一種自拋光型酶基防污涂料的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于海洋生物污損防護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種自拋光型酶基防污涂料的制備 方法，取哲基硅油改性丙締酸樹脂為成膜物，采用碳納米管吸附固定的從海水中純化培養(yǎng) 的多糖水解酶和從典型污損生物石灰蟲外殼純化培養(yǎng)的兩種蛋白酶作為防污物質(zhì)的防污 組合物。
【背景技術(shù)】：
[0002] 海洋污損對船舶和海洋人工設(shè)施造成嚴(yán)重的危害，影響其航行速度、燃油經(jīng)濟(jì)性 和安全性，增加保養(yǎng)和維修成本，因此必須采用有效措施防止海洋生物對其造成的污損附 著。傳統(tǒng)的有機(jī)錫防污涂料因嚴(yán)重危害海洋生態(tài)環(huán)境，已被禁止使用；目前廣泛使用的含氧 化亞銅、硫氯酸亞銅類防污涂料由于會導(dǎo)致海洋銅元素累積，造成嚴(yán)重的海洋生態(tài)環(huán)境問 題，在一些國家如加拿大和瑞典已被限制使用并面臨禁用的趨勢。因此，開發(fā)環(huán)境友好型海 洋防污涂料具有重要意義。
[0003] 目前，微生物源防污酶作為天然防污活性物質(zhì)，可通過降解固著生物的黏附劑、 瓦解生物膜基質(zhì)、阻斷群體反應(yīng)信號傳遞、甚至酶催化產(chǎn)生殺聲劑而表現(xiàn)出高效的生物活 性。酶基防污涂料已成為防污領(lǐng)域研究與應(yīng)用熱點(diǎn)。Pettitt等人研究了包括脂肪酶、纖 維素酶、葡萄糖、淀粉酶、混合酶等24種酶的防污效果，其中絲氨酸蛋白酶在防止綠藻抱子 和藤壺幼蟲附著方面具有最佳效果。公開號為CN102137900A的專利公開了一種氣凝膠中 包埋生物活性劑和酶的防污組合物；公開號為CN102083919B的專利公開了一種包含第一 酶和包封的第二酶的防污組合物，采用0-半乳糖巧酶、膚酶、葡糖淀粉酶及其混合物作 為第一酶，選包封于娃酸鹽中自氧化酶為第二酶；公開號為CN10230795她的專利公開了 基于酶的自拋光涂料組合物，其包括W粘合劑系統(tǒng)形式的粘合劑相和色素相，所述色素相 包括多糖和能輔助所述多糖水解的酶，酶可為葡萄糖淀粉酶，且多糖可為淀粉；公開號為 CN103819983A的專利公開了一種由高分子樹脂、辣椒素、蛇床子素、高凹頂藻醇等防污計(jì)和 蛋白酶組成的防污涂料；公開號為CN101284956B的專利公開了一種從藤壺、貽貝中分離純 化獲得蛋白酶產(chǎn)生菌及其蛋白酶基防污涂料的制備方法；另外丹麥的Biolocus公司已開 發(fā)出多種應(yīng)用與海洋防污的酶制劑并與J0TUN公司合作生產(chǎn)了酶涂料，該種涂料已在快艇 上推廣應(yīng)用；GE肥CORE公司和肥MP化公司合作開發(fā)了基于己糖酶和過氧化氨酶聯(lián)合生產(chǎn) 過氧化氨進(jìn)行防污的防污涂料，但該些現(xiàn)有技術(shù)普遍存在各種技術(shù)和應(yīng)用方面的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，尋求設(shè)計(jì)一種自拋光型酶基防污涂 料的制備方法，該酶基防污涂料不含有重金屬污染物，對環(huán)境友好且防污效果良好。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明方法包括多糖水解酶與蛋白酶產(chǎn)生菌的分離純化培 養(yǎng)、防污活性酶制劑制備和酶基防污涂料制備=個步驟：
[0006] (1)、多糖水解酶與蛋白酶產(chǎn)生菌的分離純化培養(yǎng)包括兩個方面
[0007] ①、多糖水解酶產(chǎn)生菌的分離純化與培養(yǎng)，在200ml2216E液體培養(yǎng)基中加入50ml 天然海水，于30°C下富集培養(yǎng)4她，然后將菌液在瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離并于25°C下 培養(yǎng)72h，用接種針挑取顯著水解瓊脂的菌落在培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，直到細(xì)胞 菌落形態(tài)穩(wěn)定一致，得到多糖水解酶產(chǎn)生菌；采用2216E液體培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)基的鹽度為 3-4%、抑值為7. 0-9. 0,在25-35°C下培養(yǎng)7-15天，獲得含有多糖水解酶的培養(yǎng)液；
[000引②、石灰蟲源蛋白酶產(chǎn)生菌的分離純化與培養(yǎng)，將從潮間帶取得的石灰蟲外殼在 無菌條件下礙碎，放入250ml2216E液體培養(yǎng)基中于30°C下富集培養(yǎng)4她，然后將菌液在 酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離并于25°C下培養(yǎng)72h，用接種針挑取顯著水解酪蛋白 (水解圈）的菌落在培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，直到細(xì)胞菌落形態(tài)穩(wěn)定一致，得到2 株蛋白酶產(chǎn)生菌即甜C-1和甜C-2 ;SCH-1采用2216E液體培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)基的鹽度為 0. 5-1. 5%、抑值為7. 0-8. 0,在30-40°C下培養(yǎng)7-10天，獲得含有蛋白酶的培養(yǎng)液；SCH-2 采用22166液體培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)基的鹽度為0.5-1.5%、抑值為7.0-8.5，在25-351：下培 養(yǎng)7-10天，獲得含有蛋白酶的培養(yǎng)液；
[0009] (2)、防污活性酶制劑制備
[0010] 將源于海水菌株的多糖水解酶和源于石灰蟲外殼菌株的兩種蛋白酶均采用相同 的分離純化工藝，將含有多糖水解酶的培養(yǎng)液和含有蛋白酶的培養(yǎng)液分別在冷凍離屯、機(jī)中 于3500rpm/min條件下離屯、40min，取上清液并用硫酸錠飽和溶液鹽析，鹽析液靜置4她后 于8000rpm/min轉(zhuǎn)速下離屯、40min，將離屯、獲得的沉淀物通過水相層析純化，并吸附于碳納 米管中，減壓冷凍干燥后分別制得相應(yīng)的防污活性酶制劑；
[0011] (3)、酶基防污涂料制備
[0012] 選用已公開專利化200810014220. 4 -種哲基硅油改性丙締酸樹脂作為自拋光型 成膜物，其結(jié)構(gòu)式為：
[001 引
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種自拋光型酶基防污涂料的制備方法，其特征在于制備方法包括多糖水解酶與蛋 白酶產(chǎn)生菌的分離純化培養(yǎng)、防污活性酶制劑制備和酶基防污涂料制備三個步驟： (1) 、多糖水解酶與蛋白酶產(chǎn)生菌的分離純化培養(yǎng)包括兩個方面 ① 、多糖水解酶產(chǎn)生菌的分離純化與培養(yǎng)，在200ml2216E液體培養(yǎng)基中加入50ml天然 海水，于30°C下富集培養(yǎng)48h，然后將菌液在瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離并于25°C下培養(yǎng) 72h，用接種針挑取顯著水解瓊脂的菌落在培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，直到細(xì)胞菌落形 態(tài)穩(wěn)定一致，得到多糖水解酶產(chǎn)生菌；采用2216E液體培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)基的鹽度為3-4%、 pH值為7. 0-9. 0,在25-35°C下培養(yǎng)7-15天，獲得含有多糖水解酶的培養(yǎng)液； ② 、石灰蟲源蛋白酶產(chǎn)生菌的分離純化與培養(yǎng)，將從潮間帶取得的石灰蟲外殼在無菌 條件下碾碎，放入250ml2216E液體培養(yǎng)基中于30°C下富集培養(yǎng)48h，然后將菌液在酪蛋白 瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離并于25°C下培養(yǎng)72h，用接種針挑取顯著水解酪蛋白（水解圈） 的菌落在培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，直到細(xì)胞菌落形態(tài)穩(wěn)定一致，得到2株蛋白酶產(chǎn) 生菌即SHC-1和SHC-2 ;SCH-1采用2216E液體培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)基的鹽度為0. 5-1. 5%、pH 值為7. 0-8. 0,在30-40°C下培養(yǎng)7-10天，獲得含有蛋白酶的培養(yǎng)液；SCH-2采用2216E液 體培養(yǎng)基，控制培養(yǎng)基的鹽度為〇. 5-1. 5%、pH值為7. 0-8. 5,在25-35°C下培養(yǎng)7-10天，獲 得含有蛋白酶的培養(yǎng)液； (2) 、防污活性酶制劑制備 將源于海水菌株的多糖水解酶和源于石灰蟲外殼菌株的兩種蛋白酶均采用相同的分 離純化工藝，將含有多糖水解酶的培養(yǎng)液和含有蛋白酶的培養(yǎng)液分別在冷凍離心機(jī)中于 3500rpm/min條件下離心40min，取上清液并用硫酸按飽和溶液鹽析，鹽析液靜置48h后于 8000rpm/min轉(zhuǎn)速下離心40min，將離心獲得的沉淀物通過水相層析純化，并吸附于碳納米 管中，減壓冷凍干燥后分別制得相應(yīng)的防污活性酶制劑； (3) 、酶基防污涂料制備 選用已公開專利ZL200810014220. 4 -種羥基硅油改性丙烯酸樹脂作為自拋光型成膜 物，其結(jié)構(gòu)式為：
式中X1、X2為H或CH3 ;R為C1-C7的烷基鏈；m為2-12的自然數(shù)，n為1-3的自然數(shù);A為0元素或NH2基團(tuán)；R1、R2均為C1-C7的烷基鏈；所述的自拋光型酶基防污涂料由各原料 按重量百分比選取羥基硅油改性丙烯酸樹脂55-70%，松香3. 5-8%，有機(jī)膨潤土 1-3%，碳 納米管固定多糖水解酶10-15%，碳納米管固定SCH-1蛋白酶5-10%，碳納米管固定SCH-2 蛋白酶10-15 %和以BYK-163潤濕分散劑為0. 5-2 %的助劑組成；該自拋光型酶基防污涂料 制備時，在攪拌狀態(tài)下向羥基硅油改性丙烯酸樹脂溶液中加入松香、有機(jī)膨潤土，攪拌均勻 后再加入防污活性酶制劑和助劑，將上述物質(zhì)通過高速分散機(jī)分散均勻即制得自拋光型酶 基防污涂料。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自拋光型酶基防污涂料的制備方法，其特征在于所述多糖水 解酶分解瓊脂測試過程為用接種針蘸取多糖水解酶產(chǎn)生菌培養(yǎng)液在瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃 線，于25°C下培養(yǎng)3天，觀察瓊脂培養(yǎng)基分解情況。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自拋光型酶基防污涂料的制備方法，其特征在于所述SCH-1 蛋白酶和SCH-2蛋白酶分解酪蛋白測試過程為用接種針蘸取SCH-1蛋白酶產(chǎn)生菌和SCH-2 蛋白酶產(chǎn)生菌培養(yǎng)液在酪蛋白培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，于25°C下培養(yǎng)3天，觀察酪蛋白分解情 況。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自拋光型酶基防污涂料的制備方法，其特征在于所述自拋光 型酶基防污涂料抑制典型污損生物藤壺幼蟲附著測試過程為將本發(fā)明實(shí)施例5-7制備的 自拋光型酶基防污涂料涂刷于5cmX5cm的馬口鐵片上，涂刷市售的不含防污劑且不具有 自拋光性能的丙烯酸樹脂為對照試樣，每種涂料3個平行樣；涂料干燥后，將試樣片置于直 徑9cm的培養(yǎng)皿中，加入30ml天然海水，每個培養(yǎng)皿中放入50只活潑的藤壺附著期幼蟲， 在黑暗處培養(yǎng)48h，觀察酶基防污涂料抑制典型污損生物藤壺幼蟲附著情況。
【專利摘要】本發(fā)明屬于海洋生物污損防護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種自拋光型酶基防污涂料的制備方法，包括多糖水解酶與蛋白酶產(chǎn)生菌的分離純化培養(yǎng)、防污活性酶制劑制備和酶基防污涂料制備，多糖水解酶與蛋白酶產(chǎn)生菌分離純化培養(yǎng)包括多糖水解酶產(chǎn)生菌與石灰蟲源蛋白酶產(chǎn)生菌的分離純化與培養(yǎng)，防污活性酶制劑制備是將源于海水菌株的多糖水解酶和石灰蟲外殼菌株的兩種蛋白酶采用相同的分離純化工藝制得相應(yīng)的防污活性酶制劑；酶基防污涂料制備是選用已公開專利一種羥基硅油改性丙烯酸樹脂作為自拋光型成膜物制得自拋光型酶基防污涂料；其工藝過程簡便，生產(chǎn)成本低，所制備的防污涂料基于生物拮抗效應(yīng)防污，環(huán)境友好，具有較好的防止海洋生物的附著作用。
【IPC分類】C09D7-12, C12N9-50, C09D5-16, C12N9-24, C09D133-08
【公開號】CN104774519
【申請?zhí)枴緾N201510204218
【發(fā)明人】王利, 藺存國
【申請人】中國船舶重工集團(tuán)公司第七二五研究所
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月24日