專利名稱：一種紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生產橙色素的方法
技術領域：
一種紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生產橙色素的方法，屬于生物工程和色素制備技術領域。
背景技術：
紅曲色素目前已確定結構的六種成分為橙色素(紅斑紅曲素、紅曲玉紅素)、黃色素(紅曲素、黃紅曲素)、紫色素(紅斑紅曲胺和紅曲玉紅胺)。其研究已經(jīng)較為成熟，其在食品上的應用多是利用紅曲色素中的紅色素作為著色劑，是一種混合色素。
在紅曲色素的混合色素中，橙色素是一種最為鮮艷奪目的色素。如果用于食品或其它需要著色的產品，可以為其增加一種可供選擇的鮮艷色調。而且宮慧梅及L.Martinkova等都提到橙色素具有一定的抑菌性，能夠抑制革蘭氏陽性菌以及大腸桿菌，其原理被認為可能是紅曲色素與蛋白質類物質結合在一起，以至于使蛋白質變性，抑制細菌生長起到防腐等作用。因此它是紅曲中一種主要的抑菌物質，其抑菌性與吸光度呈正相變化。另外，Carels和Shepherp認為紅色素、黃色素都是由橙色素經(jīng)化學氧化而得來的，即橙色素是紅曲色素合成中的一個重要中間體。
橙色素是紅曲色素生物合成途徑中的一個中間成分，性質比較活潑，易被氧化或還原而成黃色素或紅色素。作為一種橙色調的紅曲色素，目前在國內外僅限于小樣生產，均未實現(xiàn)大規(guī)模生產，在食品及其它領域的應用上也未得到充分的開發(fā)研究，但因其顏色較為獨特、醒目，在著色劑行業(yè)應用前景廣闊，是值得開發(fā)的紅曲色素品種。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是為了尋找一種高效生產紅曲橙色素且可以大批量生產的方法。主要工藝路線利用紅曲菌，通過深層通風發(fā)酵改變培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件生產出以橙色調(紅斑紅曲素或紅曲玉紅素)為主的紅曲色素。
本發(fā)明技術方案采用紅曲橙色素的液態(tài)深層發(fā)酵及噴霧干燥方法。
(1)菌種以紅曲霉菌(Monascus spp.)9903為出發(fā)菌種，該菌種已在“食品與生物技術”第21卷第1期P43-47，2002年1月公開，由江南大學生物工程學院提供。
(2)培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基土豆培養(yǎng)基。
基礎發(fā)酵培養(yǎng)基KH2PO4，1～5g/L；K2HPO4，1～5g/L；MgSO4·7H2O，0.2～0.8g/L；CaCl2，0.05～0.2g/L；FeSO4·7H2O，0.005～0.02g/L；ZnSO4·7H2O，0.005～0.02g/L；MnSO4·H2O，0.015～0.06g/L，NaNO3，1～4g/L，pH3.0～6.0。
(3)搖瓶發(fā)酵條件培養(yǎng)基基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中加入玉米淀粉40～80g/L作為碳源，硫酸銨2～6g/L作為氮源，初始pH3.0～6.0，裝液量100mL/500mL三角瓶，培養(yǎng)基經(jīng)過糊化后進行接種，接種量孢子懸浮液4mL，30℃往復式搖床，行程10cm，振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵時間3.5～5.5天。
(4)15L發(fā)酵罐發(fā)酵通風量20～40L/min，培養(yǎng)溫度28～32℃，轉速200～400r/min，接種量5％，培養(yǎng)90～120小時，培養(yǎng)基同搖瓶發(fā)酵所用培養(yǎng)基，并在使用前進行糊化，發(fā)酵罐的有效裝液量為10L，底液量為7L，在發(fā)酵過程中再流加糊化的培養(yǎng)基，發(fā)酵18小時開始流加操作，流加速度為0.03L/h。
最佳的發(fā)酵條件為搖瓶發(fā)酵和15L發(fā)酵罐發(fā)酵所用培養(yǎng)基為基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中加入玉米淀粉40g/L作為碳源，硫酸銨2g/L作為氮源，初始pH6.0；搖瓶發(fā)酵時間為4.0天，15L發(fā)酵罐發(fā)酵時間為108小時。
(5)噴霧干燥發(fā)酵液進行高壓均質，壓力為3kgf/cm2，或膠體磨將菌體破碎后，加入助干燥劑糊精，加入糊精的量為糊精發(fā)酵液以Kg/L計為0.02～0.06，進風溫度170～200℃，出口溫度70～100℃，噴頭壓力1～4kgf/cm2，流速1.5～3.0L/h，噴霧干燥得到粉末狀橙色素產品(I)。
或(6)將步驟(4)所得發(fā)酵液進行精制發(fā)酵液經(jīng)超聲波破碎或高壓均質后將細胞破碎，釋放出胞內的色素，5000r/min、20min高速離心得菌絲體，用甲醇或乙醇進行萃取，萃取3次至溶液無明顯橙色，過濾后合并濾液，加入助干燥劑糊精，加入糊精的量為糊精發(fā)酵液以Kg/L計為0.02～0.06，進行噴霧干燥，噴霧干燥條件同步驟(5)，得色調高一些的粉末狀橙色素產品(II)。
或萃取后的合并濾液繼續(xù)進行板層析分離，選用G-60型硅膠作為板層析介質真空濃縮至橙色素色價為3000～4500U/mL，濃縮液用于第一次板層析，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1，刮下顯橙色的譜帶Rf＝0.7941，再用甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速離心，上清液旋轉濃縮至橙色素色價3000～4500U/mL，濃縮液用于第二次板層析，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝8∶2∶1，刮下顯橙色譜帶Rf＝0.7458，甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速離心，上清液濃縮得橙色素針狀結晶(III)。
或萃取后的合并濾液繼續(xù)進行柱層析分離，選用青島產硅膠作為柱層析介質柱子型號為28mm×500mm，最大上樣量為色價在3000～4500U/mL的橙色素濃縮液4～8mL，流動相為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1，流速控制在0.5～1.5mL/min之間，收集顯橙色的流出液，流出液旋轉濃縮至橙色素色價3000～4500U/mL，濃縮液用于板層析，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝8∶2∶1，刮下顯橙色譜帶Rf＝0.7458，甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速離心，上清液濃縮得橙色素針狀結晶(III)。
橙色素精制工藝中用溶劑浸提，食品行業(yè)用的橙色素產品均用乙醇進行浸提，化工及其它行業(yè)使用的橙色素產品用甲醇進行浸提。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用一株高產色素的紅曲菌9903，為生產以橙色素為主的紅曲色素，并提高橙色素含量進行了發(fā)酵條件優(yōu)化及液態(tài)發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化，以期為以后橙色素的大規(guī)模工業(yè)化生產及在食品色素開發(fā)應用上做基礎工作。另外，對橙色素的噴霧干燥工藝及其精制也進行了研究，得到了較純的橙色素，希望為其開拓更為廣泛的用途，如應用于飲料、化妝品(如口紅)等產品中。
紅曲高產橙色素的搖瓶實驗，確定出高產橙色素的菌種及以無機氮源為唯一氮源的培養(yǎng)基配方；紅曲橙色素的液態(tài)深層發(fā)酵，確定出工業(yè)化生產紅曲橙色素的操作工藝參數(shù)；一步法噴霧干燥的紅曲橙色素產品的制備參數(shù)指標液態(tài)發(fā)酵生產紅曲橙色素的色價(15L罐)三罐平均穩(wěn)定達到100U/mL以上，發(fā)酵液經(jīng)噴霧干燥后所得產品色價為1000U/g，色調OD465nm/OD510nm大于1。
在15L的發(fā)酵罐中發(fā)酵液色價達到121.7U/mL，色調值達到1.13；經(jīng)不同精制途徑得到不同色價及色調的橙色素產品，直接噴霧干燥得到的橙色素產品(I)色價達到1030.75U/g，色調值達到1.99；經(jīng)過萃取而后噴霧干燥的橙色素產品(II)色價高達2000U/g以上，色調高達2.45；產品(III)得到了純的橙色素針狀結晶。


圖1橙色素產品(III)全波長掃描圖。
圖2橙色素產品(III)的液相色譜圖。
圖3橙色素產品(III)的質譜圖。
具體實施例方式
實施例1.培養(yǎng)基優(yōu)化碳源對產橙色素的影響選擇葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、糯米粉、麥芽糖和糊精為碳源進行實驗。碳源濃度50g/L，培養(yǎng)基的其他配比見基礎發(fā)酵培養(yǎng)基。在以玉米淀粉作為9903菌種發(fā)酵的碳源時，橙色素色價及菌體量均遠遠高于采用其他碳源時，說明玉米淀粉很可能不僅僅對菌體的生長作貢獻，更重要的是對橙色素這個次級代謝產物的合成起到積極的作用，玉米淀粉的這種影響可能是玉米淀粉的成分較復雜，而所含的無機或有機成分也較多，對紅曲霉而言營養(yǎng)成分更加齊全，因而更有利于橙色素的次級代謝產物的生成。由此確定，玉米淀粉為最佳產橙色素碳源。糯米粉中則因可能含有有機氮源，致使一部分所生成的橙色素與氨基酸結合生成紅色素。
培養(yǎng)基中不同濃度的玉米淀粉對紅曲霉9903產橙色素的影響，分別選取了20，40，60，80g/L五個濃度水平，另外嘗試玉米淀粉與葡萄糖的不同配比。通過考慮橙色素色價的高低及色調，最終選用濃度為40～80g/L的玉米淀粉作為培養(yǎng)基的碳源。
氮源對產橙色素的影響實驗結果表明，不同氮源對橙色素產量的影響因氮源種類不同而不同，色澤也有很大差異。在實驗的8種氮源中，四種有機氮源(蛋白胨、味精、玉米漿、酵母膏)產橙色素色價幾乎都低于使用四種無機氮源(硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、硝酸鈉)時產橙色素，且顏色均顯紅色，色調(OD465nm/OD510nm)均小于1。而使用無機氮源時，硝酸銨和硝酸鈉的色價相對于硫酸銨和氯化銨又較低，且其色調小于1。使用硫酸銨時不僅色價遠遠高于其它氮源，而且色調也相對較高，達到1.68，因此選其作為產橙色素氮源。同時又進一步確定了產橙色素最高時的硫酸銨濃度為2～6g/L。
使用有機氮源時，橙色素色價低，主要原因是有機氮源中含較多的其它氨基酸，這會與所生成的橙色素進一步合成為紅色素，使橙色素減少。
硫酸銨作氮源，色價值高的原因主要是銨離子被利用后，硫酸根離子存在于發(fā)酵液中，可使發(fā)酵液保持在酸性。這種酸性可使紅曲菌處于更佳的生理狀態(tài)。
培養(yǎng)基初始pH對產橙色素的影響紅曲菌的發(fā)酵過程中，發(fā)酵液大多數(shù)時間是處于酸性范圍內，因此在弱酸性的培養(yǎng)基初始條件下，比較易于菌體的生長，產橙色素色價也相對較高，隨著pH值升高，橙色素色價逐漸下降。色調則隨pH值升高而一直呈下降趨勢。根據(jù)實驗結果確定培養(yǎng)基的初始pH為3.0～6.0。
不同取樣時間對產橙色素的影響在以上試驗的基礎上測定紅曲菌9903產橙色素的生長曲線，我們可以看出在3天前橙色素產量隨時間增長而快速增長，在3～5.5天左右處于平穩(wěn)生產期，在5.5天之后就有急劇下降，由此可以看出橙色素應屬于紅曲菌9903的一個次級代謝中間產物，因此我們將取樣時間取在3～5.5天之間的中間，取3.5～4.5天。
培養(yǎng)基成分的四因素三水平正交實驗選擇碳源、氮源、起始pH、發(fā)酵時間為考察因素，其余成分同基礎發(fā)酵培養(yǎng)基?？疾熘笜藶?65nm所測色價即橙色素色價。因素及水平的安排見表1，實驗方案和結果見表2。
表1 因素水平表

表2 正交實驗結果


比較四種因素的極差R，C的極差最大，其次是B、D，A的極差最小，說明培養(yǎng)基起始pH對紅曲菌9903產橙色素能力影響最大，其次是添加氮源濃度及發(fā)酵時間，而添加碳源濃度在實驗中的變化范圍內的影響不明顯。根據(jù)實驗的結果，選擇最佳因素水平為A1B1C3D2，即玉米淀粉40g/L，硫酸銨2g/L，起始pH值為6.0，發(fā)酵時間為4.0天，以此作為本發(fā)明的最佳培養(yǎng)基配方。
實施例2.發(fā)酵條件的優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化采用實施例1正交實驗所得的最佳培養(yǎng)基配方，進行了15L發(fā)酵罐深層培養(yǎng)操作條件的優(yōu)化。紅曲液態(tài)發(fā)酵是好氧發(fā)酵，因此溶氧水平是個重要的參數(shù)，它直接影響發(fā)酵產物尤其是次級代謝產物橙色素的產量。通過改變通風量與攪拌轉速形成高、低兩種不同水平的溶氧條件，考察紅曲霉在這兩種不同的溶氧條件下產橙色素的情況，結果發(fā)現(xiàn)低溶氧情況下，產橙色素的最高峰時間明顯滯后于高溶氧情況下，橙色素的最終產量也明顯低。可見溶氧對紅曲發(fā)酵產橙色素的影響是較大的。在實驗的基礎上最終確定出紅曲霉9903液態(tài)發(fā)酵產橙色素的最佳操作工藝條件為通風量20～40L/min，培養(yǎng)溫度28～32℃，轉速200～400r/min，接種量5％，培養(yǎng)90～120小時。
液態(tài)分批發(fā)酵紅曲霉在15L液態(tài)發(fā)酵罐中的生長過程大致可以分為3個階段生長停滯期(0～18h)，在這個階段菌體量、橙色素色價、桔霉素含量都基本沒有增長；第二個階段(18～108h)，菌體量迅速增加，同時橙色素產量也伴隨著菌體生長迅速提高，而桔霉素則開始增長極緩慢(18～90h)，而后又迅速增長(90～108h)；最后一個階段(108～120h)，菌體的干重幾乎沒怎么增加，而橙色素產量卻有一定程度的降低，色調也隨之有些降低。
可見，在前期橙色素的產生與菌體生長基本同步，而桔霉素含量則沒什么太大變化，說明橙色素的生產與菌體的生長有一定的偶聯(lián)。但在后期，橙色素含量降低時桔霉素含量卻迅速增長，原因可能是前期桔霉素合成的有關酶基因開始啟動，或經(jīng)過一定時間的桔霉素前體物合成并積累后，桔霉素分子的構成單元才開始組裝成桔霉素分子，而橙色素生長則是與菌體生長相偶聯(lián)的，到菌體快速生長期時，橙色素也大量合成。另外后期橙色素的減少以及色調值的降低，原因可能是橙色素與培養(yǎng)基中的氨基酸進行了反應，生成了水溶性的紅色素。
液態(tài)流加發(fā)酵，流加糊化的玉米淀粉對橙色素產量的影響流加技術可以消除底物和產物抑制作用。因此我們嘗試了流加糊化的培養(yǎng)基的方法，以期可以提高橙色素產量。在以上實驗的基礎上，采用有效裝液量為10L的發(fā)酵罐，底液量為7L，發(fā)酵18h時開始進行流加操作，流加速度為0.03L/h，在此操作條件下，最終橙色素產量比間歇發(fā)酵提高了18％，可見，利用流加發(fā)酵液可以克服初始營養(yǎng)濃度過高而引起的對菌體生長及橙色素生長的抑制，從而有效地提高橙色素生成量和原料利用率。最終發(fā)酵液的橙色素色價三罐平均穩(wěn)定達到121.7U/mL，色調值達到1.13。
實施例3.橙色素的提取和精制橙色素的直接噴霧干燥法生產經(jīng)過實驗研究確定出橙色素發(fā)酵液直接進行噴霧干燥時的操作工藝參數(shù)條件發(fā)酵液進行高壓均質，壓力為3kgf/cm2，或膠體磨將菌體破碎后，加入助干燥劑糊精，加入糊精的量為糊精∶發(fā)酵液以Kg/L計為0.02～0.06，進風溫度170～200℃，出口溫度70～100℃，噴頭壓力1～4kgf/cm2，流速80～120mL/h。在此操作條件下最終得到橙色素產品(I)，其色價為1030.75U/g，色調為1.99，色素得率達到66.67％。
橙色素的濃縮結晶和噴霧干燥。
不同萃取劑提取紅曲橙色素的效果比較分別量取一定體積的橙色素發(fā)酵液，進行超聲波破碎或其它菌體破碎方法，如均質機、膠體磨等后，5000r/min、20min高速離心得菌絲體，分別用15mL正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、甲苯、丙酮、甲醇、乙醇或甲酸進行萃取。2h后進行冷凍離心，移取上清液進行適當稀釋后用于紫外分光光度計在300～600nm內掃描，測其在410nm、465nm和510nm處的色價，結果發(fā)現(xiàn)使用乙酸時對橙色素的提取效率最好，色價高達3240.625U/g，但是在往色素樣品中加入萃取劑時發(fā)現(xiàn)有放熱現(xiàn)象，說明乙酸有可能與色素發(fā)生了反應，因此很難保證測得的色價就是自然的橙色素的含量。在使用正己烷或環(huán)己烷進行萃取時，萃取相中以黃色素和橙色素為主，紅色素幾乎沒有，因此如果從考慮將色素分離的角度來看，環(huán)己烷或正己烷是比較理想的選擇，但二者對橙色素的提取率相對較低。使用乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷時，橙色素的提取率相對較高，但同時黃色素的提取率也很高，尤其是乙酸乙酯。而使用甲醇和乙醇時，不僅橙色素的提取率很高，而且黃色素的提取率極低，這樣對分離很有利，因此我們選用甲醇或乙醇作為提取橙色素的最佳萃取劑，這要看最終的橙色素產品的使用領域了，如果是用在食品行業(yè)，則選擇無毒的乙醇作為萃取劑，若是應用于化工及其它行業(yè)則選用甲醇作為萃取劑，因為相對于乙醇，甲醇對橙色素的萃取率及最終萃取的色價都很高。最終用有機溶劑萃取之后的橙色素產品(II)進行噴霧干燥后，橙色素色價達2000U/g以上，色調值達2.45。
第一次板層析所用硅膠及展開劑的選擇實驗發(fā)現(xiàn)使用硅膠進行板層析的效果較好，而對不同規(guī)格的硅膠進行比較，國產青島的硅膠效果極好，因此我們選定了山東青島海洋化工集團的G-60型硅膠作為本專利研究的板層析介質。對于展開劑的選擇首先考慮的是將紅曲萃取液中的大部分色素與橙色素分離開來，在實驗的基礎上，我們選擇了以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1為展開劑，對紅曲色素進行一個初步分離，最終得到Rf＝0.7941的橙色譜帶。
第二次板層析所用展開劑的選擇由第一次板層析的結果可以看出紅曲色素是種混合色素，只在普通光照下就可以看到18種，而在紫外線下又可以看到很多普通光照下看不到的熒光物質。橙色素與紅色素可以完全分離，但與黃色素相鄰很近，有部分重疊，需進一步分離。因此我們進行了第二次板層析，對于所使用的不同展開劑來說，采用環(huán)己烷∶氯仿∶異丙醇(6∶4∶3)時色素不能分開，反而對色素具有一定的分散作用。使用甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸(8∶2∶1)是分離效果最好，總共分離出8條色帶，最終得Rf＝0.7458的橙色素譜帶，按精制流程最終得到了純的橙色素產品(III)，用于下一步的質譜鑒定用。
柱層析分離橙色素方法的確定柱層析硅膠選用青島產的工業(yè)級的柱層析硅膠，柱子型號為28mm×500mm，最大上樣量為色價在3000～4500U/mL的橙色素濃縮液4～8mL，流動相為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1，流速控制在0.5～1.5mL/min之間，收集顯橙色的流出液，流出液旋轉濃縮至橙色素色價3000～4500U/mL，濃縮液用于板層析，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝8∶2∶1，刮下顯橙色譜帶Rf＝0.7458，甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速離心，上清液濃縮得橙色素針狀結晶(III)。此法與板層析方法相比，處理量大，且方法簡單，易于工業(yè)化生產。
橙色素產品(III)的質譜鑒定將橙色素晶體用甲醇溶解，適當稀釋后用于紫外分光光度計在300～600nm內掃描，掃描如圖1所示，得橙色素的最大吸收波長為465nm。
我們用質譜檢驗的方法對所制得的橙色素進行了定性檢測。圖2為橙色素液相色譜圖，由圖知目標物質可能為16.86min時出的峰，其正離子模式質譜圖如圖3所示，由圖3可清晰看出M+Na(分子量為377.6)和M+H(分子量為355.6)的準分子離子峰，確定其分子量為354D，與文獻上報道的紅斑紅曲素的分子量相同，其峰為單一組分。另外由圖2還可以看出，制備的橙色素產品中主要成分確實為紅斑紅曲素，從峰面積歸一化計，紅斑紅曲素占了樣品總量的85.93％。因此可以認為是比較純的，可以用于其性質等研究。
權利要求
1.一種紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生產以橙色素為主的紅曲色素，并提高橙色素含量及色調OD465nm/OD510nm的方法，其特征是采用紅曲橙色素的液態(tài)深層發(fā)酵及噴霧干燥方法，(1)菌種以紅曲霉菌(Monascus spp.)9903為出發(fā)菌種，(2)培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基土豆培養(yǎng)基，基礎發(fā)酵培養(yǎng)基KH2PO4，1～5g/L；K2HPO4，1～5g/L；MgSO4·7H2O，0.2～0.8g/L；CaCl2，0.05～0.2g/L；FeSO4·7H2O，0.005～0.02g/L；ZnSO4·7H2O，0.005～0.02g/L；MnSO4·H2O，0.015～0.06g/L，NaNO3，1～4g/L，pH3.0～6.0，(3)搖瓶發(fā)酵條件培養(yǎng)基基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中加入玉米淀粉40～80g/L作為碳源，硫酸銨2～6g/L作為氮源，初始pH3.0～6.0，裝液量100mL/500mL三角瓶，培養(yǎng)基經(jīng)過糊化后進行接種，接種量孢子懸浮液4mL，30℃往復式搖床，行程10cm，振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵時間3.5～5.5天，(4)15L發(fā)酵罐發(fā)酵通風量20～40L/min，培養(yǎng)溫度28～32℃，轉速200～400r/min，接種量5％，培養(yǎng)90～120小時，培養(yǎng)基同搖瓶發(fā)酵所用培養(yǎng)基，并在使用前進行糊化，發(fā)酵罐的有效裝液量為10L，底液量為7L，在發(fā)酵過程中再流加糊化的培養(yǎng)基，發(fā)酵18小時開始流加操作，流加速度為0.03L/h，(5)噴霧干燥發(fā)酵液進行高壓均質，壓力為3kgf/cm2，或膠體磨將菌體破碎后，加入助干燥劑糊精，加入糊精的量為糊精發(fā)酵液以Kg/L計為0.02～0.06，進風溫度170～200℃，出口溫度70～100℃，噴頭壓力1～4kgf/cm2，流速1.5～3L/h，噴霧干燥得到粉末狀橙色素產品(I)，或(6)將步驟(4)所得發(fā)酵液進行精制發(fā)酵液經(jīng)超聲波破碎或高壓均質后將細胞破碎，釋放出胞內的色素，5000r/min，20min高速離心得菌絲體，用甲醇或乙醇進行萃取，萃取3次至溶液無明顯橙色，過濾后合并濾液，加入助干燥劑糊精，加入糊精的量為糊精發(fā)酵液以Kg/L計為0.02～0.06，進行噴霧干燥，噴霧干燥條件同步驟(5)，得色調高一些的粉末狀橙色素產品(II)，或萃取后的合并濾液繼續(xù)進行板層析分離，選用G-60型硅膠作為板層析介質真空濃縮至橙色素色價為3000～4500U/mL，濃縮液用于第一次板層析，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1，刮下顯橙色的譜帶Rf＝0.7941，再用甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速離心，上清液旋轉濃縮至橙色素色價3000～4500U/mL，濃縮液用于第二次板層析，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝8∶2∶1，刮下顯橙色譜帶Rf＝0.7458，甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速離心，上清液濃縮得橙色素針狀結晶(III)，或萃取后的合并濾液繼續(xù)進行柱層析分離，選用青島產硅膠作為柱層析介質柱子型號為28mm×500mm，最大上樣量為色價在3000～4500U/mL的橙色素濃縮液4～8mL，流動相為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7∶3∶1，流速控制在0.5～1.5mL/min之間，收集顯橙色的流出液，流出液旋轉濃縮至橙色素色價3000～4500U/mL，濃縮液用于板層析，展開劑為甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝8∶2∶1，刮下顯橙色譜帶Rf＝-0.7458，甲醇或乙醇浸提3次，5000r/min、20min高速離心，上清液濃縮得橙色素針狀結晶(III)。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是搖瓶發(fā)酵和15L發(fā)酵罐發(fā)酵所用培養(yǎng)基為基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中加入玉米淀粉40g/L作為碳源，硫酸銨2g/L作為氮源，初始pH6.0；搖瓶發(fā)酵時間為4.0天，15L發(fā)酵罐發(fā)酵時間為108小時。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是所述橙色素精制工藝中用溶劑浸提，食品行業(yè)用的橙色素產品用乙醇進行浸提，化工及其它行業(yè)使用的橙色素產品用甲醇進行浸提。
全文摘要
紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生產橙色素的方法，屬于生物工程和色素制備技術領域。本發(fā)明以一株高產色素紅曲霉菌9903為出發(fā)菌株，生產以橙色素為主的紅曲色素，并提高橙色素含量及色調(OD
文檔編號C09B61/00GK1814783SQ20051009576
公開日2006年8月9日 申請日期2005年11月16日 優(yōu)先權日2005年11月16日
發(fā)明者許贛榮, 張慧娟 申請人:江南大學