一種線粒體靶向型pH熒光探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于熒光素的線粒體靶向型pH熒光探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著生物成像技術(shù)的不斷發(fā)展，熒光探針越來越多地應(yīng)用于細(xì)胞標(biāo)記及 成像、蛋白質(zhì)分析、醫(yī)學(xué)診斷、生物傳感等研究領(lǐng)域。熒光探針具有熒光量子產(chǎn)率高，光穩(wěn)定 性好，生物兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，成為顯微成像的理想工具。
[0003] pH值是人體內(nèi)一個重要的生理參數(shù)，參與了許多生理過程，比如接受調(diào)控信號轉(zhuǎn) 換、酶活性、細(xì)胞生長、離子運(yùn)輸、離子調(diào)控、細(xì)胞粘附等。它的變化會影響機(jī)體的健康，例 如酸性pH與炎癥和腫瘤疾病相關(guān)。
[0004] 線粒體控制著細(xì)胞凋亡的激活系統(tǒng)，是細(xì)胞呼吸的主要場所，在細(xì)胞的生命周期 中扮演重要角色，三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化都是在線粒體中進(jìn)行的。線粒體不僅是細(xì)胞內(nèi) 能量產(chǎn)生的主要場所，還是氧自由基產(chǎn)生的重要部位。線粒體的數(shù)量與形狀不但與細(xì)胞的 種類有關(guān)，也與代謝活動和相關(guān)疾病密切相關(guān)。因此，實(shí)現(xiàn)線粒體的可視化觀測對于了解 細(xì)胞生命活動及疾病的預(yù)防和治療具有重要意義。線粒體存在于大多數(shù)的真核細(xì)胞中，一 般呈短棒狀或圓球狀，也有環(huán)狀、線狀、啞鈴狀、分杈狀、扁盤狀等，大小不一，在光學(xué)顯微鏡 下需要經(jīng)過特殊染色才能看見。一般來說，用于生命科學(xué)研究的理想染料需要符合以下要 求：較高的焚光量子產(chǎn)率，有良好的生物相容性，穩(wěn)定性和低毒性。目前，用于活細(xì)胞內(nèi) 線粒體靶向成像的熒光探針種類還不是很多。因此開發(fā)線粒體靶向型熒光探針具有廣闊的 前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種線粒體靶向型pH熒光探針，該熒光探針分子能夠快速的 定位于線粒體中用于活細(xì)胞的熒光顯微成像。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種線粒體靶向型pH熒光探針，所述熒光探針為FDI熒光探針，F(xiàn)DI熒光探針的 結(jié)構(gòu)通式如（I)所示：
[0008]
[0009] 所述一種線粒體靶向型pH熒光探針，所述FDI熒光探針的合成方法包括如下步 驟：
[0010] 將熒光素烯醛與2, 3, 3-三甲基-吲哚，分別加入到無水乙醇中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加 熱回流反應(yīng)7-10小時，反應(yīng)液冷卻后旋干，經(jīng)硅膠柱層析提純得到目標(biāo)產(chǎn)物FDI。其中熒光 素烯醛與2, 3, 3-三甲基-吲哚的比為1:1，硅膠柱層析提純中的洗脫劑為甲醇：二氯甲烷 =1:10,硅膠柱為300-400目。
[0011] 所述熒光素烯醛的制備方法為：
[0012] (1)將熒光素溶于甲醇中，再加入15-冠醚-5和三氯甲燒，恒壓滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 33% NaOH溶液，再升溫至55°C回流反應(yīng)10h。在(TC將反應(yīng)液用濃鹽酸酸化，pH調(diào)至1-2， 出現(xiàn)絮狀沉淀，過濾得黃色固體，經(jīng)硅膠柱層析干法上樣提純得到熒光素單醛，洗脫劑為乙 酸乙酯：二氯甲烷=1 :1〇,硅膠柱為300-400目；
[0013] (2)將熒光素單醛，甲?；鶃喖谆交淄?，溶于氯仿，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱50°C，冷 凝回流24h，反應(yīng)液冷卻后，旋干去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素烯醛，洗脫劑為甲 醇：二氯甲烷=1:9,硅膠柱為300-400目。
[0014] 上述這種熒光探針的制備反應(yīng)式如下：
[0015]
[0016] 本發(fā)明另一目的是一種線粒體靶向型pH熒光探針在細(xì)胞內(nèi)線粒體的熒光顯微成 像中的應(yīng)用。所述細(xì)胞為Hela細(xì)胞株、MCF-7細(xì)胞株或RAW264. 7細(xì)胞株。
[0017] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0018] 本發(fā)明的熒光探針分子能夠快速的定位于線粒體中，具有較好的化學(xué)穩(wěn)定性，較 好的溶解性和生物兼容性。激光共聚焦成像實(shí)驗(yàn)表明這類探針具有較好的細(xì)胞通透性，對 細(xì)胞和生物體無毒副作用。
【附圖說明】
[0019] 圖1是實(shí)施例1制備的FDI熒光探針對不同pH值的吸收光譜響應(yīng)。
[0020] 圖2是實(shí)施例1制備的FDI熒光探針在pH值為1. 99-10. 36范圍的吸收光譜變化。
[0021] 圖3是實(shí)施例1制備的FDI熒光探針在pH值為10. 36-13. 69范圍的吸收光譜變 化。
[0022] 圖4是實(shí)施例1制備的FDI熒光探針對不同pH值的熒光光譜響應(yīng)。
[0023] 圖5是實(shí)施例1制備的FDI熒光探針在pH值為1. 99-5. 34范圍的熒光光譜變化。
[0024] 圖6是實(shí)施例1制備的FDI熒光探針在pH值為5. 77-13. 17范圍的熒光光譜變化。
[0025] 圖7是實(shí)施例1制備的FDI熒光探針在線粒體中的熒光共聚焦顯微成像。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 實(shí)施例--種線粒體靶向型pH熒光探針
[0027] 制備方法如：
[0028] (1)熒光素單醛的制備：焚光素 （lg 3. 16mmol)溶于7ml甲醇，再加入0. 2ml的 15-冠-5和4ml的三氯甲烷，恒壓滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33%的NaOH溶液，再升溫至55°C回流反 應(yīng)10h，在(TC將反應(yīng)液用濃鹽酸酸化，pH調(diào)至1-2,出現(xiàn)絮狀沉淀，過濾得黃色固體，經(jīng)硅膠 柱層析干法上樣提純（洗脫劑乙酸乙酯：二氯甲烷=I :l〇Rf = 0. 33 ;Si02300-400目），得 到0· 2183g的目標(biāo)產(chǎn)品，產(chǎn)率19%。MS :360. 0634。
[0029] (2)熒光素烯醛的制備：熒光素單醛（0· 1059g，0· 2941mmol)，甲酰基亞甲基三苯 基磷烷（0. 1105g，0. 3634mmol)，溶于氯仿（25ml)，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱50°C，冷凝回流24h，反 應(yīng)液冷卻后，旋干去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純（洗脫劑甲醇：二氯甲烷=l:9Rf = 0.42; Si02300-400 目），得到 0· 0721g 的目標(biāo)產(chǎn)品，產(chǎn)率 63%。MS :386. 0790。
[0030] (3)FDI 的制備：熒光素烯醛（0.0721g，0. 18mmol)，N-R-2,3,3-三甲基-3H-吲 哚（0. 0566g，0. 18mmol)，加入到無水乙醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流反應(yīng)7-10小時，反應(yīng) 液冷卻后，旋干去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純（洗脫劑二氯甲烷：甲醇=10: IRf = 0.28 ; Si02300-400 目），得到 40. 97mg 的目標(biāo)產(chǎn)品，產(chǎn)率 42%。MS :669. 1012。
[0031] 實(shí)施例二一種線粒體靶向型pH熒光探針對pH響應(yīng)檢測
[0032] 將實(shí)施例1中制備的FDI熒光探針溶于乙醇水溶液中，配制濃度為2X 10-5M的 FDI乙醇溶液，其中乙醇與水的體積比5:5。逐次調(diào)節(jié)FDI乙醇溶液pH，可見溶液的顏色隨 著PH值增加由黃色變?yōu)槟G色最后變?yōu)榧t色。
[0033] 各次溶液進(jìn)行紫外分光光度法測試，將所得數(shù)據(jù)匯總繪制出FDI熒光探針對不 同pH值響應(yīng)的吸收光譜，如圖1所示。調(diào)節(jié)FDI乙醇溶液pH由1. 99, 2. 66…逐漸升高至 10. 36,可見溶液吸收光譜454nm處的波峰由454nm紅移至489nm，且峰值隨pH值的增加由 0. 46升高至0. 97,624nm處隨pH值的增加由無波峰至逐漸出現(xiàn)波峰，峰值升高至0. 38,如 圖2所示。調(diào)節(jié)FDI乙醇溶液pH由10. 36逐漸升高至13. 69,可見溶液吸收光譜在489nm 處的波峰繼續(xù)紅移，且峰值隨pH值的增加而降低至0. 75,624nm處的波峰峰值隨pH值的增 加而降低至0. 08,如圖3所示。由圖2、圖3可知FDI熒光探針對于pH在吸收上有響應(yīng)，pH 值的改變可使FDI顏色發(fā)生改變。
[0034] 各次溶液進(jìn)行熒光分光光度法測試，將所有數(shù)據(jù)匯總繪制出FDI熒光探針對不同 pH響應(yīng)的熒光光譜，如圖4所示。調(diào)節(jié)FDI乙醇溶液pH由1. 99逐漸升高至5. 34,可見溶 液熒光光譜在672nm處的波峰的熒光強(qiáng)度隨pH值的增加由158升高至686,如圖5所示。 調(diào)節(jié)FDI乙醇溶液pH由5. 34…逐漸升高至13. 17,可見溶液熒光光譜在672nm處的波峰熒 光強(qiáng)度隨pH值的增加降低至35,如圖5所示。由圖4、圖5可知FDI熒光探針對于pH在熒 光上有響應(yīng)，pH值的改變可使FDI熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。
[0035] 實(shí)施例三一種線粒體靶向型pH熒光探針用于活細(xì)胞的熒光顯微成像
[0036] 向含有MCF-7或RAW264. 7(Hela)細(xì)胞株的培養(yǎng)皿中，加入濃度為加入實(shí)施例2中 濃度為2 X 10 5M的FDI乙醇溶液，與細(xì)胞培養(yǎng)液混合均勻后，使FDI在培養(yǎng)液中的終濃度達(dá) 到10uM。染色5min后，用pH = 7. 2的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行清洗三次，然后將該培養(yǎng)皿置 于37°C恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育24小時，最后將該培養(yǎng)皿置于共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。實(shí) 驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染有FDI的Hela細(xì)胞線粒體中呈現(xiàn)出明顯的熒光，如圖7所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表 明，F(xiàn)DI能進(jìn)入細(xì)胞，具有較好的細(xì)胞膜透過性，且FDI可以定位于線粒體，能夠檢測細(xì)胞線 粒體中的pH。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種線粒體靶向型pH熒光探針，其特征在于，所述熒光探針為FDI熒光探針，F(xiàn)DI熒 光探針的結(jié)構(gòu)通式如（I)所示： 其中，R= -CH3, -CH2CH3。2. 如權(quán)利要求1所述一種線粒體靶向型pH熒光探針，其特征在于，所述FDI熒光探針 的合成方法包括如下步驟： 將熒光素烯醛與2, 3, 3-三甲基-吲哚，分別加入到無水乙醇中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回 流反應(yīng)7-10小時，反應(yīng)液冷卻后旋干，經(jīng)硅膠柱層析提純得到目標(biāo)產(chǎn)物FDI。3. 如權(quán)利要求2所述一種線粒體靶向型pH熒光探針，其特征在于，硅膠柱層析提純中 的洗脫劑為甲醇：二氯甲烷=1:10,硅膠柱為300-400目。4. 如權(quán)利要求2所述一種線粒體靶向型pH熒光探針，其特征在于，所述熒光素烯醛與 2, 3, 3-三甲基-吲哚的比為1:1。5. 如權(quán)利要求2所述一種線粒體靶向型pH熒光探針，其特征在于，所述熒光素烯醛的 制備方法為： ⑴將熒光素溶于甲醇中，再加入15-冠醚-5和三氯甲燒，恒壓滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33%NaOH溶液，再升溫至55°C回流反應(yīng)10h，在0°C將反應(yīng)液用濃鹽酸酸化，pH調(diào)至1-2,出現(xiàn)絮 狀沉淀，過濾得黃色固體，經(jīng)硅膠柱層析干法上樣提純得到熒光素單醛； (2)將熒光素單醛、甲?；鶃喖谆交淄?，溶于氯仿，氮?dú)獗Ｗo(hù)，加熱50°C，冷凝回 流24h得反應(yīng)液，反應(yīng)液冷卻后，旋干去溶劑，經(jīng)硅膠柱層析提純得到熒光素烯醛。6. 如權(quán)利要求5所述一種線粒體靶向型pH熒光探針，其特征在于，所述步驟（1)中硅 膠柱層析干法上樣提純中的洗脫劑為乙酸乙酯：二氯甲烷=1 :1〇,硅膠柱為300-400目。7. 如權(quán)利要求5所述一種線粒體靶向型pH熒光探針，其特征在于，所述步驟（2)中硅 膠柱層析提純中的洗脫劑為甲醇：二氯甲烷=1:9,硅膠柱為300-400目。8. 如權(quán)利要求1所述一種線粒體靶向型pH熒光探針在細(xì)胞內(nèi)線粒體的熒光顯微成像 中的應(yīng)用。9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞為Hela細(xì)胞株、MCF-7細(xì)胞株或RAW264. 7細(xì)胞株。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種線粒體靶向型pH熒光探針，所述熒光探針為FDI熒光探針，F(xiàn)DI熒光探針的結(jié)構(gòu)通式如(I)所示。本發(fā)明的熒光探針分子能夠快速的定位于線粒體中，有較好的化學(xué)穩(wěn)定性，較好的溶解性和生物兼容性。激光共聚焦成像實(shí)驗(yàn)表明這類探針具有較好的細(xì)胞通透性，對細(xì)胞和生物體無毒副作用。
【IPC分類】A61K49/00, G01N21/64, C09K11/06, C07D405/06
【公開號】CN105018074
【申請?zhí)枴緾N201510424889
【發(fā)明人】于海波, 李紅玲, 宋有濤, 呂春嬌, 方沛菊, 趙梓旭, 李谷麗, 范建情
【申請人】遼寧大學(xué)
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年7月20日