專利名稱：一類基于活性的在體標記蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜熒光小分子探針的合成和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分子學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基于酶活性的化學(xué)小分子探針(Activity-based probes, ABI3S)是一種功能性的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究工具。經(jīng)典的探針包括三個部分反應(yīng)基團，連接基團與標記基團。反應(yīng)基團通常是根據(jù)靶酶的催化機理設(shè)計的一類強吸電子能力的化學(xué)小分子，它能夠與靶酶的催化中心共價結(jié)合，從而起到基于活性的標記的目的。連接基團用來隔開反應(yīng)基團與標記基團，減小合成中的空間位阻。標記基團用來示蹤，便于檢測，比如有同位素標記、熒光標記與生物素標記等。傳統(tǒng)的ABM標記目標底物的過程如下當ABM暴露在底物中處于合適的標記環(huán)境中時，有活性的底物中心會被ABP占據(jù)并結(jié)合，而非底物或者非活性的底物不能被ABP結(jié)合，這樣通過一維電泳膠分離，可以達到將底物與背景分離開的目的，再通過酶解，結(jié)合蛋白質(zhì)的質(zhì)譜技術(shù)，就可以檢測被標記的底物。ABPs的優(yōu)點主要表現(xiàn)在1)直接從功能角度切入蛋白質(zhì)研究，而不是僅對蛋白質(zhì)進行定性定量鑒定?；每蓪崿F(xiàn)基于活性的蛋白質(zhì)檢測，消除了那些沒被激活，不具有活性的蛋白質(zhì)對檢測結(jié)果的影響?；梅肿恿啃?，避免體積過大而有可能影響其在細胞內(nèi)的分布及與蛋白質(zhì)的相互作用的問題。4)實驗過程簡單，可獲得的信息量大。目前，ABPs作為一種功能性的蛋白質(zhì)組學(xué)研究工具已經(jīng)在多種酶家族中有應(yīng)用。 具體對于蛋白酪氨酸磷酸酶家族來說，其酶家族本身所具有的高分散性、高度依賴于翻譯后修飾的活性，以及較大一部分分布于細胞膜上的特點，使得其本身比較適合用這種基于活性的檢測方法。但目前，用ABP的方法研究這種酶家族的研究工作進行得相對來說比較少，而且只能在裂解液中標記。這種先將細胞裂解再與探針共孵育的方法，由于其對于活細胞的破壞作用，將丟失一部分信息，得到的信息也會存在失真狀況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決上述問題而提供了一類基于活性的在體標記蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜熒光小分子探針，該小分子探針可以實現(xiàn)在活細胞內(nèi)目標蛋白的標記。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一類基于活性的在體標記蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜熒光小分子探針，具有式I所示的結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1. 一類基于活性的在體標記蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜熒光小分子探針，其特征在于， 具有式I所示的結(jié)構(gòu)
2. 一類基于活性的在體標記蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜熒光小分子探針，其特征在于， 具有式II所示的結(jié)構(gòu)式II中，
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項所述的一類基于活性的在體標記蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜熒光小分子探針，其特征在于，所述熒光集團R為5-羧基熒光素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2任意一項所述的一類基于活性的在體標記蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜熒光小分子探針，其特征在于，所述八聚精氨酸為天然型的八聚精氨酸或者天然與非天然的雜合型八聚精氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類基于活性的在體標記蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜熒光小分子探針的合成方法，包括以下步驟1)反應(yīng)識別基團的合成及修飾從反應(yīng)起始物對氰基溴芐開始，利用液相有機合成， 得到乙基保護下的反應(yīng)識別基團，接著采用羧基活化法在其氨基端連入一個谷氨酸，反應(yīng)式如下
6.權(quán)利要求2所述的一類基于活性的在體標記蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜熒光小分子探針的合成方法，包括以下步驟1)反應(yīng)識別基團的合成及修飾從反應(yīng)起始物對氰基溴芐開始，利用液相有機合成， 得到乙基保護下的反應(yīng)識別基團，接著采用羧基活化法在其氨基端連入一個谷氨酸，反應(yīng)式如下
7.權(quán)利要求1至2任意一項所述的一類基于活性的在體標記蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜熒光小分子探針的應(yīng)用，其特征在于，所述一類基于活性的在體標記蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜熒光小分子探針I(yè)、II用于活細胞內(nèi)的目標蛋白酶的標記檢測，包括細胞外源信號刺激后的目標蛋白酶的標記檢測，以及對活細胞標記后的目標蛋白酶的純化和質(zhì)譜鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一類基于活性的在體標記蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜熒光小分子探針及其合成和應(yīng)用，屬于生物分子學(xué)領(lǐng)域。這一類基于活性的在體標記蛋白酪氨酸磷酸酶的透膜熒光小分子探針可以實現(xiàn)在活細胞內(nèi)目標蛋白的標記。
文檔編號C09K11/06GK102174318SQ20111003702
公開日2011年9月7日 申請日期2011年2月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月13日
發(fā)明者張玉慧, 潘登, 駱清銘 申請人:華中科技大學(xué)