7.0 (3, 1H), 6.85 (3, 1H), 6. 7 (d, 1H), 6.5 (dd, 1H) ,3.85 (s, 3H), 3.8 (s, 3H) 〇
[0025] 實(shí)施例4 :熒光探針?lè)肿覫b-3的制備 中間體2-(苯并[d]噻唑-2-基)-5-氟苯基三氟甲磺酸酯（0. 50g，1. 4毫摩爾)與4 -((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-3_甲氧基苯胺（0.50g，1.6毫摩爾）、醋酸鈀（3%毫摩爾)、 BINAP (4. 5%毫摩爾)和碳酸銫（1. 4毫摩爾)溶解在8mL甲苯中，80攝氏度反應(yīng)16小時(shí)，抽 濾，柱層析純化。得黃色2-(苯并[d]噻唑-2-基)-N-苯基苯胺類關(guān)鍵中間，收率78% ;該 中間體經(jīng)N-甲基化，脫羥基保護(hù)基得探針?lè)肿觢b-2,收率70%。1H NMR (500 MHz, DMS0) δ8·52 (dd，lH)，8.45 (s，1H)，8.02 (d，2H), 7.5 (t，lH), 7.40 (t, 1H), 7.34 (t，lH), 7. 2(dd, 2H), 6.62 (d, 1H), 6. 38 (d, 1H), 6. 10(dd, 1H), 3.64 (s, 3H),3. 16(s, 3H)〇
[0027] 實(shí)施例5 :熒光探針?lè)肿覫a-I與過(guò)氧化亞硝基反應(yīng)前后的熒光變化 將探針?lè)肿右陨倭緿MSO溶解，分別加入PBS緩沖液或過(guò)氧化亞硝基的PBS溶液，使探 針?lè)肿拥慕K濃度為5 μΜ，過(guò)氧化亞硝基終濃度為1〇μΜ。反應(yīng)10min后使用熒光分光光計(jì)以 375 nm激發(fā)，記錄溶液在最大發(fā)射波長(zhǎng)(約470 nm)下的焚光強(qiáng)度，進(jìn)而確定探針?lè)肿优c過(guò) 氧化亞硝基反應(yīng)后熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，如圖1所示。
[0028] 實(shí)施例6 :焚光探針?lè)肿覫b-I與過(guò)氧化亞硝基反應(yīng)前后的熒光變化 將探針?lè)肿右陨倭緿MSO溶解，分別加入PBS緩沖液或過(guò)氧化亞硝基的PBS溶液，使探 針?lè)肿拥慕K濃度為5 μΜ，過(guò)氧化亞硝基終濃度為1〇μΜ。反應(yīng)10min后使用熒光分光光計(jì)以 375 nm激發(fā)，記錄溶液在最大發(fā)射波長(zhǎng)(約470 nm)下的焚光強(qiáng)度，進(jìn)而確定探針?lè)肿优c過(guò) 氧化亞硝基反應(yīng)后熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，如圖2所示。
[0029] 實(shí)施例7 :熒光探針?lè)肿覫b-2與過(guò)氧化亞硝基反應(yīng)前后的熒光變化 將探針?lè)肿右陨倭緿MSO溶解，分別加入PBS緩沖液或過(guò)氧化亞硝基的PBS溶液，使探 針?lè)肿拥慕K濃度為5 μΜ，過(guò)氧化亞硝基終濃度為1〇μΜ。反應(yīng)10min后使用熒光分光光計(jì)以 375 nm激發(fā)，記錄溶液在最大發(fā)射波長(zhǎng)(約470 nm)下的焚光強(qiáng)度，進(jìn)而確定探針?lè)肿优c過(guò) 氧化亞硝基反應(yīng)后熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，如圖3所示。
[0030] 實(shí)施例8 :熒光探針?lè)肿覫a-I對(duì)過(guò)氧化亞硝基的選擇性 將探針?lè)肿右陨倭緿MSO溶解，再加入PBS緩沖液配置成溶液，分別加入PBS緩沖液溶 解的待測(cè)樣品，使探針?lè)肿拥慕K濃度為5 μΜ,而待測(cè)樣品終濃度為1〇μΜ。反應(yīng)30min后使 用熒光分光光計(jì)以375 nm激發(fā)，記錄溶液在最大發(fā)射波長(zhǎng)(約470 nm)下的熒光強(qiáng)度，進(jìn)而 確定探針?lè)肿訉?duì)過(guò)氧化亞硝基的選擇性，如圖4所示。
[0031] 實(shí)施例9 :熒光探針?lè)肿覫b-I對(duì)過(guò)氧化亞硝基的選擇性 將探針?lè)肿右陨倭緿MSO溶解，再加入PBS緩沖液配置成溶液，分別加入PBS緩沖液溶 解的待測(cè)樣品，使探針?lè)肿拥慕K濃度為5 μΜ,而待測(cè)樣品終濃度為1〇μΜ。反應(yīng)30min后使 用熒光分光光計(jì)以375 nm激發(fā)，記錄溶液在最大發(fā)射波長(zhǎng)(約470 nm)下的熒光強(qiáng)度，進(jìn)而 確定探針?lè)肿訉?duì)過(guò)氧化亞硝基的選擇性，如圖5所示。
[0032] 實(shí)施例10 :熒光探針?lè)肿覫b-2對(duì)過(guò)氧化亞硝基的選擇性 將探針?lè)肿右陨倭緿MSO溶解，再加入PBS緩沖液配置成溶液，分別加入PBS緩沖液溶 解的待測(cè)樣品，使探針?lè)肿拥慕K濃度為5 μΜ,而待測(cè)樣品終濃度為1〇μΜ。反應(yīng)30min后使 用熒光分光光計(jì)以375 nm激發(fā)，記錄溶液在最大發(fā)射波長(zhǎng)(約470 nm)下的熒光強(qiáng)度，進(jìn)而 確定探針?lè)肿訉?duì)過(guò)氧化亞硝基的選擇性，如圖6所示。
[0033] 實(shí)施例11 :熒光探針?lè)肿覫b-2對(duì)過(guò)氧化亞硝基濃度依賴性熒光增強(qiáng) 將探針?lè)肿右陨倭緿MSO溶解，再加入PBS緩沖液配置成溶液，分別加入不同濃度的過(guò) 氧化亞硝基溶液，使探針?lè)肿拥慕K濃度為5 μΜ，反應(yīng)30min后使用熒光分光光計(jì)以375 nm 激發(fā)，記錄溶液在最大發(fā)射波長(zhǎng)(約470 nm)下的熒光強(qiáng)度，進(jìn)而確定探針?lè)肿訉?duì)過(guò)氧化亞 硝基濃度依賴性熒光增強(qiáng)，如圖7所示。
[0034] 實(shí)施例12 :焚光探針?lè)肿覫b-I檢測(cè)活細(xì)胞中過(guò)氧化亞硝基 將血管內(nèi)皮細(xì)胞EA. hy926接種于多聚賴氨酸包被過(guò)的玻片上，含10%胎牛血清的DMEM 全培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)后，加入ONOCT (60 μΜ)或ONOCT供體SIN-1 (ImM)處理6h。隨后 換液，加入含有5 熒光探針I(yè)b_l(5mM，1:1000)的培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C孵育 30min。細(xì)胞玻片經(jīng)過(guò)4%PFA固定45min后，PBS洗3次，0. l%triton X-100透膜處理5min， 加入50 kg/ml RANase 37°C處理30min排除RNA干擾，隨后進(jìn)行細(xì)胞核定位PI染色，封片。 采用激光過(guò)聚焦熒光顯微鏡觀察，拍照。其中分別采用405nm和543nm激光波長(zhǎng)激發(fā)Ib-I 和PI。結(jié)果表明，熒光探針?lè)肿覫b-I可有效檢測(cè)到活細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞中的過(guò)氧亞硝基， 如圖8所示。
[0035] 此外，采用糖氧剝奪模型（Oxygen-Glucose deprivation, 0GD)處理血管內(nèi)皮細(xì) 胞EA. hy926和人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HBMEC，考察熒光探針?lè)肿覫b-I是否能有效檢測(cè)缺血 性病理?yè)p傷過(guò)程中0N0CT的積聚。細(xì)胞經(jīng)0⑶處理3h后，如上述方法加入熒光探針?lè)肿臃?育，并進(jìn)行固定、透膜、細(xì)胞核PI染色、封片、共聚焦顯微鏡觀察、拍照，結(jié)果如圖9所示。相 較于正常組，0⑶處理組細(xì)胞的Ib-I熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明熒光探針?lè)肿覫b-I有效監(jiān)測(cè) 細(xì)胞病理?yè)p傷過(guò)程中(^00_的變化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一類檢測(cè)過(guò)氧化亞硝基的熒光探針，其特征在于，具有式Ia或Ib所示的結(jié)構(gòu)通式： 其中：X為硫或氧原子； Y為氧原子，或者烷胺基、芳胺基； R1為羥基、烷基仲胺或芳基仲胺； R2為氫，氟原子或溴原子、C ^C4烷基，或者供電性基團(tuán)如烷氧基、烷胺基； 馬為氫或烷氧基； R4為氫、C ^C4烷基，或者供電性基團(tuán)如烷氧基、烷胺基。2. -類式Ia所示化合物的制備方法，其特征在于，通過(guò)以下制備方法實(shí)現(xiàn)： R4基取代的鄰氨基苯硫酚或者R4取代的鄰氨基苯酚與RpR2取代的苯甲醛在甲醇溶液 中室溫?cái)嚢鑳蓚€(gè)小時(shí)，抽濾，即得式Ia所示化合物；反應(yīng)式為：其中取代基X、Yj1、R2、R3、R4的定義同權(quán)利要求1。3. -類式Ib所示化合物的制備方法，其特征在于，通過(guò)以下制備方法實(shí)現(xiàn)： (1) R4基取代的鄰氨基苯硫酚或者R4取代的鄰氨基苯酚與R2取代的鄰羥基苯甲醛在 甲醇溶液，雙氧水及鹽酸共同存在的條件下室溫反應(yīng)得中間體II ; (2) 中間體II在二氯甲烷溶液中，吡啶存在的條件下與三氟甲磺酸酐反應(yīng)，得中間體 III ; (3) 中間體III與R3取代的對(duì)羥基苯叔丁基二甲基硅醚或者R3取代的對(duì)氨基苯叔丁基 二甲基硅醚在醋酸鈀存在下偶聯(lián)，后經(jīng)苯胺氮原子甲基化、羥基脫除硅醚保護(hù)基，得Ib所 示化合物；反應(yīng)式為：其中取代基X、Y、RpR2、R3、R4的定義同權(quán)利要求1。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一類檢測(cè)過(guò)氧化亞硝基的熒光探針在檢測(cè)生物過(guò)氧化亞硝 基中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一類檢測(cè)過(guò)氧化亞硝基的熒光探針，具有式Ia或Ib的結(jié)構(gòu)通式，通過(guò)（1）R4取代的鄰氨基苯硫酚或者R4取代的鄰氨基苯酚與R1、R2取代的苯甲醛在甲醇溶液中室溫?cái)嚢鑳蓚€(gè)小時(shí)，得1a；（2）R4取代的鄰氨基苯硫酚或者鄰氨基苯酚與R2取代的鄰羥基苯甲醛進(jìn)行氧化縮合，得苯并噻唑類或苯并惡唑類中間體；該中間體的酚羥基轉(zhuǎn)化為三氟甲磺酸酯后與R3取代的對(duì)羥基苯叔丁基二甲基硅醚或?qū)Π被绞宥』谆杳雅悸?lián)，經(jīng)苯胺氮原子甲基化、羥基脫除硅醚保護(hù)基，得Ib。本發(fā)明提供的熒光探針可與過(guò)氧化亞硝基特異性快速反應(yīng)，生成具有強(qiáng)熒光的產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)過(guò)氧化亞硝基的特異性檢測(cè)。本發(fā)明探針的結(jié)構(gòu)通式：。
【IPC分類】C09K11/06, G01N21/64, C07D277/66
【公開(kāi)號(hào)】CN104893711
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510258766
【發(fā)明人】李新, 陶蓉蓉, 韓峰, 胡有洪, 胡永洲, 程娟
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年9月9日
【申請(qǐng)日】2015年5月20日