專利名稱：一種具有熒光性質(zhì)的蟲草多糖及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種易被檢測(cè)的蟲草多糖及其制備方法，屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，冬蟲夏草具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬力、提高機(jī)體免疫的 功能，具有一定的抗癌作用，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜和催眠效果。此外，對(duì) 腎臟、心臟、肝臟損傷有保護(hù)和防治作用，以及抗衰老、抗缺氧的應(yīng)激作用， 擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、抗心率失常、降低心肌耗氧量及抗氧化等作用。因?yàn)槎x夏草 具有多種醫(yī)療和滋補(bǔ)作用，從古至今都受到人們的極大關(guān)注，作為冬蟲夏草主 要活性成分之一的蟲草多糖，具有抗慢性腎衰竭的功能。對(duì)其活性的研究主要
通過動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)來證明蟲草多糖具有調(diào)節(jié)生長轉(zhuǎn)化因子(TGF-P)、血小管衍 生生長因子(PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和體內(nèi)T細(xì)胞活性等作用，但 是檢測(cè)蟲草多糖的活性，僅僅是根據(jù)這些因子的變化看其活性，無法得知究竟 是蟲草多糖中的哪個(gè)片段發(fā)揮著作用，限制了對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分子機(jī)制的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提出一種具有熒光性質(zhì)的蟲草多糖 及其制備方法，為蟲草多糖藥理藥效的研究提供方便。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案達(dá)到的 一種具有熒光性質(zhì)的蟲草多糖， 是由蟲草多糖、連接臂和熒光基團(tuán)組成的，所述蟲草多糖通過連接臂與熒光基 團(tuán)連接。其進(jìn)一步完善的是，所述蟲草多糖通過共價(jià)鍵與連接臂連接。所述連 接臂通過共價(jià)鍵與熒光基團(tuán)連接。所述連接臂是4-羥基苯乙胺。所述熒光基團(tuán)
是異硫氰酸熒光素。具有熒光性質(zhì)的蟲草多糖的制備方法，包括以下步驟(l)在還原劑的催 化作用下，將蟲草多糖溶于反應(yīng)溶劑中，加入連接臂發(fā)生還原胺化反應(yīng)，生成
蟲草多糖-連接臂復(fù)合物；(2)將反應(yīng)(l)中產(chǎn)生的仲氨基進(jìn)一步與熒光基團(tuán)
進(jìn)行反應(yīng)，生成蟲草多糖-連接臂-熒光基團(tuán)復(fù)合物。其進(jìn)一步完善的是，所述
的還原劑是硼氫化鈉，所述的反應(yīng)溶劑是磷酸鉀緩沖溶液；所述蟲草多糖和連
接臂的比例在4: 3—1: 1之間，反應(yīng)溫度為3(TC—4(TC,反應(yīng)時(shí)間為48h—120h。
本發(fā)明所涉及的蟲草多糖是由麥角菌科真菌冬蟲夏草中提取到的多糖，主
要是由甘露糖，葡萄糖，半乳糖組成。本發(fā)明的原理是蟲草多糖的還原性末
端在硼氫化鈉的作用下，使糖和4-羥基苯乙胺的氨基共價(jià)偶聯(lián)發(fā)生還原胺化反
應(yīng)，反應(yīng)過后生成的仲氨基與異硫氰酸熒光素進(jìn)行親核反應(yīng)，從而生成所需的
帶有熒光的糖。反應(yīng)方程式如下其中n表示甘露糖， ，H,. 亂OH
，0H * 版
H J畫"一,"Dli +
fiH H H
本發(fā)明的有益效果是通過合成方法使不帶有特殊基團(tuán)的蟲草多糖成為易于檢 測(cè)的帶有熒光的多糖，在保證蟲草多糖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)不被破壞的同時(shí)也保證了蟲 草多糖的抗腫瘤、抗慢性腎衰、增強(qiáng)機(jī)體免疫等生物學(xué)活性。用熒光標(biāo)記過后 的蟲草多糖可以用于相應(yīng)的藥物代謝，藥理等多方面的基礎(chǔ)研究。


圖1為蟲草多糖-連接臂的測(cè)定圖。圖中l(wèi).為蟲草多糖-連接臂中連接臂吸收峰。
圖2為蟲草多糖-連接臂的糖含量測(cè)定圖。圖中縱坐標(biāo)表示吸收值，橫坐標(biāo)表
4示時(shí)間。
圖3為蟲草多糖-連接臂-熒光基團(tuán)的測(cè)定圖。圖中1.表示蟲草多糖-連接臂-熒光基團(tuán)中連接臂的吸收峰，橫坐標(biāo)表示管數(shù)。
圖4為蟲草多糖-連接臂-熒光基團(tuán)的測(cè)定圖。圖中l(wèi).表示熒光基團(tuán)的吸收峰, 2.表示糖含量，縱坐標(biāo)表示吸收值，橫坐標(biāo)表示管數(shù)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一
(1)將160mg的蟲草多糖溶于6mL的0. 2mol/L的磷酸鉀緩沖液(PH 8. 0 ) 中，然后依次加入160mg的4-羥基苯乙胺和60mg硼氫化鈉，于37。C培養(yǎng)箱中 反應(yīng)96h，間或振蕩，反應(yīng)完后離心分離，將上清液上Sephadex G-25柱，用水 洗脫，用核酸蛋白檢測(cè)儀在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第一個(gè)峰，即連接臂的吸 收峰，見圖1;用硫酸-苯酚法測(cè)第一個(gè)峰的糖含量，見圖2;兩個(gè)圖顯示第一 個(gè)峰有4-羥基苯乙胺的吸收也有糖，表明蟲草多糖已與連接臂相連，將第一個(gè) 峰冷凍干燥得連有4-羥基苯乙胺的蟲草多糖。
(2 )取上述制得的連有4-羥基苯乙胺的蟲草多糖16mg溶于水，用0. 5mol/L 的NaHC03調(diào)PH至8. 5,然后加入2mg異硫氰酸熒光素，在室溫下，避光反應(yīng)過 夜，向反應(yīng)物中加入無水乙醇至濃度達(dá)到80%,有大量亮黃色沉淀析出，離心棄 去上清液，沉淀加水復(fù)溶，得到帶有熒光標(biāo)記的蟲草多糖，并進(jìn)一步上 S叩hdexG-25柱純化，收集相應(yīng)水洗脫組分即第一個(gè)峰，用核酸蛋白檢測(cè)儀在 280nm下檢測(cè)有4-羥基苯乙胺的吸收峰，見圖3;并用硫酸-苯酚法測(cè)有糖含量， 用酶標(biāo)儀在450nni下測(cè)有異硫氰酸熒光素的吸收峰，見圖4。兩個(gè)圖表明蟲草多
糖已與連接臂和熒光基團(tuán)相連，收集相應(yīng)水洗脫組分，冷凍千燥保存。 實(shí)施例二步驟同實(shí)施例一
(1 )將160tng的蟲草多糖溶于6fflL的0. 2raol/L的磷酸鉀緩沖液(PH 8. 0)， 然后依次加入120mg的4-羥基苯乙胺和60mg硼氯化鈉，于3(TC培養(yǎng)箱中反應(yīng) nOh，間或振蕩，反應(yīng)完后離心分離，將上清液上SephadexG-25柱，用水洗脫， 用核酸蛋白檢測(cè)儀在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第一個(gè)峰，冷凍干燥得連有4-羥 基苯乙胺的蟲草多糖。
(2 )將16mg連有4-羥基苯乙胺的蟲草多糖溶于水，用0. 5mol/L的NaHC03 調(diào)PH至7. 5,然后加入2mg異硫氰酸熒光素，在室溫下，避光反應(yīng)過夜，向反 應(yīng)物中加入無水乙醇至乙醇濃度80%,有大量亮黃色沉淀析出，離心棄去上清液， 沉淀加水復(fù)溶，得到帶有熒光標(biāo)記的蟲草多糖，并進(jìn)一步上S印hdexG-25柱純
步驟同實(shí)施例一
O )將160mg的蟲草多糖溶于6mL的0. 2mol/L的磷酸鉀緩沖液(PH 8. 0 )， 然后依次加入160mg的4-羥基苯乙胺和60mg硼氫化鈉，于4(TC培養(yǎng)箱中反應(yīng) 48h，間或振蕩，反應(yīng)完后離心分離，將上清液上Sephadex G-25柱，用水洗脫， 用核酸蛋白檢測(cè)儀在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第一個(gè)峰，冷凍干燥得連有4-羥
基苯乙胺的蟲草多糖。
(2 )將16mg連有4-羥基苯乙胺的蟲草多糖溶于水，用0. 5mol/L的NaHC03 調(diào)PH至9，然后加入2mg異硫氰酸熒光素，在室溫下，避光反應(yīng)過夜，向反應(yīng) 物中加入無水乙醇至乙醇濃度80%,有大量亮黃色沉淀析出，離心棄去上清液， 沉淀加水復(fù)溶，得到帶有熒光標(biāo)記的蟲草多糖，并進(jìn)一步上SephdexG-25柱純 化，收集相應(yīng)水洗脫組分冷凍干燥保存。
實(shí)施例實(shí)施例四
步驟同實(shí)施例一
(1)將160mg的蟲草多糖溶于6mL的0. 2mol/L的磷酸鉀緩沖液(PH 8. 0 )， 然后依次加入130mg的4-羥基苯乙胺和60mg硼氫化鈉，于35'C培養(yǎng)箱中反應(yīng) 96h，間或振蕩，反應(yīng)完后離心分離，將上清液上Sephadex G-25柱，用水洗脫， 用核酸蛋白檢測(cè)儀在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第一個(gè)峰，冷凍干燥得連有4-羥 基苯乙胺的蟲草多糖。
(2 )將16mg連有4-羥基苯乙胺的蟲草多糖溶于水，用0. 5mol/L的Na跳 調(diào)PH至8，然后加入2mg異硫氰酸熒光素，在室溫下，避光反應(yīng)過夜，向反應(yīng) 物中加入無水乙醇至乙醇濃度80%,有大量亮黃色沉淀析出，離心棄去上清液， 沉淀加水復(fù)溶，得到帶有熒光標(biāo)記的蟲草多糖，并進(jìn)一步上S印hdexG-25柱純 化，收集相應(yīng)水洗脫組分冷凍干燥保存。 實(shí)施例五
步驟同實(shí)施例--
(1)將160mg的蟲草多糖溶于6mL的0. 2mol/L的磷酸鉀緩沖液(PH8. 0)， 然后依次加入125mg的4-羥基苯乙胺和60mg硼氫化鈉，于37。C培養(yǎng)箱中反應(yīng) 100h，間或振蕩，反應(yīng)完后離心分離，將上清液上SephadexG-25柱，用水洗脫， 用核酸蛋白檢測(cè)儀在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第一個(gè)峰，冷凍干燥得連有4-羥 基苯乙胺的蟲草多糖。
(2 )將16mg連有4-羥基苯乙胺的蟲草多糖溶于水，用0. 5mol/L的NaHC03 調(diào)PH至7. 8,然后加入2mg異硫氰酸熒光素，在室溫下，避光反應(yīng)過夜，向反 應(yīng)物中加入無水乙醇至乙醇濃度80%,有大量亮黃色沉淀析出，離心棄去上清液， 沉淀加水復(fù)溶，得到帶有熒光標(biāo)記的蟲草多糖，并進(jìn)一步上S印hdexG-25柱純
7化，收集相應(yīng)水洗脫組分冷凍干燥保存。 實(shí)施例六
步驟同實(shí)施例一
(1 )將160mg的蟲草多糖溶于6mL的0. 2mol/L的磷酸鉀緩沖液(PH 8. 0 ), 然后依次加入140rag的4-羥基苯乙胺和60mg硼氫化鈉，于32。C培養(yǎng)箱中反應(yīng) 60h,間或振蕩，反應(yīng)完后離心分離，將上清液上Sephadex G-25柱，用水洗脫， 用核酸蛋白檢測(cè)儀在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第一個(gè)峰，冷凍干燥得連有4-羥 基苯乙胺的蟲草多糖。
(2)將16mg連有4-羥基苯乙胺的蟲草多糖溶于水，用0. 5mol/L的NaHC03 調(diào)PH至8. 7，然后加入2mg異硫氰酸熒光素，在室溫下，避光反應(yīng)過夜，向反 應(yīng)物中加入無水乙醇至乙醇濃度80%,有大量亮黃色沉淀析出，離心棄去上清液， 沉淀加水復(fù)溶，得到帶有熒光標(biāo)記的蟲草多糖，并進(jìn)一步上SephdexG-25柱純 化，收集相應(yīng)水洗脫組分冷凍干燥保存。 實(shí)施例七
步驟同實(shí)施例一
(1 )將160mg的蟲草多糖溶于6mL的0. 2mol/L的磷酸鉀緩沖液(PH 8. 0 ), 然后依次加入150mg的4-羥基苯乙胺和60mg硼氫化鈉，于37'C培養(yǎng)箱中反應(yīng) 80h，間或振蕩，反應(yīng)完后離心分離，將上清液上S印hadex G-25柱，用水洗脫， 用核酸蛋白檢測(cè)儀在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第一個(gè)峰，冷凍干燥得連有4-羥
基苯乙胺的蟲草多糖。
(2 )將16rag連有4-羥基苯乙胺的蟲草多糖溶于水，用0. 5mo 1 /L的Na線 調(diào)PH至8. 3,然后加入2mg異硫氰酸熒光素，在室溫下，避光反應(yīng)過夜，向反 應(yīng)物中加入無水乙醇至乙醇濃度80%，有大量亮黃色沉淀析出，離心棄去上清液，沉淀加水復(fù)溶，得到帶有熒光標(biāo)記的蟲草多糖，并進(jìn)一步上SephdexG-25柱純 化，收集相應(yīng)水洗脫組分冷凍干燥保存。
經(jīng)分析得，蟲草多糖用異硫氰酸熒光素標(biāo)記過后，冷凍干燥，能在室溫下 保存，標(biāo)記過后不含游離的4-羥基苯乙胺和異硫氰酸熒光素。
除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡釆用等同替換或等效 變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1. 一種具有熒光性質(zhì)的蟲草多糖，其特征在于是由蟲草多糖、連接臂和熒光基團(tuán)組成的，所述蟲草多糖通過連接臂與熒光基團(tuán)連接。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有熒光性質(zhì)的蟲草多糖，其特征在于所述蟲草多 糖通過共價(jià)鍵與連接臂連接。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有熒光性質(zhì)的蟲草多糖，其特征在于所述連接臂 通過共價(jià)鍵與熒光基團(tuán)連接。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有熒光性質(zhì)的蟲草多糖，其特征在于所述連接臂 是4-羥基苯乙胺。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有熒光性質(zhì)的蟲草多糖，其特征在于所述熒光基團(tuán)是異硫氰酸熒光素。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有熒光性質(zhì)的蟲草多糖的制備方法,包括以下步驟U)在還原劑的催化作用下，將蟲草多糖溶于反應(yīng)溶劑中，加入連接臂發(fā)生 還原胺化反應(yīng)，生成蟲草多糖-連接臂復(fù)合物；(2)將反應(yīng)(1)中產(chǎn)生的仲氨基進(jìn)一步與熒光基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)，生成蟲草多糖-連接臂-熒光基團(tuán)復(fù)合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的具有熒光性質(zhì)的蟲草多糖的制備方法，其特征在于所述的還原劑是硼氫化鈉，所述的反應(yīng)溶劑是磷酸鉀緩沖溶液；所述蟲草多 糖和連接臂的比例在4: 3—1: l之間，反應(yīng)溫度為3(TC—4(TC,反應(yīng)時(shí)間 為48h—120h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的具有熒光性質(zhì)的蟲草多糖的制備方法，其特征在于 所述步驟(2)中的PH7. 5~9。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種易被檢測(cè)的蟲草多糖及其制備方法，屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。是一種具有熒光性質(zhì)的蟲草多糖，由蟲草多糖、連接臂和熒光基團(tuán)組成的，所述蟲草多糖通過連接臂與熒光基團(tuán)連接。其原理是利用蟲草多糖的還原性末端在硼氫化鈉的作用下，糖和4-羥基苯乙胺的氨基共價(jià)偶聯(lián)發(fā)生還原胺化反應(yīng)后，生成仲氨基與異硫氰酸熒光素進(jìn)行親核反應(yīng)，生成帶有熒光的糖。本發(fā)明的有益效果是通過合成方法使不帶有特殊基團(tuán)的蟲草多糖成為易于檢測(cè)的帶有熒光的多糖，在保證蟲草多糖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)不被破壞的同時(shí)也保證了蟲草多糖的抗腫瘤、抗慢性腎衰、增強(qiáng)機(jī)體免疫等生物學(xué)活性。用熒光標(biāo)記過后的蟲草多糖可以用于相應(yīng)的藥物代謝，藥理等多方面的基礎(chǔ)研究。
文檔編號(hào)C09K9/02GK101503478SQ20091002527
公開日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2009年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月5日
發(fā)明者云 凌, 唐惠玲, 尹鴻萍, 旻 王, 瑩 王 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)