專(zhuān)利名稱(chēng)：一種葉酸－殼聚寡糖－花菁熒光染料生物探針及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高靈敏度葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針及制備方法，屬于化學(xué)及生物化學(xué)技術(shù)交叉學(xué)科領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
癌癥現(xiàn)已成為威脅人類(lèi)健康的第一殺手，如何有效地控制其發(fā)生和發(fā)展乃至于實(shí)現(xiàn)早期識(shí)別已成為當(dāng)務(wù)之急。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，對(duì)癌癥的早期診斷及有效識(shí)別可以極大地提高治療效果。癌細(xì)胞的大小形態(tài)不一，通常癌細(xì)胞比正常細(xì)胞體積要大，核質(zhì)比顯著高于正常細(xì)胞；癌細(xì)胞的代謝旺盛，癌細(xì)胞組織的DNA和RNA聚合酶活性均高于正常細(xì)胞，核酸分解過(guò)程明顯低于正常細(xì)胞，DNA和RNA的含量較高。其次葉酸受體在大部分惡性腫瘤組織表面高度表達(dá)，如乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌、肺癌等，而在正常細(xì)胞中表達(dá)高度保守。
傳統(tǒng)的癌細(xì)胞識(shí)別和診斷主要通過(guò)癌胚蛋白檢測(cè)，酶類(lèi)標(biāo)志物，腫瘤抗原檢測(cè)，血漿蛋白檢測(cè)和同位素檢測(cè)法來(lái)確定。但這些方法均存在效率低、識(shí)別率低等缺點(diǎn)。近年來(lái)，隨著分子生物標(biāo)記技術(shù)不斷發(fā)展，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域尤其是在惡性腫瘤細(xì)胞的早期識(shí)別和診斷方面逐漸受到人們的關(guān)注。
采用生物熒光染料探針在生物領(lǐng)域的相關(guān)檢測(cè)方法和技術(shù)，文獻(xiàn)上已有報(bào)道，它與傳統(tǒng)的同位素檢測(cè)相比具有速度快、重復(fù)性好、用樣量少及無(wú)輻射等特點(diǎn)。目前用于細(xì)胞標(biāo)記的生物熒光染料探針主要有吖啶、菲啶類(lèi)，熒光素類(lèi)，二氟烷硼類(lèi)，二苯乙烯類(lèi)、萘酰亞胺類(lèi)、菁染料類(lèi)等。但除菁染料類(lèi)外，其它的染料自身都會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)的熒光背景干擾。
2005年1月的《Bioconjugate Chem》上報(bào)道了一種用葉酸修飾過(guò)的花菁染料作為生物熒光染料探針檢測(cè)癌細(xì)胞的方法。
作為生物熒光染料探針，如何提高染料的水溶性，在增大其靈敏度的同時(shí)提高其光穩(wěn)定性，并使其具有很好的癌細(xì)胞靶向性，是生物熒光染料探針研究的關(guān)鍵問(wèn)題。
目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于生物熒光染料探針的研究主要集中在以下幾個(gè)方面1.熒光染料探針?lè)肿拥脑O(shè)計(jì)、合成及修飾，以提高探針?lè)肿优cDNA或細(xì)胞相互作用的光學(xué)靈敏性或增強(qiáng)水溶性為目的。2.增強(qiáng)熒光染料探針?lè)肿优c癌細(xì)胞標(biāo)記的靶向性修飾。染料分子用適當(dāng)?shù)呐潴w修飾，通過(guò)配體-受體相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的靶向性標(biāo)記。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究工作后，提出了一種高靈敏度葉酸-殼聚寡糖-花菁染料探針及該探針的制備方法。這種新型探針的水溶性得到顯著提高，并增加了染料與細(xì)胞的相容性，在與生物組織結(jié)合及成像時(shí)表現(xiàn)出熒光加合效應(yīng)，探針?lè)肿优cDNA或細(xì)胞相互作用的光學(xué)靈敏性顯著提高，且具有很好的癌細(xì)胞標(biāo)記的靶向性。
本發(fā)明新型探針結(jié)構(gòu)如圖1所示。本發(fā)明探針是在一個(gè)殼聚寡糖分子上連接1至15個(gè)花菁染料分子，再與一個(gè)葉酸分子結(jié)合形成探針。殼聚寡糖分子的分子量?jī)?yōu)選195～6000，更優(yōu)選分子量為200-2000。
本發(fā)明探針的制備可以通過(guò)本領(lǐng)域常用的方法得以實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選通過(guò)下述途徑實(shí)現(xiàn)，步驟包括
1)殼聚寡糖-花菁染料的制備將花菁染料、摩爾比為0.77∶1的苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯和1-羥基苯并三唑溶于溶劑中，將所得溶液冷卻至-5℃后加入殼聚寡糖的水溶液或體積百分比為5％的鹽酸溶液，此時(shí)保持花菁染料與殼聚寡糖的摩爾比為0.38∶1；再加入濃度為每毫升含二異丙基乙胺1-3mg的二甲亞砜溶液，混合均勻，于室溫下連續(xù)攪拌反應(yīng)8小時(shí)后加入乙醚，繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)，過(guò)濾，用乙醚洗滌所得沉淀，于20-30℃下真空干燥后，得到殼聚寡糖-花菁染料干品。
所述溶劑是N，N′-二甲基甲酰胺溶液、氯苯和/或丙酮。
2)葉酸-殼聚寡糖-花菁染料探針的制備將上述殼聚寡糖-花菁染料干品與葉酸按摩爾比為1∶1溶解于二甲亞砜溶液中，于室溫下攪拌反應(yīng)10小時(shí)后加入乙醚，產(chǎn)生沉淀，過(guò)濾；所得沉淀用乙醚洗滌后于25-35℃下真空干燥，即得葉酸-殼聚寡糖-花菁染料探針干品。
所述花菁染料為市售花菁熒光染料，優(yōu)選1-(ε-羧戊基)-1’-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚碳菁-5，5′-二磺酸鹽，1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚二碳菁-5，5′-二磺酸鹽，2-(9-蒽基)-2-羥基乙酸，熒光素和/或帶有羧基的多甲川花菁染料。
本發(fā)明探針以殼聚寡糖分子作為葉酸配體和染料分子之間的橋梁，增加了染料的細(xì)胞相容性、降低了對(duì)生物標(biāo)記物的毒性，提高了生物探針的靈敏度、降低了探針標(biāo)記的使用量。且由于殼聚寡糖具有很好的化學(xué)活性，很容易對(duì)其進(jìn)行化學(xué)改性并修飾具有特定基團(tuán)的熒光染料，還可根據(jù)特定的對(duì)象選擇合適的生物分子進(jìn)行修飾，如修飾配體定位受體及修飾探針DNA檢測(cè)目標(biāo)DNA等。
本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)為1、本發(fā)明生物探針制備方法簡(jiǎn)單，對(duì)變異細(xì)胞初步標(biāo)記研究表明，該探針具有較好的標(biāo)記靶向性，為采用該類(lèi)生物探針標(biāo)記變異細(xì)胞進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究提供了一種方法。
2、對(duì)檢測(cè)物的毒性低，靈敏度高，使用量少。由于一個(gè)殼聚寡糖分子上可連接眾多花菁染料分子，本發(fā)明探針在標(biāo)記過(guò)程中表現(xiàn)出明顯的熒光加和效應(yīng)，在提高其光穩(wěn)定性的同時(shí)增大了其標(biāo)記靈敏度，使用量減少。
3、親水性明顯增強(qiáng)，增加了生物探針和細(xì)胞的相容性。
4、具有光譜范圍廣、摩爾消光系數(shù)大、無(wú)熒光背景、熒光量子產(chǎn)率高和靈敏度高等特點(diǎn)。


圖1探針的葉酸-殼聚寡糖-熒光染料結(jié)構(gòu)；圖2熒光染料-殼聚寡糖-葉酸探針標(biāo)記牛血清蛋白的熒光光譜圖。
其中1.葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針、2.花菁熒光染料、3.葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針標(biāo)記蛋白。
具體實(shí)施例方式下面以實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針I(yè)號(hào)的制備
1.制備殼聚寡糖-花菁染料將0.021mmol的1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚碳菁-5，5′-二磺酸鹽，0.027mmol的苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯(HBTU)，0.027mmol的1-羥基苯并三唑(HOBT)溶解于5ml N，N′-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，將此溶液冷卻至-5℃后；加入含0.054mmol的殼聚寡糖(分子量為1900)的10ml水溶液，再加入含0.108mmol二異丙基乙胺(DIEA)的二甲亞砜(DMSO)溶液1ml后，將該混合物混合均勻后于室溫下連續(xù)攪拌反應(yīng)8小時(shí)后加入乙醚并繼續(xù)攪拌0.5h后過(guò)濾沉淀、再用乙醚洗滌，于室溫(20-30℃)、真空(小于0.1MP)下干燥，得到殼聚寡糖修飾的花菁染料。
2.制備葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針將上述干燥后的花菁染料-殼聚寡糖和0.02mmol蝶酰單谷氨酸(葉酸)溶解于10ml二甲亞砜(DMSO)溶液中于室溫下攪拌反應(yīng)10小時(shí)后，加入乙醚后產(chǎn)生沉淀，過(guò)濾，用乙醚洗滌后于25-35℃下真空度為0.1MP時(shí)真空干燥。干燥后即得葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針I(yè)號(hào)。
實(shí)施例2葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針I(yè)I號(hào)的制備將實(shí)施例1步驟1中的花菁染料1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚碳菁-5，5′-二磺酸鹽換成同量的2-(9-蒽基)-2-羥基乙酸；分子量為1900的殼聚寡糖換成分子量為200的殼聚寡糖，其余不變，得到葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針I(yè)I號(hào)。
實(shí)施例3葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針I(yè)II號(hào)的制備將實(shí)施例1步驟1中的花菁染料1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚碳菁-5，5′-二磺酸鹽換成同量的熒光素；分子量為1900的殼聚寡糖換成分子量為5900的殼聚寡糖，其余條件不變，得到葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針I(yè)II號(hào)。
試驗(yàn)例1葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針標(biāo)記蛋白1.葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針標(biāo)記蛋白將實(shí)施例1中所得的葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針I(yè)號(hào)溶解于10ml蒸餾水中備用。吸取該溶液2ml，加入5ml濃度為5mg/L的牛血清蛋白(BSA)或人血清蛋白(HSA)溶液，用pH＝7.0的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(tris-HCl)緩沖溶液稀釋至25mL，攪拌30min后于熒光分光光度計(jì)上測(cè)定其熒光強(qiáng)度。
2.葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針熒光強(qiáng)度的變化由于該探針上含有羧基，能和含有氨基的物質(zhì)如蛋白結(jié)合，結(jié)合后該探針的熒光性會(huì)明顯減弱，由此可以判斷該熒光探針具有識(shí)別生物活性物質(zhì)的能力。圖2是熒光光譜圖，表示了本發(fā)明探針用于標(biāo)記牛血清蛋白時(shí)其熒光強(qiáng)度的變化。
試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針在和牛血清蛋白結(jié)合后探針的熒光強(qiáng)度在518nm處熒光強(qiáng)度明顯減弱，表明該探針能很好地和蛋白結(jié)合，完全可以用于標(biāo)記蛋白。對(duì)蛋白的標(biāo)記可以確定，該染料探針在用于識(shí)別癌細(xì)胞時(shí)，該探針可很好地和癌細(xì)胞表面的葉酸受體結(jié)合，染料分子能穿透細(xì)胞膜和細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞核中，到達(dá)細(xì)胞核的染料分子能表現(xiàn)出熒光可用于識(shí)別癌細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針，其特征在于具有如下結(jié)構(gòu) 其中n＝1～15。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針，其特征在于195＜?xì)ぞ酃烟欠肿恿浚?000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述葉酸-殼聚寡糖-花菁熒光染料生物探針，其特征在于200＜?xì)ぞ酃烟欠肿恿浚?000。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述殼聚寡糖-花菁染料探針的制備方法，其特征在于制備步驟包括1)殼聚寡糖-花菁染料的制備將花菁染料、摩爾比為0.77∶1的苯并三唑-1-四甲基六氟磷酸酯和1-羥基苯并三唑溶于溶劑中，將所得溶液冷卻至-5℃后加入殼聚寡糖的水溶液或體積百分比為5％的鹽酸溶液，此時(shí)保持花菁染料與殼聚寡糖的摩爾比為0.38∶1；再加入濃度為每毫升含二異丙基乙胺1-3mg的二甲亞砜溶液，混合均勻，于室溫下連續(xù)攪拌反應(yīng)8小時(shí)后加入乙醚，繼續(xù)攪拌0.5小時(shí)，過(guò)濾，用乙醚洗滌所得沉淀，于20-30℃下真空干燥后，得到殼聚寡糖-花菁染料干品；所述溶劑是N，N′-二甲基甲酰胺溶液、氯苯和/或丙酮；2)葉酸-殼聚寡糖-花菁染料探針的制備將上述殼聚寡糖-花菁染料干品與葉酸按摩爾比為1∶1溶解于二甲亞砜溶液中，于室溫下攪拌反應(yīng)10小時(shí)后加入乙醚，產(chǎn)生沉淀，過(guò)濾；所得沉淀用乙醚洗滌后于25-35℃下真空干燥，即得葉酸-殼聚寡糖-花菁染料探針干品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述殼聚寡糖-花菁染料探針的制備方法，其特征在于制備步驟1)中的花菁染料是1-(ε-羧戊基)-1’-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚碳菁-5，5′-二磺酸鹽，1-(ε-羧戊基)-1′-乙基-3，3，3′3′-四甲基吲哚二碳菁-5，5′-二磺酸鹽，2-(9-蒽基)-2-羥基乙酸，熒光素和/或帶有羧基的多甲川花菁染料。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種葉酸－殼聚寡糖－花菁熒光染料生物探針及制備方法。本發(fā)明探針是在一個(gè)殼聚寡糖分子上連接1至15個(gè)花菁染料分子，再與一個(gè)葉酸分子結(jié)合形成探針。本發(fā)明探針用于癌細(xì)胞的識(shí)別和診斷，具有較好的標(biāo)記靶向性。本生物探針光譜范圍廣、摩爾消光系數(shù)大、無(wú)熒光背景、熒光量子產(chǎn)率高，與其他生物熒光染料探針相比，具有低毒性、低使用量、靈敏度高等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C09K11/00GK1975418SQ200610015040
公開(kāi)日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2006年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月31日
發(fā)明者費(fèi)學(xué)寧, 楊少斌, 張寶蓮, 石博杰 申請(qǐng)人:天津城市建設(shè)學(xué)院