專利名稱：一種化學(xué)發(fā)光底物增強(qiáng)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是提供了一種化學(xué)發(fā)光底物增強(qiáng)劑。
背景技術(shù)：
化學(xué)發(fā)光免疫分析在過去十年來，以其高靈敏度和寬檢測范圍在臨床檢測中發(fā)揮了越來越多的作用(尹東光等，幾種主要化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的發(fā)光性能及其化學(xué)發(fā)光免疫分析體系，標(biāo)記免疫分析與臨床，2002，9225-230)。在發(fā)光免疫分析中，最常用的發(fā)光物質(zhì)包括魯米諾/異魯米諾，丫啶酯和環(huán)二氧乙烷衍生物(dioxetanes)等。魯米諾/異魯米諾及丫啶酯化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)均屬于閃光型發(fā)光，需要相對復(fù)雜的檢測儀器。這些系統(tǒng)具有很多優(yōu)點(diǎn)，但是與放免相比，它們的系統(tǒng)相對復(fù)雜。從技術(shù)上講，優(yōu)化十分困難，許多化學(xué)成分的使用都影響信噪比。而環(huán)二氧乙烷衍生物如AMPPD、CSPD和CDP-Star等系統(tǒng)的發(fā)光屬于輝光型，利用酶的催化反應(yīng)來引發(fā)發(fā)光，同時發(fā)光底物本身的化學(xué)結(jié)構(gòu)具有較好的熱力學(xué)穩(wěn)定性(Stephan Beck等，Perspectiveananlyticalbiotechnology，Anal.Chem.1990，622258-2270.)。因此，其使用受到越來越多的重視。
為了增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度，延遲發(fā)光時間，常在底物溶液中使用水溶性大分子如牛血清白蛋白(BSA)和表面活性劑(如CTAB、SDS等)。此外，還發(fā)現(xiàn)一些熒光素可以增強(qiáng)發(fā)光(1，2-Dioxetanesnovelchemiluminescent enzyme substrate.Applications to immunoassays，Journalof bioluminescence and chemiluminescence，1989，499-111.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種化學(xué)發(fā)光底物增強(qiáng)劑，一種新的CSPD底物增強(qiáng)劑溶液的配方，該增強(qiáng)劑可以溶解在底物溶液中起作用，也可以單獨(dú)配制，在反應(yīng)時與CSPD底物分別加入。在化學(xué)發(fā)光免疫分析中，CSPD底物增強(qiáng)劑溶液可以與堿性磷酸酶作用而發(fā)光，其發(fā)光強(qiáng)度與堿性磷酸酶的量成正比。
本發(fā)明的組分包括氯化十六烷三甲基銨(CTAC)，1，2肉蔻酰-Sn-甘油-3-磷酸二鈉鹽(DGPD)，牛血清白蛋白(BSA)，5’-18烷氨基熒光素。
本發(fā)明配方中CTAC的工作濃度范圍為4-10mg/L，DGPD的工作濃度范圍為1-30mg/L，BSA的工作濃度范圍為1-50g/L，5’-18烷氨基熒光素的工作濃度范圍為5-100mg/L。
本發(fā)明配方溶解的緩沖液為碳酸鹽緩沖液或二乙醇胺緩沖液，pH值范圍為9.0-10.0。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提供一種簡單的CSPD發(fā)光底物增強(qiáng)劑溶液的配方。此外，在使用本發(fā)明的增強(qiáng)劑溶液時，使用較低的CSPD底物的工作濃度可以較好的分析效果。
本發(fā)明的另一個優(yōu)點(diǎn)在于增強(qiáng)劑溶液的配方所有相關(guān)的化學(xué)試劑均可以從商業(yè)途徑采購，價格便宜。


圖1為本發(fā)明測量發(fā)光反應(yīng)的時間曲線。其中，橫坐標(biāo)為時間，縱坐標(biāo)為相對光強(qiáng)。
圖2為測量發(fā)光反應(yīng)的時間曲線，無增強(qiáng)劑。
圖3為本發(fā)明PRL劑量反應(yīng)曲線，其中，橫坐標(biāo)為濃度，縱坐標(biāo)為相對發(fā)光強(qiáng)度。
具體實施例方式
實施例1 增強(qiáng)劑溶液的配制1.06g二乙醇胺，溶解在80ml的去離子水中調(diào)pH至9.5，加入0.02g MgCl2，0.4mg CTAC，0.2mg DGPD，0.5g BSA和1.2mg 5’-18烷氨基熒光素，攪拌使其溶解，定容100ml。使用0.2um過濾器過濾溶液，于4℃貯存。使用時，用增強(qiáng)劑溶液稀釋底物至0.10mM。
增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)的時間曲線使用2.96×10-15摩爾的堿性磷酸酶，加入200ul的底物增強(qiáng)劑工作液，混勻后，室溫反應(yīng)，使用BPCL發(fā)光測定儀(中科院生物物理所研制)測量發(fā)光反應(yīng)的時間曲線(見圖1)。
使用二乙醇胺溶液稀釋的底物溶液作為對照溶液，該溶液與堿性磷酸酶的發(fā)光反應(yīng)的時間曲線見圖2。
實施例2 人催乳素(PRL)化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑磁分離試劑包被羊抗異硫氰酸熒光素的磁珠，直徑1um，工作濃度6mg/ml；PRL單抗-異硫氰酸熒光素工作液0.75ug/ml；PRL單抗-堿性磷酸酶工作液1.0ug/ml；PRL標(biāo)準(zhǔn)品0，40，200，500，2000和5000uIU/ml；以上試劑由北京倍愛康生物技術(shù)股份有限公司提供。
清洗液氯化鈉(NaCl)2g，磷酸二氫鈉(NaH2PO4.12H2O)2.9g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.2g，氯化鉀(KCl)0.2g，曲拉通X-1000.5ml，吐溫200.2ml，布蘭尼道克斯(Bronidox-L)5g，用純化水配成1000ml，用0.2μm過濾器過濾，于室溫保存。
發(fā)光底物增強(qiáng)劑溶液配制0.05mmol/l，pH9.8碳酸鹽緩沖液100ml。取80ml加入0.02g MgCl2，0.5mg CTAC，1.0mg DGPD，1.0g BSA和1.0mg 5’-18烷氨基熒光素，攪拌使其溶解，定容100ml。使用0.2um過濾器過濾溶液，于4℃貯存。使用時，用增強(qiáng)劑溶液稀釋CSPD底物原液至0.06mM。
操作步驟1、加樣與免疫反應(yīng)在平底試管中加入15μl標(biāo)準(zhǔn)品，30μl PRL單抗-異硫氰酸熒光素工作液，PRL單抗-堿性磷酸酶工作液，以及60μl10mg/ml磁分離試劑，混勻后，37℃溫育30分鐘。
2、洗滌將平底試管放在磁分離器上分離2分鐘，然后用一大而緩慢的圓周運(yùn)動倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除去掛壁液體。每管中加入清洗液150μl，充分混勻后，將平底試管放在磁分離器上分離2分鐘，然后用一大而緩慢的圓周運(yùn)動倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，把倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上，拍擊分離器以除去掛壁液體。重復(fù)兩次。
3、加入200μl發(fā)光底物增強(qiáng)劑溶液，室溫下震蕩反應(yīng)15分鐘。
4、在BPCL化學(xué)發(fā)光測定儀上讀取發(fā)光值，并進(jìn)行曲線擬合。
結(jié)果見圖3。
權(quán)利要求
1.一種化學(xué)發(fā)光底物增強(qiáng)劑，其特征在于組分包括氯化十六烷三甲基銨CTAC，1，2肉蔻酰-Sn-甘油-3-磷酸二鈉鹽DGPD，牛血清白蛋白BSA，5’-18烷氨基熒光素；各組分的工作濃度范圍為CTAC為4-10mg/L，DGPD為1-30mg/L，BSA為1-50g/L，5’-18烷氨基熒光素為5-100mg/L。
2.按照權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光底物增強(qiáng)劑，其特征在于化學(xué)發(fā)光底物增強(qiáng)劑溶解的緩沖液為碳酸鹽緩沖液或二乙醇胺緩沖液，pH值范圍為9.0-10.0。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種化學(xué)發(fā)光底物增強(qiáng)劑，屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。其組分包括氯化十六烷三甲基銨CTAC，1，2肉蔻酰－Sn－甘油－3－磷酸二鈉鹽DGPD，牛血清白蛋白BSA，5’－18烷氨基熒光素；各組分的工作濃度范圍為CTAC為4－10mg/L，DGPD為1－30mg/L，BSA為1－50g/L，5’－18烷氨基熒光素為5－100mg/L。該增強(qiáng)劑可以溶解在底物溶液中起作用，也可以單獨(dú)配制，在反應(yīng)時與CSPD底物分別加入?；瘜W(xué)發(fā)光底物增強(qiáng)劑溶解的緩沖液為碳酸鹽緩沖液或二乙醇胺緩沖液，pH值范圍為9.0－10.0。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于使用較低的CSPD底物的工作濃度可以較好的分析效果。并且增強(qiáng)劑溶液的配方所有相關(guān)的化學(xué)試劑均可以從商業(yè)途徑采購，價格便宜。
文檔編號C09K11/00GK1719254SQ200510083929
公開日2006年1月11日 申請日期2005年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月15日
發(fā)明者劉振世, 王法龍, 周昊, 王東, 張波, 陳海生, 謝晶, 胡曉焱, 張小平, 孫海濤, 黃建梅, 吳丹民, 張玉慶 申請人:武漢賽文生物技術(shù)有限公司