專利名稱：用于監(jiān)控人健康的基于聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物(aie)的尿蛋白檢測(cè)裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種便攜式尿蛋白檢測(cè)裝置，其利用聚集誘導(dǎo)發(fā)光性(AIE)發(fā)光物檢測(cè)尿蛋白并且對(duì)尿樣品中的總尿蛋白進(jìn)行定量，以便監(jiān)控人的健康。尤其涉及一種利用水溶性AIE發(fā)光物檢測(cè)一種或多種尿蛋白以便測(cè)定受試對(duì)象中的靶蛋白和總尿蛋白兩者的含量的裝置。所述裝置可在家庭或臨床環(huán)境使用，用于定期監(jiān)控人的健康。
背景技術(shù)：
許多人類疾病除非到了很晚的時(shí)期，否則不容易被診斷出，因?yàn)槠渖戆Y狀不明顯。體液組分的輕微變化可意味著體內(nèi)出現(xiàn)問題，因此，檢測(cè)體液成份是尤其重要。尿通常被用作診斷學(xué)和臨床研究中的生物標(biāo)志，因?yàn)槠涫强梢詮姆乔趾π苑绞饺菀椎孬@得的體液。尿液中的蛋白質(zhì)和肽的復(fù)雜混合物可反映血清組成和腎功能。尿液中出現(xiàn)過量的蛋白質(zhì)警示出現(xiàn)了慢性病，例如糖尿病、高血壓和腎臟炎癥相關(guān)的問題等。如今，不少用于定量溶液中的蛋白質(zhì)的比色方法如布拉德福德(Brandford)和洛瑞(Lowry)分析等已經(jīng)開發(fā)。然而，這些方法一般缺乏靈敏性和準(zhǔn)確性，并且程序繁瑣。所綜述可用作每日監(jiān)控尿蛋白的大部分驗(yàn)?zāi)蚱?urine-testing dipstick)都利用浸有pH敏感性染料。對(duì)于尿中的主要蛋白質(zhì)人血清白蛋 白(HSA),驗(yàn)?zāi)蚱臋z測(cè)閾值可達(dá)到100-200mg/L,但健康人的正常尿中的蛋白質(zhì)濃度卻小于30mg/L，可見驗(yàn)?zāi)蚱黠@不夠靈敏，不足以分析腎病。因此開發(fā)對(duì)低濃度的尿蛋白進(jìn)行檢測(cè)和定量的有效方法具有臨床價(jià)值?；趦?yōu)越的功能性、靈敏性、選擇性和快速性，熒光有機(jī)物質(zhì)的蛋白質(zhì)生物傳感器已經(jīng)吸引了很多關(guān)注。常規(guī)發(fā)光物通常遇到的一個(gè)棘手問題是聚集引起的淬滅(aggregation-caused quenching ；ACQ)。當(dāng)它們分散在水性介質(zhì)中或結(jié)合于緩沖溶液中的蛋白質(zhì)上時(shí)，這些分子傾向于聚集，這會(huì)淬滅其熒光且因此極大地限制其作為生物探針的有效范圍。我們最近已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一種特別的聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE)現(xiàn)象，其與ACQ作用完全相反(美國專利號(hào)7，939，613、8，129，111和8，263，018 ;美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2012/0172296A1，其公開內(nèi)容通過引用并入本文)。與淬滅相反，聚集反使某些螺旋槳狀分子發(fā)光，使得所述分子由弱熒光團(tuán)變成強(qiáng)發(fā)光體。四苯基乙烯(TPE)是這類AIE發(fā)光物中的一種，且具有高熒光量子產(chǎn)率、易合成和易官能化的優(yōu)點(diǎn)。具有磺酸化官能團(tuán)的TPE產(chǎn)生水溶性衍生物，其可用作HSA的開啟突光探針(turn-on fluorescent probe)。在人造尿中0-100mg/L的HSA濃度范圍下，熒光強(qiáng)度線性增加，且檢測(cè)限可降至低達(dá)lmg/L。除了具有優(yōu)良的靈敏性以外，熒光團(tuán)在不同的蛋白質(zhì)和DNA中對(duì)HSA顯示極佳的選擇性。這些激動(dòng)人心的結(jié)果鼓舞我們進(jìn)一步探索其臨床應(yīng)用。在本發(fā)明中，公開了一種低成本、便攜式且技術(shù)上簡單的多路尿蛋白裝置，其基于AIE熒光技術(shù)，具有高靈敏性。所述裝置可在家庭和診所廣泛使用，以便每日監(jiān)控健康狀況。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一方面涉及一種使用AIE發(fā)光物檢測(cè)尿樣品中的靶蛋白的裝置。本發(fā)明的裝置主要包含殼體、光源、用于容納尿樣品的樣品容器、比色皿座、光檢測(cè)器、信號(hào)放大器、輸出兀件和相關(guān)集成電路。光源、比色皿座、光檢測(cè)器、信號(hào)放大器和集成電路被封閉在殼體中，所述殼體被配置成用于在對(duì)來自AIE發(fā)光物與靶蛋白的復(fù)合物的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)期間，避免來自外部光的背景信號(hào)。光源盡可能地亮，而裝置中所有元件的尺寸相對(duì)較小以便允許裝置容易攜帶。所述裝置的工作原理是利用窄帶寬光源的激發(fā)使尿樣品中的靶蛋白與AIE發(fā)光物的復(fù)合物產(chǎn)生熒光信號(hào)，并且將熒光信號(hào)與針對(duì)人造尿樣品預(yù)先確定的參比值進(jìn)行比較，以便測(cè)定尿樣品中的靶蛋白含量，從而測(cè)定總尿蛋白。所述裝置可提供對(duì)應(yīng)于靶蛋白含量的定性和定量數(shù)據(jù)輸出。對(duì)于尿蛋白的工作范圍為0-300mg/L，且檢測(cè)限值可低達(dá)5mg/L。然而，可通過調(diào)節(jié)AIE發(fā)光物的濃度調(diào)節(jié)工作范圍以使得線性范圍適合所測(cè)試的分子。本發(fā)明的第二方面涉及一種使用基于AIE發(fā)光物的原理的所述裝置來檢測(cè)尿樣品中的尿蛋白并測(cè)定總尿蛋白的方法。所述方法包含:制備含AIE化合物的溶液，將溶液預(yù)先放置在由比色皿座固定的所述裝置的樣品容器中，將尿樣品注射入樣品容器中，使容器暴露在由光源產(chǎn)生的光中，檢測(cè)從AIE發(fā)光物-靶蛋白復(fù)合物發(fā)射的熒光信號(hào)，將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電壓，測(cè)量電壓，和比較所測(cè)電壓與針對(duì)人造尿樣品在不同靶蛋白濃度下預(yù)先確定的參比值以定量尿樣品中的靶蛋白含量，和基于靶蛋白含量測(cè)定總尿蛋白。如果從熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換而來的電信號(hào)達(dá)到閾電壓，那么所述信號(hào)也可用于開啟其它輸出元件，因此可產(chǎn)生定性輸出信號(hào)，例如光信號(hào)或聲音信號(hào)。當(dāng)開始檢測(cè)熒光發(fā)射時(shí)，所述裝置的定性和定量輸出幾乎都是即時(shí)的。


圖1為本發(fā)明使用的不同水溶性AIE發(fā)光物的分子結(jié)構(gòu)。圖2: (A)化合物I (SATPE)在含不同濃度的HSA的磷酸鹽緩沖液(PBS)中的熒光(FL)光譜；⑶在475nm下FL強(qiáng)度隨HSA濃度的變化；10 =在不存在HSA的情況下的FL強(qiáng)度。插圖:SATPE與HSA的結(jié)合等溫線的線性區(qū)域。[SATPE] = 5 u M ； A ex = 350nm。圖3: (A)在人造尿和PBS緩沖液中的HSA與SATPE的結(jié)合等溫線；⑶在475nm下SATPE的FL強(qiáng)度對(duì)人造尿和PBS緩沖液中的不同蛋白質(zhì)的依賴性。[SATPE] = 5 y M ;[蛋白質(zhì)]=100 ii g/mL ;入 ex = 350nm。圖4是關(guān)于尿蛋白檢測(cè)裝置如何工作的流程圖。圖5是尿蛋白檢測(cè)裝置的集成電路的框圖。圖6是本發(fā)明中使用的UV LED光源的發(fā)射光譜。圖7是尿蛋白檢測(cè)裝置的一個(gè)實(shí)施方案的俯視圖。圖8:⑷電壓對(duì)尿蛋白裝置的人造尿與SATPE混合物中的不同HSA濃度的依賴性；(B)針對(duì)人造尿中的不同HSA濃度標(biāo)準(zhǔn)化的電壓。[SATPE] = IOmM
具體實(shí)施例方式定義提供以下定義以用于理解本發(fā)明的主題并用于構(gòu)成隨附專利權(quán)利要求書。應(yīng)理解，除非上下文另有明確指示，本說明書和隨附權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式“一”和“所述”包括復(fù)數(shù)個(gè)參考對(duì)象?！熬奂T導(dǎo)發(fā)光”或縮寫“ALE”意思是在聚集體形成時(shí)或在固態(tài)下熒光/磷光被開啟。當(dāng)在分子水平上溶解時(shí)，具有這種性質(zhì)的物質(zhì)無發(fā)光性。然而，當(dāng)分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限時(shí)，發(fā)光開啟。“聚集引起的淬滅”或縮寫“ACQ”意思是在聚集體形成時(shí)或在固態(tài)下熒光/磷光被淬滅。當(dāng)發(fā)光物在分子水平上溶解在溶液中時(shí)，其可以發(fā)光。

“發(fā)射強(qiáng)度”意思是通常從熒光分光計(jì)、熒光顯微測(cè)量裝置獲得的熒光/磷光的量值。除非另外定義，否則本文所用的所有科學(xué)技術(shù)術(shù)語的含義與本發(fā)明描述的主題所屬的領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常所了解的含義相同。除非另外說明，否則本申請(qǐng)所用的所有化學(xué)物質(zhì)都購自Sigma-Aldrich。在臨近使用前在干燥氮?dú)庀聫亩郊淄视位c(sodium benzophenone ketyl)中蒸懼THF。水通過Millipore過濾系統(tǒng)進(jìn)行純化。人造尿是制備得到并在臨近使用前在高壓鍋中消毒。在Bruker AV 300分光計(jì)上，使用四甲基硅烷(TMS，6 = 0)作為內(nèi)標(biāo)在⑶Cl3中測(cè)量1H和13C NMR光譜。高分辨率質(zhì)譜(HRMS)記錄在以MALD1-T0F模式工作的GCT premierCAB048質(zhì)譜儀上。發(fā)射光譜記錄在Perkin-Elmer LS 55熒光分光計(jì)上。術(shù)語“發(fā)光物”和“熒光團(tuán)”在本文中可互換使用，指能夠在峰值約350_355nm的UV光的激發(fā)下，發(fā)射約470-475nm熒光信號(hào)的AIE化合物的熒光染料。本發(fā)明的水溶性AIE發(fā)光物具有以下任一種化學(xué)式的骨架:
權(quán)利要求
1.一種便攜式尿蛋白檢測(cè)裝置，其使用水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物檢測(cè)和定量尿樣品中的總尿蛋白，所述裝置包含隔光的殼體、光源、樣品容器、比色皿座、光檢測(cè)器、信號(hào)放大器、多個(gè)輸出兀件和相關(guān)集成電路， 其中所述光源、所述比色皿座、所述光檢測(cè)器、所述信號(hào)放大器和相關(guān)集成電路被封閉在所述殼體中以便在所述檢測(cè)期間與外部光隔絕； 所述光源為LED光源，其能夠產(chǎn)生具有窄帶寬的光，所述窄帶寬的光與所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物的激發(fā)波長匹配，且位于所述聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物的發(fā)射光譜之外； 所述樣品容器被配置成用于容納所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物和所述尿樣品的混合物，并暴露于所述光源時(shí)發(fā)射熒光； 所述比色皿座被配置成用于固定所述樣品容器的位置； 所述光檢測(cè)器被配置成用于檢測(cè)熒光信號(hào)并將所述熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，所述熒光信號(hào)是由所述樣品容器中的所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物和所述尿樣品在暴露于所述光源的情況下發(fā)射的；和 所述信號(hào)放大器被配置成用于將電信號(hào)放大到0-9V ； 所述電壓比較器配置成設(shè)定閥電壓，用于與通過所述信號(hào)放大器放大的電信號(hào)比較，以確定所述輸出元件是否被開啟，和/或所述放大的電信號(hào)的量值是否可通過所述輸出元件定量地測(cè)量；和 所述輸出元件被配置成定性和/或定量反映樣品中尿蛋白的水平。
2.根據(jù)權(quán) 利要求1所述的裝置，其中所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物包括以下任一種化學(xué)式的骨架: R1 IIIHI 其中R1獨(dú)立地被化合物(X)nSOfNa+取代，且其中X選自烷基、不飽和烷基、雜烷基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、芳基或雜芳基，且其中n = 0到20。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其中所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物能夠與所述靶尿蛋白相互作用，以便產(chǎn)生通過儀器可檢測(cè)的熒光發(fā)射和可見顏色。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的裝置，其中所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物包括以下任一種化學(xué)式:
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的裝置，其中所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物對(duì)人血清白蛋白具有特異性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述光源為UVLED光源，其產(chǎn)生的UV光具有330nm到390nm帶寬且其峰值約在350nm，這與所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物的激發(fā)波長匹配。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的裝置，其中當(dāng)所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物在暴露于所述光源下與所述尿蛋白相互作用時(shí)，所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物在約475nm下具有最大發(fā)射強(qiáng)度。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述樣品容器的尺寸為IcmXIcmX 5cm且最大體積為約5mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述樣品容器由塑料制成并且是一次性的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述相關(guān)集成電路包含用于控制所述光源的開啟和關(guān)閉的光源部分、用于接收來自所述光檢測(cè)器的熒光信號(hào)并將所述熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)的樣品和檢測(cè)部分、用于控制所述信號(hào)放大器的信號(hào)處理部分、和用于接收電壓并開啟所述輸出元件的輸出部分。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述輸出元件包含一個(gè)或多個(gè)發(fā)光裝置、發(fā)聲裝置和電壓計(jì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其尺寸為約162mmX124mmX80mm。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其凈重小于1.5kg。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物對(duì)于所述尿蛋白的工作范圍是0-300mg/L。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的裝置，其中所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物對(duì)于所述尿蛋白的檢測(cè)限是約5mg/L。
16.根據(jù)權(quán)利要求4所述的裝置，其中當(dāng)所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物與所述尿樣品中的人血清白蛋白相互作用時(shí)，所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物能夠在約475nm下發(fā)射最大熒光信號(hào)，且具有約InM的檢測(cè)限。
17.一種用于基于水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物測(cè)定尿樣品中總尿蛋白的方法，其包括: 制備含有所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物的溶液； 將所述溶液預(yù)先放置到樣品容器中，所述樣品容器安裝在比色皿座上； 將所述尿樣品注入預(yù)先放置有所述溶液的所述樣品容器中； 將容納所述溶液與所述尿樣品的混合物的所述樣品容器暴露于由光源產(chǎn)生的約355nm的UV光； 檢測(cè)從所述溶液與所述尿樣品的混合物發(fā)射的約475nm的熒光信號(hào)； 將所述熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)并將所述電信號(hào)放大成可檢測(cè)的電壓； 測(cè)量所述電壓，并將所述電壓與從具有不同濃度靶蛋白的參比樣品記錄的預(yù)定電壓進(jìn)行比較，以便測(cè)定所述尿樣品中所述靶蛋白的含量；和 基于所述尿樣品中所述靶蛋白的含量來測(cè)定所述總尿蛋白。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中當(dāng)所述電壓超過閾電壓時(shí)，所述電壓另外開啟其它輸出裝置以產(chǎn)生輸出信號(hào)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法,其中所述輸出信號(hào)選自發(fā)光或聲音或人可察覺的任何信號(hào)。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中從所述預(yù)先放置到所述檢測(cè)是在隔光的環(huán)境或隔室中進(jìn)打。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述水溶性的聚集誘導(dǎo)發(fā)光性發(fā)光物包括以下任一種化學(xué)式:
全文摘要
本發(fā)明涉及一種便攜式尿蛋白檢測(cè)裝置，其利用聚集誘導(dǎo)發(fā)光性(AIE)發(fā)光物檢測(cè)一種或多種尿蛋白并且對(duì)尿樣品中的總尿蛋白進(jìn)行定量以便監(jiān)控人的健康。尤其涉及一種裝置，該裝置利用水溶性AIE發(fā)光物檢測(cè)一種或多種尿蛋白聚集體以便測(cè)定受試對(duì)象中的靶蛋白和總尿蛋白兩者的含量。所述裝置可在家庭或臨床環(huán)境使用，用于定期監(jiān)控人的健康。
文檔編號(hào)C09K11/06GK103196874SQ20131000111
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者唐本忠, 林榮業(yè), 郭子健 申請(qǐng)人:納米及先進(jìn)材料研發(fā)院有限公司