專利名稱：酶促化學發(fā)光反應的新型增強劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于酶促化學發(fā)光反應增強劑的用途。
由發(fā)光劑，氧化劑和催化劑組成的發(fā)光體系很久以來一直被廣泛應用于諸多領域，近年來，隨著化學發(fā)光免疫分析技術的發(fā)展，基于HRP催化魯米諾-H2O2化學發(fā)光體系的化學發(fā)光酶免疫分析技術發(fā)展很快，但HRP直接催化的靈敏度很低，無法用于檢測微量的蛋白及核酸。直至八十年代中后期，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了二類可以達到增強其發(fā)光增強的物質，才使這項技術迅速地應用到基因分析及免疫檢測領域，一類是6-羥基苯并噻唑及其衍生物，它們當中有些本身就是熒光物質，如螢火蟲熒光素等。另一類是具有對位取代基的酚類，如對碘苯酚，對苯基苯酚等。這兩類物質的增強發(fā)光作用極高，而且還可大大降低氧化劑與發(fā)光劑等單獨作用時出現(xiàn)的本底發(fā)光，同時可將發(fā)光時間延長至幾小時。因此它們被廣泛地應用到免疫化學發(fā)光分析中。
英國Wolfson研究室發(fā)現(xiàn)了一系列的化合物能夠增強HRP催化魯米諾化學發(fā)光，且發(fā)光信號穩(wěn)定。這一成果于80年代末開始應用，所用的增強劑有熒光素，噻唑，對碘苯酚等。專利87-251511(Phenols asenhancers of the chemiluminescent)，90-101018(Chemiluminescenceenhancer)，對碘苯酚增強化學發(fā)光測定HRP及其標記物靈敏度很高，使用最多。這些增強劑都具有類似的結構，即具有幾個取代基團的芳香環(huán)化合物。
本發(fā)明的目的是提供酶促化學發(fā)光反應的新型增強劑。該增強劑在結構和特性方面不同于目前普遍采用的增強劑，是由中心原子硼及四個苯環(huán)配位所組成。
本發(fā)明提供的酶促化學發(fā)光反應的新型增強劑具有如下基本結構
其中，R＝H，F(xiàn)，Cl，Br，I，NO2，羥基，烷基，烷氧基；M＝Na+，K+。四苯硼鈉純物質為無色結晶，易溶于水而形成澄清的無色溶液。由于其具有多個苯環(huán)形成離域大π鍵，使電子傳遞更加容易。因此將其用作HRP催化魯米諾-過氧化氫化學發(fā)光反應的增強劑。在探討四苯硼鈉的增強發(fā)光機理時發(fā)現(xiàn)，采用四苯硼鈉為增強劑的體系的發(fā)光光譜及發(fā)射光譜與無增強劑體系的一致，但反應的激發(fā)光譜發(fā)生了改變。同時為了比較，也測定了對苯基苯酚的發(fā)光光譜、發(fā)射光譜和激發(fā)光譜。
已有專利報道過的各種不同的增強劑體系，他們雖然在增強效果上各不相同，但他們的激發(fā)光譜，發(fā)射光譜和發(fā)光光譜性質基本相似，這是由于他們的增強發(fā)光作用的機理相同。四苯硼鈉與上述體系雖然其發(fā)光光譜和發(fā)射光譜具有相同的特征，但激發(fā)光譜明顯不同，說明了其激發(fā)發(fā)光過程具有不同的歷程，這歸結為結構上的不同即四苯硼納具有多個苯環(huán)形成的共軛大π鍵，使電子傳遞更加容易。
增強劑四苯硼鈉的最佳濃度，增強化學發(fā)光作用，介質對增強發(fā)光的影響以及發(fā)光反應體系的最適魯米諾濃度和過氧化氫濃度為四苯硼鈉的最佳濃度在0.1-60mmol/L之間，pH值在7.0-9.0范圍內，魯米諾濃度在1×10-3-1×10-5mmol/L，過氧化氫濃度在10-2-10-4mmol/L時發(fā)光取得最大。
四苯硼鈉類增強劑可應用于辣根過氧化物酶催化魯米諾-過氧化氫化學發(fā)光反應體系。使用四苯硼鈉作為增強劑設計了用于免疫化學發(fā)光分析的試劑盒，其中包括魯米諾，過氧化氫，四苯硼鈉，包被有抗體的酶聯(lián)反應板，標準抗原，酶標抗體或酶標鏈酶親和素，生物素化抗體等。
這種新的增強劑的發(fā)現(xiàn)，可以導致一類具有類似結構的增強劑的開發(fā)和應用。隨著這類增強劑的使用，為辣根過氧化物酶的測定及其酶標記的化學發(fā)光酶免疫分析提供了新的測定體系。該增強劑易溶于水，不同于酚類等有機物質需溶解于有機溶劑，這在測定、保存和試劑盒開發(fā)中具有特殊的優(yōu)勢。
本發(fā)明提供的實施例如下實施例1利用四苯硼鈉作為發(fā)光反應增強劑測定甲狀腺素(T4)。
1).包板用純化的T4抗體包被微孔反應板，制成固相抗體。
用0.1mol/LpH9.6的碳酸鹽緩沖液將T4抗體稀釋到10μg/ml，取100μl加入微孔中，密封后4℃過夜。次日用0.01mol/LpH7.4 PBS洗滌三次，加0.01mol/LpH7.4 PBS，37℃封閉30min，用0.2mol/L pH8.6硼酸-硼砂緩沖液洗滌3次備用。
2).測定將板用洗滌液洗3次，甩去余液。在對照孔，標準孔和待測樣品孔分別加入空白液，標準液和待測樣品50μl，標記物100μl.充分搖勻37℃1小時，洗板5次，甩干。每孔依序加入新鮮配制的魯米諾工作液50μl，過氧化氫50μl，四苯硼納50μl。立即置于發(fā)光分析儀上檢測發(fā)光強度，測量時間約1秒。測定靈敏度為4.0μg/dL。
實施例2利用四苯硼鈉作為發(fā)光反應增強劑測定胰島素。
1).包板用純化的豚抗胰島素抗體包被微孔反應板，制成固相抗體。
用0.1mol/LpH9.6的碳酸鹽緩沖液將豚抗胰島素抗體稀釋到10μg/ml，取100μl加入微孔中，密封后4℃過夜。次日用0.01mol/L pH7.4PBS洗滌三次，加0.01mol/LpH7.4 PBS，37℃封閉30min，用0.2mol/LpH8.6硼酸-硼砂緩沖液洗滌3次備用。
2).測定將板用洗滌液洗3次，甩去余液。在對照孔，標準孔和待測樣品孔分別加入空白液，標準液和待測樣品50μl，標記物100μl.充分搖勻37℃ 1小時，洗板5次，甩干。每孔依序加入新鮮配制的魯米諾工作液50μl，過氧化氫50μl，四苯硼納50μl。立即置于發(fā)光分析儀上檢測發(fā)光強度，測量時間約1秒。測定靈敏度為0.1ng。
實施例3利用四苯硼鈉作為發(fā)光反應增強劑測定三碘甲腺原氨酸(T3)1).包板用純化的T3抗體包被微孔反應板，制成固相抗體。
用0.1mol/L pH9.6的碳酸鹽緩沖液將T3抗體稀釋到10μg/ml，取100μl加入微孔中，密封后4℃過夜。次日用0.01mol/L pH7.4 PBS洗滌三次，加0.01mol/L pH7.4 PBS，37℃封閉30min，用0.2mol/L pH8.6硼酸-硼砂緩沖液洗滌3次備用。
2).測定將板用洗滌液洗3次，甩去余液。在對照孔，標準孔和待測樣品孔分別加入空白液，標準液和待測樣品50μl，標記物100μl.充分搖勻37℃ 1小時，洗板5次，甩干。每孔依序加入新鮮配制的魯米諾工作液50μl，過氧化氫50μl，四苯硼納50μl。立即置于發(fā)光分析儀上檢測發(fā)光強度，測量時間約1秒。測定靈敏度為25ng/dL。
權利要求
1.一種酶促化學發(fā)光反應的新型增強劑，其特征在于具有如下結構
其中，R＝H，F(xiàn)，Cl，Br，I，NO2，羥基，烷基，烷氧基；M＝Na+，K+。
2.如全利要求1所述的新型增強劑，其特征在于四苯硼鈉用于酶促化學發(fā)光反應增強劑。
全文摘要
本發(fā)明屬于酶促化學發(fā)光反應新型增強劑的用途。該增強劑的發(fā)現(xiàn)可以導致一類具有類似結構的增強劑的開發(fā)和應用。隨著這類增強劑的使用,為辣根過氧化物酶的測定及其酶標記物的化學發(fā)光酶免疫分析提供了新的測定體系。該增強劑易溶于水,不同于酚類等有機物質需溶解于有機溶劑,這在測定、保存和試劑盒開發(fā)中具有特殊的優(yōu)勢。利用四苯硼鈉作增強劑的化學發(fā)光反應體系測定甲狀腺素、胰島素和三碘甲腺原氨酸。
文檔編號C09K11/07GK1257904SQ98125659
公開日2000年6月28日 申請日期1998年12月24日 優(yōu)先權日1998年12月24日
發(fā)明者張雯艷, 朱國逸, 丁家華, 李峰 申請人:中國科學院長春應用化學研究所