專利名稱：生物合成靛藍(lán)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物合成靛藍(lán)的方法。
背景技術(shù)：
靛藍(lán)(indigo)是人類所知最古老的染料之一，其作為織物染料的應(yīng)用至少可追溯到公元前2500年(Sandberg G，1989，Indigo TextilesTechnique andHistory，LondonA & C Black)。古埃及木乃伊穿著的一些服裝和我國馬王堆出土的藍(lán)色麻織物等都是由靛藍(lán)所染成的(吳祺，2001，化學(xué)通報，8527-529)，我國瑤族的一支其生產(chǎn)靛藍(lán)而得名“藍(lán)靛瑤”[鞏繼賢，李輝芹，2002，北京紡織，23(5)25-27]。靛藍(lán)也是最重要的染料，需求量占全部染料總量的10％。據(jù)田利明[2006，精細(xì)與專用化工，14(7)24-]報道，我國2005年出口的靛藍(lán)量為23785.1噸。
靛藍(lán)不僅被廣泛應(yīng)用于印染業(yè)上，也廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥業(yè)和食品工業(yè)。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，中醫(yī)、印度醫(yī)和南美醫(yī)等都利用產(chǎn)靛藍(lán)植物的葉和/或根來治療諸多的疾病，從子宮癌、胃痛、癲癇和其它神經(jīng)系統(tǒng)病(特別是“憂郁癥”)、氣管炎、大出血到脾、肺和腎失調(diào)等。產(chǎn)靛藍(lán)植物的葉和/或根還被用于治療感冒、心臟和泌尿系統(tǒng)不調(diào)、少年白發(fā)和脫發(fā)等(http://www.plantcultures.org/plants/indigo_traditional_medicine.html)。在印度的一些地區(qū)，產(chǎn)靛藍(lán)植物被用于治療狂犬病，由此得名“狗咬木”(thedog-bite shrub)。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，產(chǎn)靛藍(lán)植物葉、莖和/或根的醇提取物用于保護(hù)肝臟免受象四氯化碳等化學(xué)劑的傷害、降低血壓和抗病毒等。產(chǎn)靛藍(lán)植物葉的提取物含有類魚藤酮，具有殺滅蚊子幼蟲的作用(http://www.plantcultures.org/plants/indigo_traditional_medicine.html)。在食品工業(yè)中，靛藍(lán)以其磺酸鈉鹽或其鋁化的形式等用作食用色素，我國稱之為“亮藍(lán)”(GB7655.1-1996)和亮藍(lán)鋁淀(GB7655.2-1996)，在美國等以其磺酸鈉鹽形式為主(FD&C Blue No.2，USA)，被稱之為“indigotine”(“靛藍(lán)素”)。此外，靛藍(lán)磺酸鈉鹽還作為硝酸鹽和氯酸鹽的有色指示劑用于腎功能檢測和奶檢測。
靛藍(lán)的生產(chǎn)，直到18世紀(jì)后期，一直主要靠產(chǎn)靛藍(lán)植物中提取。人們將這些產(chǎn)靛藍(lán)植物統(tǒng)稱為“藍(lán)草”，其中重要的有菘藍(lán)(Isatis indigotica，＝Indigoferasumatrgna)、歐洲菘藍(lán)(Isatis tinctoria)、蓼藍(lán)(Polygonum tinctorum)、馬藍(lán)(Strobilanthes cusia，＝Baphicanthus cusia，Goldfusia cusia，Ruelliaindigotica)、木藍(lán)(槐藍(lán)，Indigofera tinctorum)、野青樹(Indigoferasuffruticosa)和納塔爾木藍(lán)(Indigofera arrecta)等。人們將藍(lán)草放入發(fā)酵池中，加水浸泡發(fā)酵，發(fā)酵時間充足后撈出殘渣，加入生石灰充分?jǐn)嚢柚敝潦峙跻后w查看時有絲狀靛藍(lán)沉淀出現(xiàn)即可，如此就得到了靛藍(lán)。我國瑤族的一支藍(lán)靛瑤，他們在種植靛藍(lán)、制作靛藍(lán)和應(yīng)用靛藍(lán)染色方面有著獨特的技術(shù)。這一傳統(tǒng)技術(shù)，獨特傳統(tǒng)處方的靛藍(lán)染色工藝及設(shè)備列入了《中華人民共和國禁止出口、限制出口的技術(shù)目錄》，自2002年1月1日起禁止出口。
盡管傳統(tǒng)的靛藍(lán)生產(chǎn)方法被應(yīng)用了幾千年，但是其生產(chǎn)效率低、所生產(chǎn)的靛藍(lán)的純度不高，同時又受到藍(lán)草莖葉貯藏條件和貯藏期的限制，不能滿足人們的需要，特別是不能滿足19世紀(jì)中頁紡織工業(yè)革命帶來的印染業(yè)的需要，盡管當(dāng)時印度尤其是孟加拉一帶開辟了數(shù)十萬英畝的良田以種植靛藍(lán)植物(吳祺，2001，化學(xué)通報，8527-529)。因此，當(dāng)1883年德國化學(xué)家拜爾(Adolf V.Baeyer)鑒定了靛藍(lán)的結(jié)構(gòu)式并且發(fā)明、由德國BASF公司生產(chǎn)的化學(xué)合成靛藍(lán)于1897年問世后，因其原料充足、生產(chǎn)簡便、純度高、易貯運、使用方便等而迅速普及，使得具有幾千年歷史的植物靛藍(lán)黯然失色，在很短的時間內(nèi)，幾乎完全將植物靛藍(lán)趕出了市場。本20世紀(jì)60年代之后，天然靛藍(lán)終于銷聲匿跡，退出了歷史舞臺。現(xiàn)在，幾乎所有的靛藍(lán)產(chǎn)品都是化學(xué)合成的。
化學(xué)合成靛藍(lán)的主要方法是以苯胺為原料，先與氯乙酸合成苯胺基乙酸，再用氨基鈉與其共熔氧化得到二氫吲哚，進(jìn)一步氧化，生產(chǎn)吲哚酚，最后縮合成靛藍(lán)(顧毓剛等，2001，上?；ぃ?612-14)。這類方法合成靛藍(lán)的原料充足、生產(chǎn)簡便、合成的靛藍(lán)純度高、穩(wěn)定性好，易貯運和使用方便。但是在化學(xué)合成過程中，使用的苯胺和鄰苯二甲酸能導(dǎo)致人體急性和慢性中毒，對呼吸道和中樞神經(jīng)及肝臟均有一定損害，甚至能誘導(dǎo)產(chǎn)生癌癥；在縮合過程中產(chǎn)生的鐵鹽廢水pH＝4.5左右，COD高達(dá)3-3.5萬mg/L，含鹽量為13％。此外，還有大量的漂洗廢水，它含有大量的氯化鐵、硫酸鐵、硫酸鈉、氯化鈉、苯胺和硝基苯等有毒物質(zhì)等(顧毓剛等，2001，上?；?，1612-14)。這些有毒物質(zhì)不僅對化學(xué)合成生產(chǎn)者的身體健康造成危害，而且對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。進(jìn)入上世紀(jì)80年代后，隨著社會現(xiàn)代化程度的日益提高，環(huán)境保護(hù)和勞動保護(hù)意識的增強(qiáng)和逐漸普及，人們認(rèn)識到了化學(xué)合成靛藍(lán)對人體和環(huán)境的一系列嚴(yán)重危害，開始探求不會產(chǎn)生有毒副產(chǎn)品的靛藍(lán)生產(chǎn)方法。
產(chǎn)生較少或者不產(chǎn)生有毒副產(chǎn)品的方法之一是由微生物生物合成靛藍(lán)。早在1928年人們就觀察到假單胞菌(Pseudomonas indoloxidaes)能夠氧化吲哚合成靛藍(lán)，1956年觀察到真菌Schisophyllum commune能夠在有葡萄糖和胺鹽的培養(yǎng)基上直接合成靛藍(lán)，但其機(jī)制在當(dāng)時還不清楚。1983年，Ensley等發(fā)現(xiàn)，來源于從土壤細(xì)臭腐菌假單胞菌(Pseudomonas putida)的一種可傳遞質(zhì)粒的DNA片段穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的大腸桿菌后，轉(zhuǎn)化子能夠在有吲哚或色氨酸的條件下合成靛藍(lán)(Ensley等，1983，Science，222167-169)。Ensley等推測，作為培養(yǎng)基添加劑加入的或由色氨酸的酶促代謝而產(chǎn)生的吲哚，被假單胞菌DNA編碼的多組分雙加氧酶---NDO轉(zhuǎn)化成順一吲哚-2，3-二氫二醇和3一羥基吲哚(吲哚酚)。所產(chǎn)生的3一羥基吲哚在接觸空氣后被氧化成靛藍(lán)(Ensley等，1982，J Bacteriol，149948-954)。1986年，Mermod等(1986，Bio/Technology，4321-)報道，假單胞菌菌株P(guān)seudomonas putidamt-2中含有能夠降解甲苯-二甲苯或甲苯其它衍生物的酶的基因，這種基因位于TOL質(zhì)粒上。二甲苯氧化酶的釋放產(chǎn)生脫氫和單加氧化作用，使吲哚直接在C3發(fā)生羥化形成吲哚酚，后者再經(jīng)過空氣氧化，自動二聚化形成靛藍(lán)。上述2項工作揭示，含有雙加氧酶或單加氧酶基因的細(xì)菌能夠分別以色氨酸(或吲哚)和芳香族化合物為原料合成靛藍(lán)，從而開創(chuàng)了利用基因工程微生物生產(chǎn)靛藍(lán)的先河。此后，有諸多的關(guān)于利用不同的單加氧酶和雙加氧酶基因重組微生物生產(chǎn)靛藍(lán)的報道和專利。報道的單加氧酶類主要有苯乙烯(styrene)單加氧酶(Kevin E et al，1997，Appl EnvironMicrob，63(11)4287-4291)、2-羥二苯-3-單加氧酶(Meyer A et al，2002，J BiolChem，227(37)34161-34167)和二苯并噻吩(dibenzothiophene，DBT)單加氧酶(Furuya T et al，2004，Biochem Biophys Res Commune，313570-575)等；雙加氧酶類主要有萘(naphthalene)雙加氧酶[NDO；Grund A and Gunsalus IC，1983，J Bacteriol，156(1)89-94；Gibson DT et al，1995，J Bacteriol，2615-2621；Bushan B et al，2000，Lett Appl Microb，315-9；Berry A et al，2002，J IndustMicrol & biotechnol，28127-133；Kim JY et al，2003，Let Appl Microb，36343-348]、甲苯(Toluene)雙加氧酶(Stephens GM et al，1989，F(xiàn)EMS Microb Lett，57295-300；Kim JY et al，2003，Let Appl Microb，36343-348)、苯(benzene)雙加氧酶(Tan HM et al，1990，F(xiàn)EMS Microb Lett，72259-264)和其它雙加氧酶(Itoh K et al，1999，JSDC，115234-235；Alemayehu D et al，2004，F(xiàn)EMSMicrob Lett，239285-293；Royo JL et al，2005，J Biotechnol，116113-124)。此外，還有多酚氧化酶類(Doukyu N et al，2003，Appl Microb Biotechnol，60720-725；Kim JY et al，2005，Leet Appl Microb，41163-168)和環(huán)單或雙加氧酶類(Harper JB et al，2003，Tetrahedron Lett，445815-5818；PinyakongO et al，2004，F(xiàn)EMS Microb Lett，238297-305)。我國科技工作者孫國萍等[1995，微生物學(xué)報，35(3)161-165]也克隆并且表達(dá)了2-萘酸加氧酶基因；吳云等[1989，遺傳學(xué)報，16(4)318-324]將萘質(zhì)粒(含有NDO基因)導(dǎo)入大腸桿菌后獲得能夠合成靛藍(lán)的轉(zhuǎn)化子；李暉和吳云(1989，食品與發(fā)酵工業(yè)，24(2)7-10)還將萘質(zhì)粒導(dǎo)入能夠產(chǎn)生與類胡蘿卜素的分枝桿菌(Mycobacterium sp)菌株Cr-1-2-39和節(jié)桿菌(Arthrobacter sp)菌株2-3中，獲得同時產(chǎn)生類胡蘿卜素和靛藍(lán)的轉(zhuǎn)化菌株。
細(xì)胞色素P450基因經(jīng)過重組后導(dǎo)入大腸桿菌也能氧化吲哚生成靛藍(lán)。ElizabethMJ等于1999年報道[Biochem Biophys Res Commune，265(2)469-472]，他們將人類細(xì)胞色素P450基因重組后導(dǎo)入大腸桿菌，轉(zhuǎn)化子能夠?qū)⑼饧拥脚囵B(yǎng)基中的吲哚轉(zhuǎn)化成靛藍(lán)。隨后，他們闡明是由于重組人類細(xì)胞色素P450酶對外加吲哚的氧化作用導(dǎo)致靛藍(lán)的形成(Elizabeth MJ et al，2000，Biochem，39(45)13817-13824)。Katsunori N等(2001，Arch Biochem Biophys，395(1)25-31)從隨機(jī)突變?nèi)祟惣?xì)胞色素P450 2A6基因中篩選出能夠?qū)⑦胚徂D(zhuǎn)化成靛藍(lán)的基因。Li QS等報道(2000，J Chem Euro，61531-1536)，通過定向突變巨型桿菌(Bacillus megaterium)作為脂肪酸羥化酶的細(xì)胞色素P450 BM-3，使之轉(zhuǎn)變成能夠催化吲哚羥化的酶，即能夠氧化吲哚形成吲哚酚從而形成靛藍(lán)的酶。我國科技工作者李紅梅等、陸燕等進(jìn)一步定向突變了細(xì)胞色素P450 BM-3，獲得了能夠更高效率地將吲哚轉(zhuǎn)化成靛藍(lán)的突變體(李紅梅等，2005，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，32(7)1-6；2006，生物加工過程，24(2)7-10；陸燕等，2006，自然科學(xué)進(jìn)展，16(8)1047-1050)。
綜上所述，傳統(tǒng)的從靛藍(lán)植物(或產(chǎn)靛藍(lán)植物)中直接提取靛藍(lán)的方法因其生產(chǎn)效率低、所生產(chǎn)的靛藍(lán)的純度不高同時又受到藍(lán)草莖葉貯藏條件和貯藏期的限制等早已經(jīng)退出歷史舞臺；化學(xué)合成靛藍(lán)方法因其合成過程中所用的有毒物質(zhì)和產(chǎn)生的廢水廢料不僅對化學(xué)合成生產(chǎn)者的身體健康造成危害并且對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染而無法滿足現(xiàn)代人們對健康和環(huán)保的要求；通過基因工程改良的微生物生物合成靛藍(lán)則需要專門的設(shè)備和裝置并且涉及轉(zhuǎn)基因而難以消除公眾對轉(zhuǎn)基因生物安全性的憂慮。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在常溫下不使用有毒物質(zhì)、不產(chǎn)生有毒副產(chǎn)品和廢水的體外生物合成靛藍(lán)的方法。
本發(fā)明所提供的生物合成靛藍(lán)的方法，是利用活體植物的器官和/或組織的體外分泌物、和/或活體植物的器官和/或組織的細(xì)胞破碎物的體外分泌物作為催化劑，在體外以吲哚為底物合成靛藍(lán)。
所述的體外分泌物均能將吲哚氧化成吲哚酚。
所述植物器官和/或組織及其細(xì)胞破碎物可來自于任何一種或多種植物，包括(產(chǎn))靛藍(lán)植物和非(產(chǎn))靛藍(lán)植物。
所述(產(chǎn))靛藍(lán)植物是指在自然狀態(tài)下或者人工改良后能夠自身合成靛藍(lán)及其衍生物的植物，包括但不限于菘藍(lán)、歐洲菘藍(lán)、蓼藍(lán)、馬藍(lán)、木藍(lán)(槐藍(lán))、納塔爾木藍(lán)和野青樹等。
所述的非(產(chǎn))靛藍(lán)植物是指在自然狀態(tài)下或者人工改良后自身不能夠合成靛藍(lán)及其衍生物的植物，包括但不限于被子植物和裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物、草本植物、藤本植物和木本植物、常綠植物和落葉植物、園林園藝植物和農(nóng)作物及牧草植物、一年生植物和多年生植物、陸生植物以及有性和無性繁殖植物。在非(產(chǎn))靛藍(lán)的雙子葉植物中，優(yōu)選為藜目莧科莧屬和雞冠花屬植物；傘形目傘形科植物；十字花目十字花科植物，特別是蕓苔屬和蘿卜屬植物；茄目茄科植物，特別是煙草、矮牽牛、茄子、番茄和曼陀羅；葫蘆目葫蘆科植物，特別是西瓜、甜瓜和黃瓜等；豆目豆科植物，特別是黃豆(大豆)、綠豆、豌豆、豇豆和紫藤等；忍冬科忍冬屬植物；在非(產(chǎn))靛藍(lán)的單子葉植物中，優(yōu)選為禾本目禾本科植物，特別是水稻、小麥、玉米、谷子、稗子和高梁等。
所述植物的器官可為種子和/或根和/或莖和/或葉；優(yōu)選器官為種子和/或葉。該種子在自然或在人工條件下能夠吸水發(fā)芽；根和葉選自正常生長和發(fā)育植株的生活根、莖和葉。
所述種子的體外分泌物是通過種子的發(fā)芽培養(yǎng)得到的，根、莖和葉的體外分泌物是通過將根、莖和葉切成小區(qū)段或片段后的保濕培養(yǎng)得到的。
所述活體植物的器官和/或組織的細(xì)胞破碎物的體外分泌物是通過將活體植物的器官和/或組織的細(xì)胞破碎物進(jìn)行保濕培養(yǎng)得到的。
所述植物種子的體外分泌物是植物種子發(fā)芽過程中分泌到體外的分泌物；該體外分泌物按照如下方法獲得將植物種子置于能夠吸水、保水且能夠吸附靛藍(lán)并且所吸附的靛藍(lán)容易被洗脫的培養(yǎng)襯質(zhì)上進(jìn)行發(fā)芽，收集所述培養(yǎng)襯質(zhì)，得到所述植物種子發(fā)芽過程中產(chǎn)生的體外分泌物；所述植物根、莖和葉的體外分泌物是這些器官及其細(xì)胞破碎物在離體培養(yǎng)過程中分泌到體外的分泌物；該體外分泌物按照如下方法獲得將根、莖和葉切成小片段或者搗碎，置于能夠吸水、保水且能夠吸附靛藍(lán)并且所吸附的靛藍(lán)容易被洗脫的培養(yǎng)襯質(zhì)上保濕1-5天，收集所述培養(yǎng)襯質(zhì)，得到所述植物根、莖和葉及其細(xì)胞破碎物的體外分泌物。
植物種子發(fā)芽所需的外界條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，如充足的水分，適宜的溫度，足夠的氧氣，有些種子還需要光暗條件。供種子發(fā)芽用的水可為自然水、自來水、蒸餾水或去離子水，優(yōu)選為蒸餾水，經(jīng)濟(jì)的為自然水或自來水。如在常溫或室溫下，在有吸水紙(如，濾紙)或類似襯質(zhì)上使種子吸水發(fā)芽。
植物根和莖的保濕培養(yǎng)是將其切成長0.3-2cm的片段，放置在吸水紙(如，濾紙)或類似襯質(zhì)上在室溫下使其保濕；植物葉的離體培養(yǎng)是將其切成長0.3-2cm和寬0.1-0.5cm的條段，或者切成直徑為0.1-1.5cm的圓盤(常稱為“葉盤”)，放置在吸水紙(如，濾紙)或類似襯質(zhì)上在室溫下使其保濕。供根、莖和/或葉片段保濕用的水可為自然水、自來水、蒸餾水或去離子水，優(yōu)選為蒸餾水，經(jīng)濟(jì)的為自然水或自來水。
將植物的活體根段和/或莖段和/或葉段置于能夠吸水、保水且能夠吸附靛藍(lán)并且所吸附的靛藍(lán)容易被洗脫的培養(yǎng)襯質(zhì)上保活的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，如充足的水分，適宜的溫度，足夠的氧氣，有些還需要光暗條件。
所述的種子發(fā)芽襯質(zhì)、根段與葉段(葉盤)等培養(yǎng)襯質(zhì)是指墊在種子、根段與葉段(葉盤)等之下作支撐而對種子、根段與葉段(葉盤)等培養(yǎng)物沒有毒性的物質(zhì)，其具有一定的吸水和保水性能，又能夠吸附靛藍(lán)并且所吸附的靛藍(lán)很容易被洗脫。優(yōu)選為吸水紙，更優(yōu)選為濾紙。
所述活體植物的器官和/或組織的體外分泌物、和/或活體植物的器官和/或組織的細(xì)胞破碎物的體外分泌與吲哚按照如下方法混合將吲哚溶液加到所述培養(yǎng)襯質(zhì)上。
所述反應(yīng)溫度為室溫，可為10-37℃。
所述底物吲哚可為化學(xué)合成或生物合成的吲哚，優(yōu)選為價格低廉但不含對種子有毒物質(zhì)的吲哚。所述吲哚可溶解于氯仿或者N，N-二甲基甲酰胺等溶劑中。
本發(fā)明利用活體植物器官和/或組織，和/或其細(xì)胞破碎物的體外分泌物作為催化劑，在常溫下將吲哚氧化成吲哚酚(3-羥基吲哚)，吲哚酚在空氣氧的作用下聚合生成靛藍(lán)。
本發(fā)明的方法不涉及轉(zhuǎn)基因、不需要任何專門的設(shè)備和裝置，不使用任何有毒物質(zhì)、不產(chǎn)生任何有毒副產(chǎn)品，任何具有勞動能力的人都可以實施。本發(fā)明的方法完全排除了化學(xué)合成靛藍(lán)中所使用的有毒物質(zhì)和產(chǎn)生的有害有毒副產(chǎn)品和廢水，排除了對勞動者健康的不利影響和對環(huán)境的污染。本發(fā)明的方法所用的種子來源廣泛，貯運方便容易，成本低，既可以直接利用糧食作物(如小麥、玉米、水稻和谷子等)的種子和蔬菜等作物的種子，也可以利用一些作物的副產(chǎn)品，如西瓜、甜瓜和番茄等的種子；種子在作為“催化劑”使用后，仍然可以作為蔬菜(如黃豆芽、綠豆芽、蘿卜苗、菘藍(lán)苗)食用、作為工業(yè)原料使用(如麥芽、玉米芽等)或作為飼料使用(可食用植物)。本發(fā)明所用的植物材料來源廣泛而且價格低廉，合成靛藍(lán)的效率高、所合成的靛藍(lán)的純度高，幾乎不需要純化。本發(fā)明的方法是一種簡單、方便、經(jīng)濟(jì)、高效和環(huán)保的綠色生產(chǎn)靛藍(lán)的方法。


圖1為(產(chǎn))靛藍(lán)植物菘藍(lán)發(fā)芽種子催化吲哚形成靛藍(lán)照片。
圖2為非(產(chǎn))靛藍(lán)單子葉植物發(fā)芽種子催化吲哚形成靛藍(lán)照片。
圖3為非(產(chǎn))靛藍(lán)雙子葉植物發(fā)芽種子催化吲哚形成靛藍(lán)照片。
圖4為非(產(chǎn))靛藍(lán)雙子葉植物的種子在發(fā)芽過程中催化吲哚形成靛藍(lán)照片。
圖5為非(產(chǎn))靛藍(lán)雙子葉植物紅莧菜的種子發(fā)芽的濾紙吸附物催化吲哚形成靛藍(lán)照片。
圖6為雙子葉植物(紅莧菜)的根催化吲哚形成靛藍(lán)照片。
圖7為雙子葉草本植物(紅莧菜)的葉催化吲哚形成靛藍(lán)照片。
圖8為雙子葉藤本植物金銀花(常綠)和紫藤(落葉)的葉切碎后催化吲哚形成靛藍(lán)照片。
圖9為雙子葉木本植物大葉黃楊(常綠)和美國紅櫨(落葉)的葉催化吲哚形成靛藍(lán)照片。
圖10為以氯仿為溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發(fā)芽催化合成的靛藍(lán)與靛藍(lán)標(biāo)樣及靛玉紅標(biāo)樣的吸收光譜比較。
圖11為以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發(fā)芽的分泌物催化合成的靛藍(lán)與靛藍(lán)標(biāo)樣的吸收光譜比較。
圖12為用甲醇清洗后再用DMF溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發(fā)芽的分泌物催化合成的靛藍(lán)與靛藍(lán)標(biāo)樣以及甲醇洗脫物的吸收光譜比較。
圖13A為以氯仿為溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發(fā)芽的分泌物催化合成的靛藍(lán)與靛藍(lán)標(biāo)樣和靛玉紅標(biāo)樣氯仿溶液的薄層層析圖，展開劑是苯∶氯仿∶丙酮(5∶4∶1)。
圖13B為以氯仿為溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發(fā)芽的分泌物催化合成的靛藍(lán)與靛藍(lán)標(biāo)樣和靛玉紅標(biāo)樣氯仿溶液的薄層層析圖，展開劑是氯仿∶乙醇(9∶1)。
具體實施例方式
本發(fā)明利用數(shù)十種植物之一的器官和/或組織，在常溫下在體外將吲哚氧化形成靛藍(lán)。
按照本發(fā)明的方法，在能夠保水的容器底部鋪放1-3層充分吸水的濾紙(或類似物)，將(產(chǎn))靛藍(lán)植物或非(產(chǎn))靛藍(lán)植物的成熟種子或具有發(fā)芽能力的種子置于濾紙(或類似物)上，在常溫或者室溫下保濕使種子在暗處或自然條件發(fā)芽。在種子發(fā)芽過程中或待85％以上的種子發(fā)芽后，除去或不除去發(fā)芽種子，在該吸水紙(濾紙)或類似襯質(zhì)上加入溶解于氯仿或N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等溶劑的吲哚，在常溫或者室溫下放置24-72小時，當(dāng)濾紙(或類似物)變成藍(lán)色時，將其取出，剪切成小塊后置于氯仿或N，N-二甲基甲酰胺中在常溫或室溫下漂洗，待靛藍(lán)完全洗脫時(濾紙或類似物不再呈藍(lán)色)，取出濾紙或類似物。
按照本發(fā)明的方法，在能夠保水的容器底部鋪放1-3層充分吸水的濾紙(或類似物)，將(產(chǎn))靛藍(lán)植物或非(產(chǎn))靛藍(lán)植物的活體根段、莖段和葉段(葉盤)等置于濾紙(或類似物)上，在常溫或者室溫下保濕使根段、莖段和葉段(葉盤)等?；?。也可以將(產(chǎn))靛藍(lán)植物或非(產(chǎn))靛藍(lán)植物的活體葉等搗碎，置于濾紙(或類似物)上，在常溫或者室溫下保濕。經(jīng)過1-3天后，除去或不除去培養(yǎng)物，在該吸水紙(濾紙)或類似襯質(zhì)上加入溶解于氯仿或N，N-二甲基甲酰胺等溶劑的吲哚，在常溫或者室溫下放置12-72小時，當(dāng)濾紙(或類似物)變成藍(lán)色時，將其取出，剪切成小塊后，置于氯仿或N，N-二甲基甲酰胺中在常溫或室溫下漂洗，待靛藍(lán)完全洗脫時(濾紙或類似物不再呈藍(lán)色)，取出濾紙或類似物。
溶解于氯仿或N，N-二甲基甲酰胺中的靛藍(lán)可按照常規(guī)方法(如，加熱循環(huán)蒸餾)析出，回收氯仿或N，N-二甲基甲酰胺，重復(fù)循環(huán)使用。為了鑒定合成的靛藍(lán)，可以在其析出前直接取氯仿或N，N-二甲基甲酰胺洗脫的靛藍(lán)液，以氯仿或N，N-二甲基甲酰胺作為負(fù)對照，以靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)樣作為正對照，用紫外-可見光分光光度計進(jìn)行掃描，比較吸收光譜和最大吸收峰波長。也可以以氯仿或N，N-二甲基甲酰胺等靛藍(lán)溶劑作為負(fù)對照，以靛藍(lán)標(biāo)樣作為正對照進(jìn)行薄層層析，比較斑點的顏色和遷移率。
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。
下述實施例中的室溫是指10-37℃。
實施例1、(產(chǎn))靛藍(lán)植物種子的體外分泌物常溫下催化合成靛藍(lán)一、合成靛藍(lán)1、吲哚溶液的配制稱取0.06g吲哚固體粉末(北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，分析純)，溶于1ml的氯仿或N，N-二甲基甲酰胺中，相應(yīng)形成0.5mmol/ml的吲哚氯仿溶液或吲哚N，N-二甲基甲酰胺溶液，裝入1.5ml離心管或棕色指形管中，室溫存放，備用。
2、種子的發(fā)芽在培養(yǎng)皿(直徑9cm)中放入3層濾紙，加約4ml左右蒸餾水使濾紙充分吸濕，以濾紙表面看不到流動的水為度。將(產(chǎn))靛藍(lán)植物菘藍(lán)的種子均勻地鋪在培養(yǎng)皿濾紙上，蓋蓋。每次做5個培養(yǎng)皿。將含有種子的培養(yǎng)皿置于暗處在室溫或常溫下培養(yǎng)。1-2天后，85％以上的種子發(fā)芽。
3、底物---吲哚的加入和靛藍(lán)的合成當(dāng)種子芽的下胚軸長到2cm左右時(發(fā)芽后1-2天)，隨機(jī)在第一個培養(yǎng)皿中滴加10μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍(lán)，第二個培養(yǎng)皿中滴加10μl吲哚溶液(溶劑為N，N-二甲基甲酰胺(DMF))以合成靛藍(lán)，在第三個培養(yǎng)皿中加10μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養(yǎng)皿中加10μl的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作為溶劑對照，第五個培養(yǎng)皿加蒸餾水以作為空白對照。處理后，將培養(yǎng)皿在暗處于(室溫)下放置1-3天，觀察培養(yǎng)皿中濾紙顏色的變化。結(jié)果表明在加入底物吲哚(溶于氯仿或N，N-二甲基甲酰胺---DMF)的培養(yǎng)皿中，濾紙均呈藍(lán)色或有藍(lán)色斑塊(圖1中A)，而不加吲哚溶液的所有培養(yǎng)皿中，濾紙的顏色沒有任何變化(圖1中B)。圖1中A為加入吲哚溶液(以氯仿作為溶劑)的培養(yǎng)皿，圖1中B為加入10μl氯仿的培養(yǎng)皿。
實施例2、非(產(chǎn))靛藍(lán)單子葉植物種子的體外分泌物常溫下催化合成靛藍(lán)吲哚溶液的配制同實施例1。
在培養(yǎng)皿(直徑9cm)中放入3層濾紙，加約4ml左右蒸餾水使濾紙充分吸濕，以濾紙表面看不到流動的水為度。將非(產(chǎn))靛藍(lán)單子葉植物小麥(品種“揚麥158”和“農(nóng)大170”)、水稻(品種“越富”)和玉米等(見表1)的種子分別均勻地鋪在培養(yǎng)皿濾紙上，蓋蓋。每次每種植物種子做5個培養(yǎng)皿。將含有種子的培養(yǎng)皿置于暗處在25℃下培養(yǎng)。1-2天后，90％以上的種子發(fā)芽。
當(dāng)種子芽的下胚軸長到約2cm左右時(發(fā)芽后1-2天)，與實施例1一樣，隨機(jī)在第一個培養(yǎng)皿中滴加20μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍(lán)，第二個培養(yǎng)皿中滴加20μl吲哚溶液(溶劑為N，N-二甲基甲酰胺(DMF))以合成靛藍(lán)，在第三個培養(yǎng)皿中加20μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養(yǎng)皿中加20μl的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作為溶劑對照，第五個培養(yǎng)皿加蒸餾水以作為空白對照。處理后，將培養(yǎng)皿在暗處于室溫下放置1-3天，然后觀察培養(yǎng)皿中濾紙顏色的變化。結(jié)果表明在加入不論是氯仿還是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作為溶劑的吲哚溶液的培養(yǎng)皿中，濾紙均呈藍(lán)色或有藍(lán)色斑塊(表1，圖2中A)，而不加吲哚溶液的所有培養(yǎng)皿中，濾紙的顏色沒有任何變化(表1，圖2中B)。圖2中A為加入底物吲哚溶液(以N，N-二甲基甲酰胺作為溶劑)的培養(yǎng)皿，圖2中B為加入20μl溶劑N，N-二甲基甲酰胺的培養(yǎng)皿。圖2中A和B中的三個培養(yǎng)皿從左至右依次為水稻、小麥和玉米。
表1、非(產(chǎn))靛藍(lán)單子葉植物種子發(fā)芽體外常溫氧化吲哚生成靛藍(lán)(襯質(zhì)濾紙的藍(lán)色反應(yīng))

實施例3、非(產(chǎn))靛藍(lán)雙子葉植物種子的體外分泌物常溫下催化合成靛藍(lán)吲哚溶液的配制同實施例1。
在培養(yǎng)皿(直徑9cm)中放入3層濾紙，加約4ml左右蒸餾水使濾紙充分吸濕，以濾紙表面看不到流動的水為度。將非(產(chǎn))靛藍(lán)雙子葉植物大豆(黃豆)、綠豆、豇豆、莧菜、油菜、大白菜、白蘿卜、胡蘿卜、芹菜、茄子、煙草和雞冠花等(見表2)的種子分別均勻地鋪在培養(yǎng)皿濾紙上，蓋蓋。每次每種植物種子5個培養(yǎng)皿。將含有種子的培養(yǎng)皿置于暗處在室溫下培養(yǎng)。
含有種子的培養(yǎng)皿置于暗處在室溫下培養(yǎng)1-2天后，90％以上的種子發(fā)芽。當(dāng)種子芽的下胚軸長到約2cm左右時(發(fā)芽后2天)，與實施例1一樣，隨機(jī)在第一個培養(yǎng)皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍(lán)，第二個培養(yǎng)皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為N，N-二甲基甲酰胺(DMF))以合成靛藍(lán)，在第三個培養(yǎng)皿中加50μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養(yǎng)皿中加50μl的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作為溶劑對照，第五個培養(yǎng)皿加蒸餾水以作為空白對照。處理后，將培養(yǎng)皿在暗處于室溫下放置1-3天，然后觀察培養(yǎng)皿中濾紙顏色的變化。結(jié)果表明在加入不論是氯仿還是N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作為溶劑的吲哚溶液的培養(yǎng)皿中，濾紙均呈藍(lán)色或有藍(lán)色斑塊(表2，圖3中A)，而不加吲哚溶液的所有培養(yǎng)皿中，濾紙的顏色沒有任何變化(表2，圖3中B)。圖3中A為加入底物吲哚溶液(以N，N-二甲基甲酰胺作為溶劑)的培養(yǎng)皿，圖3中B為加入50μlN，N-二甲基甲酰胺的培養(yǎng)皿。圖3中A和B中的六個培養(yǎng)皿從左至右依次為紅莧菜、油菜、蘿卜、西瓜、大豆和綠豆。
表2、非(產(chǎn))靛藍(lán)雙子葉植物種子發(fā)芽體外常溫氧化吲哚生成靛藍(lán)(襯質(zhì)濾紙的藍(lán)色反應(yīng))


實施例4、非(產(chǎn))靛藍(lán)雙子葉植物種子的體外分泌物常溫下催化合成靛藍(lán)——種子發(fā)芽過程中加入吲哚吲哚標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制方法與種子發(fā)芽方法同實施例3。
分別將含有紅莧菜(品系農(nóng)大紅)、大白菜和曼陀羅等種子的培養(yǎng)皿置于暗處在20℃培養(yǎng)24小時后，可以看見有些種子開始萌芽。此時，隨機(jī)在第一個培養(yǎng)皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍(lán)，第二個培養(yǎng)皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為DMF)以合成靛藍(lán)，在第三個培養(yǎng)皿中加50μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養(yǎng)皿中加50μl的DMF作為溶劑對照，第五個培養(yǎng)皿加蒸餾水以作為空白對照。處理后，將培養(yǎng)皿在暗處于室溫下放置1-3天，然后觀察培養(yǎng)皿中濾紙顏色的變化。結(jié)果表明在加入底物吲哚溶液(以氯仿或DMF作為溶劑)的培養(yǎng)皿中，濾紙均呈藍(lán)色或有藍(lán)色斑塊(圖4中A)，而不加吲哚溶液的所有培養(yǎng)皿中，濾紙的顏色沒有任何變化(圖4中B)。圖4中A為加入吲哚溶液(以氯仿作為溶劑)的培養(yǎng)皿，圖4中B為加入50μl氯仿的培養(yǎng)皿。圖4中A和B中的三個培養(yǎng)皿從左至右依次為大白菜、曼陀羅和紅莧菜。
實施例5、非(產(chǎn))靛藍(lán)雙子葉植物種子的體外分泌物常溫下催化合成靛藍(lán)——將種子芽苗移走后加入吲哚吲哚標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制方法與種子發(fā)芽方法同實施例3。
含有紅莧菜(品系農(nóng)大紅)種子的培養(yǎng)皿置于暗處在室溫下培養(yǎng)1-2天后，90％以上的種子發(fā)芽。當(dāng)種子芽的下胚軸長到約2cm左右時(發(fā)芽后1-2天)，將芽苗取出，留下濾紙。然后，隨機(jī)在第一個培養(yǎng)皿中滴加30μl吲哚溶液(以氯仿為溶劑)以合成靛藍(lán)，第二個培養(yǎng)皿中滴加30μl吲哚溶液(以DMF為溶劑)以合成靛藍(lán)，在第三個培養(yǎng)皿中加30μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養(yǎng)皿中加30μl的DMF作為溶劑對照，第五個培養(yǎng)皿加蒸餾水以作為空白對照。處理后，將培養(yǎng)皿在暗處于室溫下放置1-3天，然后觀察培養(yǎng)皿中濾紙顏色的變化。結(jié)果表明，無論以氯仿還是以DMF為吲哚的溶劑，在加入底物吲哚溶液的培養(yǎng)皿中，濾紙均呈藍(lán)色或有藍(lán)色斑塊(圖5中A)，而不加吲哚溶液的所有培養(yǎng)皿中，濾紙的顏色沒有任何變化(圖5中B)。圖5中A為加入吲哚溶液(以DMF作為溶劑)的培養(yǎng)皿，圖5中B為加入50μlDMF的培養(yǎng)皿。
實施例6、雙子葉植物的根的體外分泌物常溫下催化合成靛藍(lán)吲哚標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制方法同實施例3。
取紅莧菜(品系農(nóng)大紅)等田間苗或室內(nèi)室溫或常溫下種子芽苗的根(田間苗的根用自來水洗凈，用吸水紙吸干表面的水)，在培養(yǎng)皿中充分吸濕的2-3層濾紙上切成長0.5-0.8cm的片段，培養(yǎng)皿加蓋后于暗處在室溫或常溫下培養(yǎng)1-2天。然后，隨機(jī)在第一個培養(yǎng)皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍(lán)，第二個培養(yǎng)皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為DMF)以合成靛藍(lán)，在第三個培養(yǎng)皿中加50μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養(yǎng)皿中加50μl的DMF作為溶劑對照，第五個培養(yǎng)皿加蒸餾水以作為空白對照。處理后，將培養(yǎng)皿在暗處于室溫下放置1-3天，然后觀察培養(yǎng)皿中濾紙顏色的變化。結(jié)果表明田間苗的根或種子芽苗的根在加入吲哚溶液(不論以氯仿還是以DMF作為溶劑)的培養(yǎng)皿中，濾紙均呈藍(lán)色或有藍(lán)色斑塊(圖6)，而不加吲哚溶液的所有培養(yǎng)皿中，濾紙的顏色沒有任何變化。圖6示田間苗的根催化合成的靛藍(lán)。
實施例7、雙子葉植物的葉片的體外分泌物常溫下催化合成靛藍(lán)吲哚標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制方法同實施例3。
取紅莧菜(品系農(nóng)大紅)田間苗或無菌苗(試管苗)的伸展葉。田間苗的葉用自來水洗凈，用吸水紙吸干表面的水。
將葉切成長0.3-1.5cm、寬0.2-0.5cm的長條，或者用打孔器切成直徑為0.3-0.5cm的圓盤，將其放置培養(yǎng)皿中充分吸濕的2-3層濾紙上，培養(yǎng)皿加蓋后于暗處在室溫或常溫下培養(yǎng)1-2天。然后，隨機(jī)在第一個培養(yǎng)皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍(lán)，第二個培養(yǎng)皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為DMF)以合成靛藍(lán)，在第三個培養(yǎng)皿中加50μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養(yǎng)皿中加50μl的DMF)作為溶劑對照，第五個培養(yǎng)皿加蒸餾水以作為空白對照。處理后，將培養(yǎng)皿在暗處于室溫下放置1-3天，然后觀察培養(yǎng)皿中濾紙顏色的變化。結(jié)果表明在加入不論是氯仿還是DMF作為溶劑的吲哚溶液的培養(yǎng)皿中，濾紙均呈藍(lán)色或有藍(lán)色斑塊(圖7)，而不加吲哚溶液的所有培養(yǎng)皿中，濾紙的顏色沒有任何變化。圖7是田間苗的葉催化合成的靛藍(lán)。
實施例8、雙子葉藤本植物的葉片細(xì)胞破碎物常溫下催化合成靛藍(lán)吲哚標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制方法同實施例3。
分別取常綠藤本植物金銀花(忍冬)和落葉藤本植物紫藤田間苗伸展葉，用自來水洗凈，再用蒸餾水清洗2-3次，用吸水紙吸干表面的水。葉片清洗完后，迅速搗碎，放在培養(yǎng)皿中充分吸濕的2-3層濾紙上，培養(yǎng)皿加蓋后于暗處在室溫或常溫下培養(yǎng)1-2天。然后，隨機(jī)在第一個培養(yǎng)皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍(lán)，第二個培養(yǎng)皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為DMF)以合成靛藍(lán)，在第三個培養(yǎng)皿中加50μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養(yǎng)皿中加50μl的DMF作為溶劑對照，第五個培養(yǎng)皿加蒸餾水以作為空白對照。處理后，將培養(yǎng)皿在暗處于室溫下放置1-3天，然后觀察培養(yǎng)皿中濾紙顏色的變化。結(jié)果顯示在加入底物吲哚溶液(以氯仿或DMF作為溶劑)的培養(yǎng)皿中，濾紙均呈藍(lán)色或有藍(lán)色斑塊(圖8)，而不加吲哚溶液的所有培養(yǎng)皿中，濾紙的顏色沒有任何變化。圖8為雙子葉木質(zhì)藤本植物的葉片細(xì)胞破碎物催化合成的靛藍(lán)。圖中，A為金銀花(忍冬)，B為紫藤。
實施例9、雙子葉木本植物的葉片常溫下催化合成靛藍(lán)吲哚標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制方法同實施例3。
分別取常綠木本植物大葉黃楊和落葉木本植物美國紅櫨田間苗伸展葉，用自來水洗凈，再用蒸餾水清洗2-3次，用吸水紙吸干表面的水。葉片清洗完后，將葉切成長0.3-1.5cm、寬0.2-0.5cm的長條，或者用打孔器切成直徑為0.3-0.5cm的圓盤，將其放置培養(yǎng)皿中充分吸濕的2-3層濾紙上，培養(yǎng)皿加蓋后于暗處在室溫或常溫下培養(yǎng)1-2天。然后，隨機(jī)在第一個培養(yǎng)皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為氯仿)以合成靛藍(lán)，第二個培養(yǎng)皿中滴加50μl吲哚溶液(溶劑為DMF)以合成靛藍(lán)，在第三個培養(yǎng)皿中加50μl的氯仿作為溶劑對照，在第四個培養(yǎng)皿中加50μl的DMF作為溶劑對照，第五個培養(yǎng)皿加蒸餾水以作為空白對照。處理后，將培養(yǎng)皿在暗處于室溫下放置1-3天，然后觀察培養(yǎng)皿中濾紙顏色的變化。結(jié)果表明在加入不論是氯仿還是DMF作為溶劑的吲哚溶液的培養(yǎng)皿中，濾紙均呈藍(lán)色或有藍(lán)色斑塊(圖9)，而不加吲哚溶液的所有培養(yǎng)皿中，濾紙的顏色沒有任何變化。圖中，A為大葉黃楊；B為美國紅櫨。
實施例10、植物催化體外常溫合成靛藍(lán)的提取方法1、直接提取分別將實施例1-9中顯藍(lán)色或藍(lán)色斑塊濾紙室溫自然晾干后，剪切成碎片，分別置于氯仿溶劑或N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室溫下放置以洗脫藍(lán)色物質(zhì)，期間白天每隔1小時輕輕搖動3-5分鐘，以在濾紙上看不見藍(lán)色為度(一般2-12小時)。此時，溶液變成藍(lán)色。當(dāng)濾紙退去藍(lán)色后，將其取出，得到合成靛藍(lán)的氯仿溶液或DMF溶液。
方法2、用甲醇漂洗后再提取將實施例1-9中顯藍(lán)色或藍(lán)色斑塊濾紙室溫自然晾干后，剪切成大片(6-8份/張)，置于甲醇(北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，分析純)中于室溫下漂洗1-12小時，取出濾紙，室溫下晾干，然后剪切成碎片，分別置于氯仿溶劑或DMF中，室溫下放置以洗脫藍(lán)色物質(zhì)，期間白天每隔1小時輕輕搖動3-5分鐘，以在濾紙上看不見藍(lán)色為度(一般2-12小時)。此時，溶液變成藍(lán)色。當(dāng)濾紙退去藍(lán)色后，將其取出，得到合成靛藍(lán)的氯仿溶液或DMF溶液。
實施例11、植物催化體外常溫合成靛藍(lán)的分光光度計吸光譜鑒定1、標(biāo)準(zhǔn)品靛藍(lán)溶液的配制準(zhǔn)確稱取靛藍(lán)和靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品)各1mg，分別定溶于50ml的氯仿(北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，分析純)或N，N-二甲基甲酰胺(DMF，北京化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，分析純)中，相應(yīng)形成0.02mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)靛藍(lán)氯仿溶液和靛藍(lán)DMF溶液，裝入棕色試劑瓶中，室溫存放，備用。
2、靛藍(lán)的分光光度計吸光譜掃描將標(biāo)準(zhǔn)品靛藍(lán)溶液(以及標(biāo)準(zhǔn)品靛玉紅溶液)和實施例1-9中所合成按照實施例10中方法1和方法2所提取的靛藍(lán)的溶液(以氯仿或DMF為溶劑)用紫外-可見光分光光度計(雙光束紫外可見分光光度計，型號TU-1901，購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)在190-800nm波長范圍內(nèi)以1nm為單位進(jìn)行吸光掃描，相應(yīng)以溶劑氯仿或DMF為空白對照。將掃描的吸光值用微軟Excell軟件作曲線圖，然后比較標(biāo)準(zhǔn)品靛藍(lán)溶液和合成靛藍(lán)的吸光譜與最大吸光波長(或波峰)。
結(jié)果表明實施例1-9中合成的所有靛藍(lán)與標(biāo)準(zhǔn)品靛藍(lán)的吸光譜與最大波峰完全一致，這也被在紫外光區(qū)和可見光區(qū)最大吸光值所肯定。由此表明，由植物器官(種子、根和葉片)催化吲哚形成的藍(lán)色物質(zhì)為靛藍(lán)。圖10顯示的是以氯仿為溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發(fā)芽的分泌物催化合成的靛藍(lán)與靛藍(lán)標(biāo)樣及靛玉紅標(biāo)樣的吸收光譜比較；圖中，1為氯仿提取的靛藍(lán)樣品中的吸收光譜，2為靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸收光譜，3為靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸收光譜。圖11顯示的是以N，N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發(fā)芽的分泌物催化合成的靛藍(lán)與靛藍(lán)標(biāo)樣的吸收光譜比較；圖中，4為DMF提取的合成靛藍(lán)樣品，5為DMF溶解的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)樣品。圖12顯示的是用甲醇清洗后再用DMF溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發(fā)芽的分泌物催化合成的靛藍(lán)與靛藍(lán)標(biāo)樣以及甲醇洗脫物的吸收光譜比較；圖中，6為DMF溶解的靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)樣品，7為甲醇清洗后，DMF提取的靛藍(lán)樣品，8為甲醇提取物。表3給出了標(biāo)準(zhǔn)品靛藍(lán)與紅莧菜種子發(fā)芽的分泌物催化吲哚形成的靛藍(lán)在不同溶劑(氯仿或DMF)經(jīng)過甲醇清洗前后在紫外光區(qū)和可見光區(qū)的最大吸收峰的波長。
表3、標(biāo)準(zhǔn)品靛藍(lán)與紅莧菜種子發(fā)芽的分泌物催化吲哚形成的藍(lán)色物質(zhì)的最大吸收峰波長(nm)比較

實施例12、植物催化體外常溫合成靛藍(lán)的薄層層析鑒定標(biāo)準(zhǔn)品靛藍(lán)溶液和標(biāo)準(zhǔn)品靛玉紅溶液的配制同實施例11。薄層層析所用的硅膠板為“銀龍”牌“薄層色譜硅膠預(yù)制板”(煙臺化學(xué)工業(yè)研究所產(chǎn)品)，尺寸10×2.5×0.25cm；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)魯Q/YT257-85，涂層厚度0.2mm±0.03mm，SX＝3；硅膠粉粉度8±2μm。Ph＝6.2-6.8。
在層析板的一端距離邊沿2.5cm處用鉛筆在硅膠板上輕輕劃一條線，然后用毛細(xì)管在線上點開三個小孔(直徑大約0.1mm)，分別取標(biāo)準(zhǔn)品靛藍(lán)溶液、標(biāo)準(zhǔn)品靛玉紅溶液和的樣品靛藍(lán)的溶液(實施例1-9中所合成、按照實施例10中途徑1的方法提取，以氯仿或DMF為溶劑)3-5μl，依次加入3個小圓孔中。將硅膠板置于層析缸中在室溫下進(jìn)行層析(展開劑深度為1.5cm左右)，直至展開劑上升到距上邊緣1-0.5cm時，將硅膠板取出，沿展開劑所到達(dá)的最上邊緣用鉛筆輕輕劃一條直線。計算遷移率Rf＝(半點中心與原始樣點之間的距離)/(溶劑前沿與原始樣點之間的距離)，并照相保存結(jié)果。
結(jié)果顯示，用氯仿溶解靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品、靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品和洗脫合成的靛藍(lán)，當(dāng)展開劑為苯∶氯仿∶丙酮＝5∶4∶1(體積比)[程力惠，2005，“板藍(lán)根中靛玉紅提取方法研究”，亞熱帶植物科學(xué)，34(2)46-47]時，在可見光下靛藍(lán)標(biāo)樣和實施例1-9中合成的所有靛藍(lán)樣品都呈藍(lán)色扁橢圓形斑點，而靛玉紅標(biāo)樣呈紫紅色扁橢圓形斑點；靛玉紅標(biāo)樣的遷移率比靛藍(lán)標(biāo)樣和提取靛藍(lán)樣品的低得多，而靛藍(lán)標(biāo)樣和提取的靛藍(lán)樣品的遷移率相等(靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)樣品Rf＝0.8013，靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)樣品Rf＝0.4697，藍(lán)色樣品Rf＝0.8013)，見圖13A。在相同的條件下，當(dāng)展開劑為氯仿∶乙醇＝9∶1(體積比)時，在可見光下靛藍(lán)標(biāo)樣和實施例1-9中合成的所有靛藍(lán)樣品都呈藍(lán)色長扁橢圓形斑點，而靛玉紅標(biāo)樣呈紫紅色長扁橢圓形斑點；靛藍(lán)標(biāo)樣和提取的靛藍(lán)樣品的遷移率仍然相等，但靛玉紅標(biāo)樣的遷移率與靛藍(lán)標(biāo)樣和提取靛藍(lán)樣品遷移率的差距縮小(靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)樣品Rf＝0.9615，靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)樣品Rf＝0.9385，藍(lán)色樣品Rf＝0.9615)，見圖13B。圖13A和13B顯示的是以氯仿為溶劑洗脫吸附在濾紙上的紅莧菜種子發(fā)芽的分泌物催化合成的靛藍(lán)、與以氯仿為溶劑配制的靛藍(lán)和靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)樣品的薄層層析圖，其中，圖13A中展開劑是苯∶氯仿∶丙酮(5∶4∶1)；圖13B中展開劑是氯仿∶乙醇(9∶1)；圖13A和13B中，從左至右依次為靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)樣品、靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)樣品與合成的靛藍(lán)。
從圖10-13B可以看出，本發(fā)明用植物器官和/或組織在體外在常溫下催化吲哚氧化形成的藍(lán)色物質(zhì)與靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品的吸收光譜及其最大吸收峰波長完全一致，顏色完全相同，而且層析的遷移率相等。因此，本發(fā)明用植物器官和/或組織在體外在常溫下催化吲哚氧化形成的藍(lán)色物質(zhì)的確是靛藍(lán)。從薄層層析圖(圖13A和13B)可以看出，無論用經(jīng)典的展開劑(圖13A)還是用新的展開劑(圖13B)，本發(fā)明用植物器官和/或組織在體外在常溫下催化吲哚氧化形成的藍(lán)色物質(zhì)與靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品一樣，都只有一個藍(lán)色的斑點，絕對不含靛玉紅等雜質(zhì)。證明，本發(fā)明用植物器官和/或組織在體外在常溫下催化吲哚氧化形成的靛藍(lán)是高度純凈的靛藍(lán)。
權(quán)利要求
1.一種生物合成靛藍(lán)的方法，是利用活體植物的器官和/或組織的體外分泌物、和/或活體植物的器官和/或組織的細(xì)胞破碎物的體外分泌物作為催化劑，在體外以吲哚為底物合成靛藍(lán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的體外分泌物均能將吲哚氧化成吲哚酚。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述植物為單子葉植物與雙子葉植物；所述植物優(yōu)選為陸生種子植物；尤其優(yōu)選為菘藍(lán)、歐洲菘藍(lán)、蓼藍(lán)、馬藍(lán)、木藍(lán)、納塔爾木藍(lán)、野青樹、金銀花、紫藤、黃楊、紅櫨、煙草、矮牽牛、茄子、番茄、曼陀羅、油菜、大白菜、小白菜、莧菜、蘿卜、胡蘿卜、茴香、芹菜、西瓜、甜瓜、黃瓜、黃豆、綠豆、豌豆、豇豆、水稻、小麥、玉米、谷子、稗子和高梁；所述莧菜包括葉用和籽用的莧菜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述植物為煙草、油菜、莧菜、黃豆、綠豆、豌豆、蘿卜、小麥、玉米、谷子和高梁；所述莧菜為籽用的莧菜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述植物的器官為種子和/或根和/或莖和/或葉；優(yōu)選器官為種子和/或葉。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征之在于所述植物種子的體外分泌物是植物種子發(fā)芽過程中分泌到體外的分泌物；該體外分泌物按照如下方法獲得將植物種子置于能夠吸水、保水且能夠吸附靛藍(lán)并且所吸附的靛藍(lán)容易被洗脫的培養(yǎng)襯質(zhì)上進(jìn)行發(fā)芽，收集所述培養(yǎng)襯質(zhì)，得到所述植物種子發(fā)芽過程中產(chǎn)生的體外分泌物；所述植物根、莖和葉的體外分泌物是這些器官及其細(xì)胞破碎物在離體培養(yǎng)過程中分泌到體外的分泌物；該體外分泌物按照如下方法獲得將根、莖和葉切成小片段或者搗碎，置于能夠吸水、保水且能夠吸附靛藍(lán)并且所吸附的靛藍(lán)容易被洗脫的培養(yǎng)襯質(zhì)上保濕1-5天，收集所述培養(yǎng)襯質(zhì)，得到所述植物根、莖和葉及其細(xì)胞破碎物的體外分泌物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)襯質(zhì)為吸水紙或濾紙。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述活體植物的器官和/或組織的體外分泌物、和/或活體植物的器官和/或組織的細(xì)胞破碎物的體外分泌與吲哚按照如下方法混合將吲哚溶液加到所述培養(yǎng)襯質(zhì)上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)溫度為10-37℃，反應(yīng)時間為1-6天。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述吲哚溶液是將吲哚溶解于氯仿或者N，N-二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑中，優(yōu)選溶劑為氯仿或者N，N-二甲基甲酰胺。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物合成靛藍(lán)的方法。該方法是利用活體植物的器官和/或組織的體外分泌物、和/或活體植物的器官和/或組織的細(xì)胞破碎物的體外分泌物作為催化劑，在體外以吲哚為底物合成靛藍(lán)。利用該方法合成靛藍(lán)不需要任何特殊的和專門的儀器和設(shè)備，操作極其簡單方便，并且不產(chǎn)生任何污染物。所合成的靛藍(lán)很容易用常規(guī)方法提取，純度高，幾乎不需要再純化。此外，作為催化劑的植物器官，在完成催化后仍然可以作為食物(可食用植物)或工業(yè)原料(非可食用植物)利用。
文檔編號C09B61/00GK1970642SQ20061011448
公開日2007年5月30日 申請日期2006年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月10日
發(fā)明者肖興國, 劉建兵, 袁利娟, 高兆建, 韓曉紅 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)