for Zinc，ZnAFs，J.Am.Chem.Soc.，2002，124，6555-6562.]。這類探針最大的不足就是對pH變化比較敏感，pKa值6至9左右，這源于熒光素母體本身對pH的敏感性。這類探針在研究pH較小或者是pH變化較大環(huán)境中的鋅離子變化受到限制。另外存在的問題就是這類探針分子合成起來一般比較困難，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，大量工業(yè)化會有一定困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的改進(jìn)現(xiàn)有的細(xì)胞鋅離子熒光探針性能和結(jié)構(gòu)上的不足，設(shè)計合成出適用于細(xì)胞鋅離子檢測、性能優(yōu)良的基于氟硼熒光染料的探針分子作為研究目標(biāo)。
第一、本發(fā)明熒光探針分子激發(fā)和發(fā)射光譜在可見區(qū)，熒光量子產(chǎn)率高，對溶劑極性不敏感，并且化學(xué)—光穩(wěn)定性好。
第二、本發(fā)明熒光探針分子的設(shè)計基于分子內(nèi)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)原理，探針分子絡(luò)合鋅離子前后熒光量子產(chǎn)率至少有12倍的增長。熒光探針分子對鋅離子有很好的選擇性，鈉、鉀、鈣、鎂、錳、鐵等金屬離子對檢測沒有干擾。另外熒光探針分子對pH變化不敏感，pKa值2到3，在pH 4到10的范圍內(nèi)，pH變化對熒光發(fā)射沒有影響。
第三、本發(fā)明熒光探針分子與鋅離子之間的絡(luò)合常數(shù)在納摩范圍內(nèi)，可以檢測納摩爾濃度的細(xì)胞鋅離子。探針分子細(xì)胞滲透性好，對細(xì)胞本身沒有毒副作用，適于細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度變化的檢測。
氟硼染料作為優(yōu)良的熒光母體已經(jīng)被用來合成很多類型的探針，但是所有已經(jīng)存在的探針是借用中位為苯環(huán)的染料母體，然后再作相應(yīng)的衍生化，這樣后期合成就較為復(fù)雜。本發(fā)明避開常規(guī)，借用8位氯甲基的氟硼熒光染料，后期合成變得極為簡單。且連接基團(tuán)亞甲基比亞苯基短，借用PET原理時較中位苯環(huán)的氟硼染料體系更有效。
本發(fā)明細(xì)胞鋅離子檢測用的氟硼染料熒光探針具有下列結(jié)構(gòu)通式 通式中R1，R2，R3＝H或C1-12烷基。
本發(fā)明代表性的化合物顯示在下面的合成方案中，在本說明書的實(shí)施例中更詳細(xì)的說明了該探針的合成和分析檢測方法。
在常溫、惰性氣體保護(hù)下，氯乙酰氯與二當(dāng)量的吡咯在二氯甲烷中縮合，然后加入三乙胺和三氟化硼，室溫繼續(xù)反應(yīng)，得到8位氯甲基化的氟硼熒光染料中間體，經(jīng)柱分離得純品，然后該中間體與二(2-吡啶甲基)胺在四氫呋喃中反應(yīng)得到探針分子，最后經(jīng)過柱分離得到探針純品。
本發(fā)明的氟硼染料熒光探針使用方法沒有特殊的限制，通常，可以將探針分子溶解在生理鹽水、緩沖液或由乙醇、乙二醇、二甲基亞砜等水溶性有機(jī)溶劑，然后加入含有細(xì)胞組織的適當(dāng)緩沖液中進(jìn)行測試。
本發(fā)明的氟硼染料熒光探針的具體特征如下探針分子激發(fā)在490～500nm范圍內(nèi)，發(fā)射在505～515nm范圍內(nèi)，對溶劑極性不敏感，并且化學(xué)—光穩(wěn)定性好；探針分子絡(luò)合鋅離子前熒光量子產(chǎn)率低于0.1，絡(luò)合鋅離子后熒光量子產(chǎn)率高于0.5，鋅離子絡(luò)合前后量子產(chǎn)率至少有12倍的增長；探針分子對鋅離子有很好的選擇性，鈉、鉀、鈣、鎂、錳、鐵等金屬離子對檢測沒有干擾；探針分子對pH變化不敏感，pKa值2到3，在pH 4到10的范圍內(nèi)，pH變化對熒光發(fā)射沒有影響；探針分子與鋅離子之間的絡(luò)合常數(shù)在0.5～3納摩范圍內(nèi)，可以檢測納摩爾濃度的細(xì)胞鋅離子；探針分子細(xì)胞滲透性好，對細(xì)胞本身沒有毒副作用，適于細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度變化的檢測。


圖1是本發(fā)明的熒光探針分子3對鋅離子具有良好的選擇性。橫坐標(biāo)為各種離子，縱坐標(biāo)為加入金屬離子與未加金屬離子的探針分子溶液的熒光強(qiáng)度的比值。白色柱代表探針分子溶液加五倍過量的金屬離子；黑柱代表探針分子溶液加五倍過量的金屬離子和五倍過量鋅離子。
圖2是本發(fā)明的熒光探針分子3的熒光強(qiáng)度和鋅離子濃度的關(guān)系。橫坐標(biāo)為波長(nm)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。箭頭表示鋅離子的濃度變化從小到大依次為0，0.25，0.52，0.83，1.17，1.56，2.00，2.52，3.12，3.83，4.68，5.72，7.02，10.92到18.72nM，后幾個是加飽和鋅離子。
圖3是本發(fā)明的熒光探針分子3熒光強(qiáng)度與pH變化關(guān)系。橫坐標(biāo)為pH，縱坐標(biāo)為歸一化的熒光強(qiáng)度。
圖4是本發(fā)明的熒光探針分子3-鋅離子絡(luò)和物熒光強(qiáng)度與pH變化關(guān)系。橫坐標(biāo)為pH，縱坐標(biāo)為歸一化的熒光強(qiáng)度。
圖5是用本發(fā)明的熒光探針分子3研究小鼠的嗜鉻細(xì)胞(PC12)內(nèi)鋅離子濃度變化而產(chǎn)生的熒光變化的熒光顯微圖。5a是空白PC12細(xì)胞，5b是加1μM的ZnCl2，5c是加SNP后PC12細(xì)胞的熒光顯微成像圖。
研究探針對鋅離子選擇性一般的方法是將的探針分子分別加到五倍過量的特定金屬離子的緩沖液中，測量熒光強(qiáng)度的大小，結(jié)果與未加金屬離子的探針分子溶液比較。另外還要比較干擾離子存在下對鋅離子的選擇性，通常是將探針分子加到五倍過量的特定金屬離子與五倍過量的鋅離子混合的緩沖液中，測量熒光強(qiáng)度的大小，結(jié)果與僅加五倍過量鋅離子的探針分子溶液比較。
研究探針pH的響應(yīng)的一般方法是將探針分子加入離子強(qiáng)度為0.1的水溶液中，調(diào)節(jié)pH值為1.0左右，測定熒光強(qiáng)度后，加入堿液，使pH值緩慢增大，記錄相應(yīng)的熒光強(qiáng)度變化，以熒光變化對pH作圖。另外測定鋅離子—探針分子絡(luò)合物與pH的關(guān)系一般方法是將含五倍過量鋅離子的探針分子溶液中，調(diào)節(jié)pH值為1.0左右，測定熒光強(qiáng)度后，加入堿液，使pH值緩慢增大，記錄相應(yīng)的熒光強(qiáng)度變化，以熒光變化對pH作圖。
細(xì)胞內(nèi)鋅離子檢測的一般方法是將培養(yǎng)好的細(xì)胞放于含有探針分子的緩沖液中孵化，將一部分細(xì)胞用熒光顯微鏡成像得到空白圖像，然后將剩下的細(xì)胞一部分細(xì)胞放于硝普鈉鹽中一小時，另外一部分細(xì)胞浸入的ZnCl2溶液中，分別用培養(yǎng)液沖洗后，再進(jìn)行熒光顯微成像得到細(xì)胞內(nèi)鋅離子的分布圖像。
本發(fā)明涉及的探針分子具有極其重要的應(yīng)用價值。特別是該系列探針分子對pH變化極不敏感，響應(yīng)時間極短，測定靈敏度極其高，對細(xì)胞的滲透性和毒副作用小，使得這類探針作為正確測定生物體內(nèi)的鋅離子的快速濃度變化的試劑是極其有用的。另外該系列探針分子結(jié)構(gòu)簡單，每個步驟的合成效率高又使得極易大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1探針3的合成 (1)中間體2的合成1000ml三口燒瓶中，加入2.17克(19.4mmol)氯乙酰氯和3.7克1，4-二甲基吡咯溶于2L的二氯甲烷中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫攪拌5小時，混合溶液減壓蒸干到0.5L，然后加入40ml的三乙胺，再加入80ml的三氟化硼，混合液繼續(xù)攪拌4小時?；旌弦核?、干燥、蒸干。硅膠柱分離(16∶1正己烷∶乙酸乙酯)得到1.69克的中間體2。產(chǎn)率34％。1H-NMR(400MHz，CDCl3，ppm)δ2.53(s，12H)；4.78(s，2H)；6.08(s，2H).13C-NMR(400MHz，CDCl3，ppm)δ14.86，15.69，37.33，122.46，131.57，136.14，141.31，156.83.19F(400MHz，CDCl3，CFCl3asexternal reference，δ＝0)δ-146.73(q，J＝36Hz).Anal.Calcd for C14H16BClF2N2C，56.70；H，5.44；N，9.45.FoundC，56.81；H，5.51；N，9.50.Mp176-178℃.
(2)探針3的合成1克(3.4mmol)中間體2、0.34克(3.4mmol)二(2-吡啶甲基)胺、0.60克碘化鉀和0.55克碳酸鉀溶于500ml的四氫呋喃中，回流8小時?；旌先芤航?jīng)水洗，干燥，蒸干后，在氧化鋁柱上分離(100∶1二氯甲烷∶甲醇)得0.62克產(chǎn)品，產(chǎn)率45％。1H-NMR(400MHz，CDCl3，ppm)δ2.38(s，3H)；2.43(s，3H)；2.51(s，3H)；2.58(s，3H)；4.32(s，4H)；4.34(s，2H)；6.12(s，1H)；6.72(s，1H)；7.30(t，2H，J＝6.0Hz)；7.74-7.81(m，4H)；8.65(d，2H，J＝4.4Hz).13C-NMR(400MHz，CDCl3，ppm)δ14.67，16.63，17.55，17.74，29.88，30.52，51.98，60.95，119.86，122.09，122.76，132.57，133.32，138.85，140.55，142.01，152.33，154.95，155.24，159.69.19F(400MHz，CDCl3，CFCl3as external reference，δ＝0)δ-144.92(q，J＝36Hz).Anal.Calcd for C26H28BF2N5C，67.98；H，6.14；N，15.25.FoundC，68.12；H，6.22；N，15.34.Mp62-63℃.
實(shí)施例2探針3鋅離子選擇性使用上述合成的化合物3評價對鋅離子的選擇性。將1μM的化合物3加到五倍過量的各種金屬離子的pH 7.4的Tris-鹽酸緩沖液中(20mM)，探針3激發(fā)波長為492nm，發(fā)射波長為511nm，測試結(jié)果顯示于圖1中。圖中，對于縱軸的熒光強(qiáng)度，不添加金屬離子時的熒光強(qiáng)度設(shè)為1，用數(shù)值表示添加各種金屬離子時的熒光強(qiáng)度。從圖中可以看到，化合物3對鋅離子具有很高的靈敏性，鋅離子的加入產(chǎn)生很大的熒光增強(qiáng)，另外對鋅離子也有很好的選擇性，鈉、鉀、鈣、鎂、錳、鐵等金屬離子對檢測沒有干擾。
實(shí)施例3探針3對pH的不敏感性使用上述合成的化合物3評價對pH的響應(yīng)，對于化合物3在離子強(qiáng)度為0.1的水溶液中調(diào)節(jié)pH值為1.0左右，測定熒光強(qiáng)度后，加入堿液，使pH值緩慢增大，記錄相應(yīng)的熒光強(qiáng)度變化，測試結(jié)果顯示于圖3中。從圖中可以看出探針3有很低的pKa值，在pH 4到10的范圍內(nèi)，pH變化對熒光發(fā)射基本沒有影響。另外用同樣的方法測定1∶1鋅離子與化合物3絡(luò)合物對pH的響應(yīng)，測試結(jié)果顯示于圖3的插圖中。從圖中可以看出在pH 3到10的范圍內(nèi)，pH變化對熒光發(fā)射基本沒有影響。因此探針3可用于大pH范圍內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)鋅離子的檢測。
實(shí)施例4細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞由DEME(Invitrogen)培養(yǎng)液培養(yǎng)，成像的前一天，細(xì)胞放于平底表面皿中，成像時細(xì)胞放于含有5％二氧化碳和10μM的探針3緩沖液于37℃浸泡一小時。然后一部分細(xì)胞放于10mM硝普鈉鹽中一小時，另外一部分細(xì)胞浸入1μM的ZnCl2中，分別用DEME(Invitrogen)培養(yǎng)液沖洗后，進(jìn)行熒光顯微成像。
細(xì)胞內(nèi)鋅離子檢測利用熒光顯微成像技術(shù)，研究小鼠的嗜鉻細(xì)胞(PC12)內(nèi)鋅離子濃度變化對探針熒光強(qiáng)度的影響。經(jīng)過探針3標(biāo)記過的嗜鉻細(xì)胞，可以看到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有微弱的熒光(圖4a)，一般說來細(xì)胞核不會被標(biāo)記。當(dāng)外界加入鋅離子以后細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)都會觀察到很強(qiáng)的熒光(圖4b)。另外在同樣條件下，經(jīng)探針3標(biāo)記過的嗜鉻細(xì)胞加入硝普鈉鹽(SNP)后，也會觀察到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)有很強(qiáng)的熒光(圖4c)。因?yàn)镾NP是一種一氧化氮的釋放劑，進(jìn)而可以刺激細(xì)胞內(nèi)含有鋅離子的酶放出鋅離子，從而游離的鋅離子可以與3絡(luò)合發(fā)光。
權(quán)利要求
1.一類用于細(xì)胞鋅離子檢測用的氟硼染料熒光探針，其特征在于該氟硼染料熒光探針具有下列結(jié)構(gòu)通式 通式中R1，R2，R3＝H或C1-12烷基。
2.按照權(quán)利要求1所述的細(xì)胞鋅離子檢測用的氟硼染料熒光探針，其特征在于熒光探針分子激發(fā)在490～500nm范圍內(nèi)，發(fā)射在505～515nm范圍內(nèi)，對溶劑極性不敏感，并且化學(xué)-光穩(wěn)定性好。
3.按照權(quán)利要求1所述的細(xì)胞鋅離子檢測用的氟硼染料熒光探針，其特征在于探針分子絡(luò)合鋅離子前熒光量子產(chǎn)率低于0.1，絡(luò)合鋅離子后熒光量子產(chǎn)率高于0.5，鋅離子絡(luò)合前后量子產(chǎn)率至少有12倍的增長。
4.按照權(quán)利要求1所述的細(xì)胞鋅離子檢測用的氟硼染料熒光探針，其特征在于熒光探針分子對鋅離子有很好的選擇性，鈉、鉀、鈣、鎂、錳、鐵等金屬離子對檢測沒有干擾。
5.按照權(quán)利要求1所述的細(xì)胞鋅離子檢測用的氟硼染料熒光探針，其特征在于熒光探針分子對pH變化不敏感，pKa值2到3，在pH4到10的范圍內(nèi)，pH變化對熒光發(fā)射沒有影響。
6.按照權(quán)利要求1所述的細(xì)胞鋅離子檢測用的氟硼染料熒光探針，其特征在于熒光探針分子與鋅離子之間的絡(luò)合常數(shù)在0.5～3納摩范圍內(nèi)，可以檢測納摩爾濃度的細(xì)胞鋅離子。
7.按照權(quán)利要求1所述的細(xì)胞鋅離子檢測用的氟硼染料熒光探針，其特征在于熒光探針分子細(xì)胞滲透性好，對細(xì)胞本身沒有毒副作用，適于細(xì)胞內(nèi)鋅離子濃度變化的檢測。
全文摘要
本發(fā)明涉及一類新型基于分子內(nèi)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)原理的鋅離子熒光分子探針，該探針是通過一系列擁有8位氯甲基的氟硼熒光染料與二(2－吡啶甲基)胺簡單連接而成。激發(fā)和發(fā)射波長在可見區(qū)。探針分子本身具有良好的化學(xué)、光穩(wěn)定性。該系列探針具有很低的pK
文檔編號C09K11/00GK1715919SQ20051004687
公開日2006年1月4日 申請日期2005年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月12日
發(fā)明者彭孝軍, 吳云扣, 樊江莉, 王靜云, 郭斌臣, 崔愛軍, 田茂忠 申請人:大連理工大學(xué)