用于檢測活性氧的經(jīng)修飾的結(jié)合核酸的花青染料的制作方法
【專利摘要】本文中公開了用于通過常規(guī)熒光顯微術(shù)、熒光光譜法、流式細胞計量術(shù)和/或高容量成像法來檢測活性氧(ROS)的化合物、組合物、方法和試劑盒。本文中公開的化合物是新的還原的結(jié)合核酸的花青染料，所述染料是用于在體外和/或在體內(nèi)在細胞中檢測ROS和測量氧化性應激的探針。本文還描述了用于制備用在公開的組合物、方法和試劑盒中的新還原染料(即，ROS探針)的方法。
【專利說明】用于檢測活性氧的經(jīng)修飾的結(jié)合核酸的花青染料
[0001]巧關申請的簾叉引巧
[0002] 本申請要求2012年3月30日提交的美國臨時申請系列號61/617,862的優(yōu)先權(quán) 權(quán)益，其通過引用整體并入本文。

【技術(shù)領域】
[0003] 本發(fā)明涉及可用于檢測活性氧（R0巧的探針，特別是還原的結(jié)合核酸的花青染料 探針，W及該樣的探針在體外或在體內(nèi)的用途。

【背景技術(shù)】
[0004] 氧化性應激源于活性氧（R0巧的產(chǎn)生和細胞的清除該樣的自由基的能力之間的 失衡。氧化性應激可W由許多不同的固有和非固有途徑造成，由線粒體呼吸或者由膜結(jié)合 的NADPH氧化酶介導。R0S在幾種疾病的進展中起重要作用，所述疾病包括、但不限于炎癥、 動脈粥樣硬化、老化和年齡相關的變性障礙?？蒞檢測血清樣品、活組織外植體、細胞培養(yǎng) 物中和體內(nèi)的R0S的探針具有用于醫(yī)學診斷和研究工具的潛在用途，用于診斷WR0S產(chǎn)生 增加為特征的疾病。
[0005] 成像術(shù)會實現(xiàn)在相同細胞中對與細胞毒性和細胞死亡相關的不同參數(shù)的多路分 析、定位和定量。因此，通過常規(guī)英光顯微術(shù)、英光光譜法、流式細胞計量術(shù)和/或高容量成 像法來檢測R0S，相對于其它技術(shù)而言可能是有利的。超氧化物和輕基自由基諸如二氨己巧 值肥）的英光傳感器已經(jīng)被用作R0S探針。但是，由于其自發(fā)性自氧化、快速光漂白、高毒 性和與R0S的多種反應產(chǎn)物，D肥具有有限的適用性。此外，D肥的較低發(fā)射波長使得它的 體內(nèi)應用是有問題的。二氨羅丹明值皿）是已經(jīng)被研究用于檢測R0S的另一種還原染料， 其遭受高氧化速率，由此限制了它的應用。迄今開發(fā)的作為R0S探針的還原花青染料（其 基于切3/切5/切7)在不同程度上遭受溶解度問題和/或自氧化?；谫囁岽椎娜玖弦惨?經(jīng)被研究用作R0S探針。該些探針（通常需要費時且昂貴的多步合成規(guī)程）會經(jīng)歷快速水 解，由此限制了它們的應用。
[0006] 因而，需要用于檢測R0S的探針，其適合用于體外或體內(nèi)應用，其不會遭受現(xiàn)有技 術(shù)R0S探針的限制，諸如它們的發(fā)生由氧和/或光催化的自發(fā)性自氧化并伴隨產(chǎn)生高水平 的背景英光的趨勢。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本文描述了通過例如常規(guī)英光顯微術(shù)、英光光譜法、流式細胞計量術(shù)和/或高容 量成像法來檢測活性氧（R0巧的還原染料化合物、組合物、方法和試劑盒。本文中公開的還 原染料化合物是新的還原的結(jié)合核酸的花青染料，所述染料是用于在體外或在體內(nèi)在細胞 中檢測R0S和測量氧化性應激的探針。該些探針可W與其它活細胞染料一起用于多路應用 中，使得它們可用于測量細胞毒性和細胞死亡的多種生物標志物，且可W用于評價由不同 試劑在多種活細胞模型中產(chǎn)生的R0S，所述試劑包括、但不限于脂多糖、甲蔡釀、血管緊張素 II、奈法哇麗、離子霉素和谷氨酸鹽。
[0008] 與對應的氧化染料相比，本文中公開的還原的結(jié)合核酸的花青染料（其通常是膜 可透過的且因此可W在細胞中積累）不能結(jié)合核酸并且?guī)缀醪槐憩F(xiàn)出或根本不表現(xiàn)出英 光。在與R0S發(fā)生細胞內(nèi)反應（即，檢測R0巧W后，本文中公開的還原染料被氧化，由此提 供W高親和力結(jié)合核酸的花青染料，其在暴露于足夠波長的光W后具有顯著的英光強度。 圖1顯示了使用喔哇澄（TO)作為一個例子，用還原的結(jié)合核酸的花青染料進行細胞內(nèi)R0S 檢測的示意圖。還原的喔哇澄（還原的TO)跨過細胞膜W進入細胞，在此處它可W被R0S 氧化W釋放W高親和力結(jié)合核酸的染料（TO)并發(fā)射亮綠色英光。與例如針對線粒體膜電 位、質(zhì)膜滲透性和/或天冬氨酸特異性半脫氨酸蛋白酶活化的探針組合的本文中公開的還 原染料也可W用于區(qū)分肝毒性化合物與無毒化合物。本文還描述了制備用在本發(fā)明的公開 的組合物、方法和試劑盒中的新還原染料（即R0S探針）的方法。
[0009] 在某些實施方案中，提供了具有結(jié)構(gòu)式（I)的新還原染料化合物（即，R0S探針）：
[0010]

【權(quán)利要求】
1. 一種具有結(jié)構(gòu)式（I)的還原染料化合物：
其中 每個R1可以相同或不同，獨立地為：H A-C6烷基；三氟甲基；鹵素；-OR8、-SR8 或-(NR8R9)，其中R8和R9可以相同或不同，獨立地為：H A-C6烷基；或1-2個脂環(huán)族、雜脂 環(huán)族、芳族或雜芳族環(huán)，其具有共計3-16個環(huán)原子，其中雜原子是0、N或S ;或者R8和R9組 合形成-(CH2) 2-L- (CH2) 2_，其中 L 是：單鍵；-CH2- ; -0-;或-NRltl，其中 Rltl 是 H 或 C1-C6 烷基； t 是 1、2、3 或 4 ; R2是飽和的或不飽和的C1-C6烷基； X是0;S ;Se ;NR15,其中R15是!!或心、烷基；或CR16R17,其中R 16和R17可以相同或不 同，獨立地為H或C1-C6烷基，或者R16和R17的碳組合形成5或6元飽和環(huán)； Q具有式Ql或Q2 :
其中 Y 是-CR3 = CR4-; p和m是0或1,使得p+m = 1 ; R5是C1-C6烷基、C1-C6烯基、C 1-C6多烯基、C1-C6炔基或C1-C 6多炔基；或OMEGA ; R3、R4、R6和R7可以相同或不同，各自獨立地為：H浪素 A-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C 6多 烯基、C1-C6炔基或C1-C6多炔基；-OR 8「SR8 (NR8R9)，如前面所定義「0S02R19,其中R 19是 C1-C6烷基、C1-C6全氟烷基或芳基；或OMEGA ;或R6和R7組合形成-(CH2)v-,其中V是3或 4,或R6和R7形成根據(jù)式Q2的稠合芳族環(huán)； R11、R12、R13和R14可以相同或不同，各自獨立地為：H A1-C6烷基、C1-C6烯基、C1-C 6多烯 基、C1-C6炔基或C1-C6多炔基適素 ；OMEGA ;或-OH、-OR8、-SR8或-(NR8R9)，如前面所定義； OMEGA是飽和的或不飽和的、被取代的或未被取代的環(huán)狀取代基，所述環(huán)狀取代基具有 在1-2個脂環(huán)族、雜脂環(huán)族、芳族或雜芳族環(huán)中的共計2-16個環(huán)碳原子，含有1-4個雜原 子，其中所述雜原子是〇、N或S，所述環(huán)狀取代基是未被取代的或任選地被以下取代基獨 立地取代一次或多次：齒素、烷基、全氟烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或羧基烷 基，具有1-6個碳，和所述環(huán)狀取代基作為R 3、R4、R5、R11、R12、R 13或R14通過單鍵來連接，并 且:其中!?3、!?4、!? 5、!?11、!?12^^!?14* 的超過一個是0MEGA，每個OMEGA任選地相同或不同； R2°、R21和R22獨立地為：H、C1-C 6烷基、C3-Cltl環(huán)烷基、芳基或雜芳基； W是處于R或S構(gòu)型的H或D ;且 η 是 0、1、2 或 3。
2. -種具有結(jié)構(gòu)式（II)的還原染料化合物：
其中 每個R1可以相同或不同，獨立地為：H A1-C6烷基；三氟甲基；鹵素；-OR8、-SR8 或-(NR8R9)，其中R8和R9可以相同或不同，獨立地為：H A-C6烷基；或1-2個脂環(huán)族、雜脂 環(huán)族、芳族或雜芳族環(huán)，其具有共計3-16個環(huán)原子，其中雜原子是0、N或S ;或者R8和R9組 合形成-(CH2) 2-L- (CH2) 2_，其中 L 是：單鍵；-CH2- ; -0-;或-NRltl，其中 Rltl 是 H 或 C1-C6 烷基； t 是 1、2、3 或 4 ; R2是飽和的或不飽和的C1-C6烷基； R5是：具有1-6個碳的烷基、烯基、多烯基、炔基或多炔基；或OMEGA ; R3、R4、Rn、R12、R13和R 14各自獨立地是：Η;鹵素；具有1-6個碳的烷基、烯基、多烯基、炔 基或多炔基；-OR8 ;_SR8 (NR8R9)，如前面所定義；-OSO 2R19,其中R19是C1-C6烷基、C 1-C6全氟 烷基或芳基；或OMEGA ; OMEGA是飽和的或不飽和的、被取代的或未被取代的環(huán)狀取代基，所述環(huán)狀取代基具有 在1-2個脂環(huán)族、雜脂環(huán)族、芳族或雜芳族環(huán)中的共計2-16個環(huán)碳原子，含有1-4個雜原 子，其中所述雜原子是〇、N或S，所述環(huán)狀取代基是未被取代的或任選地被以下取代基獨 立地取代一次或多次：齒素、烷基、全氟烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、烷氧基或羧基烷 基，具有1-6個碳，和所述環(huán)狀取代基作為R 3、R4、R5、R11、R12、R 13或R14通過單鍵來連接，并 且，其中R3、R4、R5、R11、R12、R 13和R14中的超過一個是OMEGA，每個OMEGA任選地相同或不同； X是0;S ;Se ;NR15,其中R15是!!或心、烷基；或CR16R17,其中R 16和R17可以相同或不 同，獨立地為H或C1-C6烷基，或者R 16和R17的碳組合形成5或6元飽和環(huán)； R2°、R21和R22獨立地為：H、C1-C 6烷基、C3-Cltl環(huán)烷基、芳基或雜芳基； W是處于R或S構(gòu)型的H或D ;且 η 是 0、1、2 或 3。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有結(jié)構(gòu)式（VIII):
其中W是H或D，且η是0、1或2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有結(jié)構(gòu)式（IX):
其中W是H或D，且η是0、1或2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有結(jié)構(gòu)式（X):
其中W是H或D，且η是0、1或2。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述化合物具有結(jié)構(gòu)式（XI):
其中W是H或D，且η是0、1或2。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的化合物，其中： R2是甲基或乙基； R4是C1-C6烷基； R5是苯基； X是S ;且 η是O。
8. -種還原染料化合物，其選自： (Z)-2-((2-丁基-1-苯基喹啉-4 (IH)-亞基）甲基）-3-甲基-2, 3-二氫苯并[d]噻 唑； (Z)-2-( (2-丁基-1-苯基喹啉-4 (IH)-亞基）甲基）-3-甲基-2-氘-3-氫苯并[d] 噻唑； (Z)-3-甲基-2-((1-丙基喹啉-4 (IH)-亞基）甲基）-2, 3-二氫苯并[d]噻唑； (Z)-2-((2-甲氧基-1-苯基喹啉-4 (IH)-亞基）甲基）-3-甲基-2, 3-二氫苯并[d] 噻唑； (2)，1，附-二甲基，3-(4-((3-甲基-2,3-二氫苯并[(1]噻唑-2-基）亞甲基）-1-苯 基-1，4-二氫喹啉_2_基）-N3-丙基丙燒-1，3-二胺； N-乙基-N-(4-((Z)-4-((E)-3-(2-甲基-2,3-二氫苯并[d]噻唑-2-基）亞丙烯 基）-1-苯基-1，4-二氫喹啉-2-基）芐基）乙胺；和 N-乙基-N-(4-((Z)-1-甲基-4-((E)-3-(3-甲基-2, 3-二氫苯并[d]噻唑-2-基）亞 丙烯基）-1，4-二氫喹啉-2-基）芐基）乙胺。
9. 一種用于檢測活性氧（ROS)的組合物，所述組合物包含： a) -種或多種還原染料；和 b) 載體， 其中所述還原染料是根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任一項所述的化合物，且以在與ROS反應 后有效地檢測ROS的存在的量存在。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述組合物適合用于體外應用。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述組合物適合用于體內(nèi)應用。
12. -種檢測樣品中的活性氧（ROS)的方法，所述方法包括下述步驟： a) 使所述樣品與有效量的一種或多種根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任一項所述的還原染料 化合物接觸；和 b) 確定所述還原染料化合物是否已經(jīng)被氧化。
13. -種檢測樣品中的活性氧（ROS)的方法，所述方法包括下述步驟： a) 使所述樣品與有效量的根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物接觸；和 b) 確定所述還原染料化合物是否已經(jīng)被氧化。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中所述樣品包括細胞、組織、生物流體或其組 合。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中通過熒光光譜法檢測所述還原染料化合物 的氧化。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中通過熒光顯微術(shù)檢測所述還原染料化合物 的氧化。
17. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中通過共焦激光掃描熒光顯微術(shù)檢測所述還 原染料化合物的氧化。
18. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中通過全內(nèi)部反射熒光顯微術(shù)檢測所述還原 染料化合物的氧化。
19. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中所述活性氧（ROS)的檢測用于診斷選自 以下的疾病或障礙：頸動脈損傷、動脈粥樣硬化、高血壓、癌癥、以炎癥為特征的疾病和障 礙、輻射誘導的晚期正常組織損傷；由化療引起的組織損傷、缺血或移植后的再灌注；糖尿 病諸如I型糖尿?。═lD)，神經(jīng)變性疾病諸如阿爾茨海默氏病、帕金森病、肌萎縮性側(cè)索硬 化（ALS)和亨廷頓??；腦血管疾病、囊性纖維化、慢性腎臟疾病、心血管疾病、先兆子癇、眼 科疾病、及其組合。
20. -種用于檢測樣品中的活性氧（ROS)的試劑盒，所述試劑盒包含： a) -種或多種根據(jù)權(quán)利要求1-8中的任一項所述的還原染料化合物；和 b) -個或多個容器。
21. -種用于檢測樣品中的活性氧（ROS)的試劑盒，所述試劑盒包含： a) 根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物；和 b) -個或多個容器。
22. 根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包含關于執(zhí)行測定的說明 書，所述測定用于檢測一種或多種活性氧（ROS)。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的試劑盒，其中所述測定在體內(nèi)或在體外進行。
24. -種用于檢測樣品中的活性氧（ROS)的試劑盒，所述試劑盒包含： a) -種或多種具有結(jié)構(gòu)式（III)的未反應的花青染料化合物：
b) -種或多種還原劑；和 c) 一個或多個容器； 其中R1、R2、R2°、R21、R22、Q、X、η和t如在權(quán)利要求1中所定義。
25. -種用于檢測樣品中的活性氧（ROS)的試劑盒，所述試劑盒包含： a) -種或多種具有結(jié)構(gòu)式（IV)的未反應的花青染料化合物：
b) -種或多種還原劑；和 c) 一個或多個容器； 其中 R1、R2、R3、R4、R5、R 11、R12、R13、R14、R2°、R 21、R22、X、t 和 η 如在權(quán)利要求 2 中所定義。
26. 根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包含關于執(zhí)行測定的說明 書，所述測定用于檢測一種或多種活性氧（ROS)。
27. 根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包含關于制備一種或多種 還原染料化合物的說明書。
28. 根據(jù)權(quán)利要求24或25所述的試劑盒，其中所述一種或多種還原劑選自：LiAlH4、 NaBH4、Zn (BH4) 2、NaD、LiAlD4、NaBD4、Zn (BD4) 2、含有 Sn2+ 離子的化合物、亞硫酸鹽化合物、二 異丁基氫化鋁（DIBAH)、草酸、甲酸、抗壞血酸、亞磷酸鹽、連二磷酸鹽、連二磷酸、二硫蘇糖 醇（DTT)和含有Fe 2+離子的化合物。
29. -種用于制備具有結(jié)構(gòu)式（I)的還原染料化合物的方法，
所述方法包括： a)使具有結(jié)構(gòu)式（III)的花青化合物與還原劑反應， 其中：
〇、1、父、1?1、1?2、1?2°、1?21、1? 22、11和七如在權(quán)利要求1中所定義。
30. -種用于制備具有結(jié)構(gòu)式（II)的還原染料化合物的方法：
所述方法包括： a)使具有結(jié)構(gòu)式（IV)的花青化合物與還原劑反應，
其中： W、X、R1、R2、R3、R4、R5、R 11、R12、R13、R14、R2°、R 21、R22、η 和 t 如在權(quán)利要求 2 中所定義。
31. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中： X是S或O ; R2是甲基或乙基； R4是C1-C6烷基； R5是苯基；且 η是O。
32. 根據(jù)權(quán)利要求29-31中的任一項所述的方法，其中所述還原劑選自：LiAlH4、NaBH4、 Zn (BH4) 2、LiAlD4、NaBD4、Zn (BD4)2、含有Sn2+離子的化合物、亞硫酸鹽化合物、二異丁基氫化 鋁（DIBAH)、草酸、甲酸、抗壞血酸、亞磷酸鹽、連二磷酸鹽、連二磷酸、二硫蘇糖醇（DTT)和 含有Fe 2+離子的化合物。
33. 根據(jù)權(quán)利要求29-31中的任一項所述的方法，其中所述還原劑是NaBH4 *NaBD4。
【文檔編號】C09B23/02GK104395407SQ201380017402
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月30日
【發(fā)明者】胡義鎮(zhèn), 陳愛梅, H.C.康, K.吉, B.曼達維利 申請人:生命科技公司