一種用于化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移的集成化雙酶-量子點制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移的集成化雙酶-量子點制備方法，主要用于化學發(fā)光-量子點共振能量轉(zhuǎn)移檢測生物分子，進行細胞和組織等成像，屬于生物分析領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]量子點通常是由IIB?VI A或IIIA?VA元素組成的、直徑在I?10 nm的球或類球形半導體納米粒子。量子點由于其粒徑很小，電子和空穴被量子限域，連續(xù)能帶變成具有分子特性的分立能結(jié)構(gòu)，在一定的激發(fā)光源下激發(fā)會發(fā)出熒光。隨著生命科學的發(fā)展以及人類對健康的追求，納米科技中的量子點納米探針在生物學的應用已成為了人們關(guān)注的熱點。量子點與傳統(tǒng)染料相比具有光量子點效率高、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄，熒光壽命長、顏色可調(diào)、抗光漂白等獨特的光學性能，用其構(gòu)建的量子點探針為生物分子的“標識”、“閱讀”提供了有效的途徑，并已廣泛的運用于生命科學的各個領(lǐng)域。目前，對量子點納米探針的修飾、標記和生物偶聯(lián)的研發(fā)正成為不斷促進生命科學發(fā)展的重要推動力之一。
[0003]化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(CRET)在生命分析中已顯示了其特有的優(yōu)勢如無需光源、儀器簡單、反應設計多樣化等，將其與獨特光學性能的量子點結(jié)合，研究的化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移量子點(CRET-QDs)探針在生命分析中具有良好的應用前景及實用價值。目前已建立以辣根過氧化物酶(HRP)-魯米諾-H2O2 (Angew.Chem.1nt.Ed.2006，45: 5140-5143)，BrO-魯米諾(Chem.Eur.J.2010, 16: 6142-6145)、DNA 催化酶-魯米諾-H2O2 (J.Am.Chem.Soc.2011, 133: 11597-11604)化學發(fā)光反應為量子點能量供體的體系。然而，這些化學發(fā)光體系中一般需加入氧化劑如H2O2,會氧化CdSe、ZnS等量子點導致其表面產(chǎn)生缺陷，從而降低其熒光效率甚至產(chǎn)生猝滅；另一方面，魯米諾與氧化劑反應的背景發(fā)光波長范圍約在350-580 nm之間，對短熒光波長的量子點探針進行檢測時，會造成背景光譜干擾嚴重，會影響多組分同時檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有化學發(fā)光量子點探針的不足，提出制備新型、集成化的雙酶-量子點納米材料。本發(fā)明將辣根過氧化物酶(HRP)和氧化酶偶聯(lián)在量子點上制備集成化的雙酶-量子點納米器件，避免直接加入氧化劑(H2O2)且發(fā)光反應僅在量子點表面進行、背景低，可用于特異性地檢測氧化酶對應的底物分子，多元分析，細胞或組織等的成像。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
(I)碲氫化鈉的制備:將碲粉、硼氫化鈉(NaHB 4)和超純水于離心管中反應，碲粉全部溶于溶液反應完畢，制備得到碲氫化鈉溶液，取出置于低溫保存。
[0006](2)通過水熱合成法制備不同尺寸的碲化鎘量子點:將10 mM CdCl2溶液和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)于三口燒瓶中混合，在N2氛圍下，攪拌反應30 min，調(diào)節(jié)pH至8.0。移取(I)中的儲存液于三口燒瓶中(速度要快并隔絕氧氣)，攪拌反應10 min, Cd2VTe2 /NAC的摩爾比為4:1:7?？刂品磻獪囟葹?50°C，反應時間為0.5-2 h，得到發(fā)射波長為500-650nm的碲化鎘量子點水溶液；
(3)制備集成化雙酶-量子點:將1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和量子點于0.0lM的pH為7.4的PBS緩沖溶液中混合均勻，量子點、EDC和NHS的摩爾比為15:1:0.8，活化量子點30 min。稱取一定量的辣根過氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOD)/膽固醇氧化酶(ChOx)，HRP與GO D /ChOx的活性單位比為2:1和30:1，分別用I mL PBS溶液(pH=7.4)溶解。再將溶解后的HRP溶液加入到活化后的量子點溶液中繼續(xù)振蕩30 min，然后加入溶解后的GOD/ ChOx溶液繼續(xù)振蕩2.5ho反應后的溶液轉(zhuǎn)移到超濾管中，以10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，將離心管中的上層混合物用I mL PBS溶液溶解轉(zhuǎn)移到I mL離心管中低溫保存，制備得到雙酶-量子點納米材料。
[0007]發(fā)明效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
(1)氧化劑H2O2在量子點表面在線生成并且立即反應消耗掉，可減少甚至避免H202對量子點的熒光猝滅作用；
(2)反應在量子點表面的微區(qū)內(nèi)進行，可降低化學發(fā)光背景、減少或避免多組分分析遇到的背景光譜干擾；
(3)雙酶可使探針的設計更加多元化，不但可擴大CRET-QDs的檢測對象，而且能更方便的用于多組分檢測。
具體實施方案
[0008]實施例1 (I)碲氫化鈉的制備:將60 mg碲粉、120 mg硼氫化鈉(NaHB 4)和4mL 50 °(:超純水于10 mL離心管中反應，10 min碲粉全部溶于溶液反應完畢，制備得到碲氫化鈉溶液，取出置于低溫保存。
[0009](2)通過水熱合成法制備不同尺寸的碲化鎘量子點:將200 mL10 mmol/L CdCl2溶液和0.5712 g N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)于三口燒瓶中混合均勻，在N2氛圍下，攪拌反應30 min，調(diào)節(jié)pH至8.0。用移液槍取4 mL (I)中的儲備液于三口燒瓶中，攪拌反應10min, Cd2VTe2 /NAC的摩爾比為4:1:7。將反應后的溶液倒入水熱反應爸中，控制反應溫度為150°C，反應時間為0.5-2 h，得到500 -650 nm的碲化鎘量子點水溶液。
[0010](3)制備集成化雙酶-量子點:將30 nmol的紅色量子點，2 mg EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)和I mg NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)溶于I mLPBS溶液(pH=7.4)。中混合均勻，在振蕩器上振蕩30 min活化量子點。稱取6 mg HRP和9 mg GOD，分別用I mL PBS溶液(pH=7.4)溶解。再將溶解后的HRP溶液加入活化后的量子點溶液中繼續(xù)振蕩30 min，然后加入溶解后的GOD溶液繼續(xù)振蕩2.5 h。最后將反應后的溶液轉(zhuǎn)移到超濾管(micoron YM-10-100000 NMffL, millipore，USA)中，以 10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，將離心管中的上層混合物用I mL PBS溶液(pH=7.4)溶解轉(zhuǎn)移到I mL離心管中，在4 °(:下儲存。將該集成化的雙酶-量子點體系用于化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移分析，轉(zhuǎn)移效率可達46.7%，比游離的雙酶-量子點化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移體系的轉(zhuǎn)移效率有顯著的提高，用于檢測葡萄糖，檢出限可達8.68 nM。
[0011 ] 實施例2 (I)碲氫化鈉的制備:將60 mg碲粉、120 mg硼氫化鈉(NaHB 4)和4 mL50°C超純水于10 mL離心管中反應，10 min碲粉全部溶于溶液反應完畢，制備得到碲氫化鈉溶液，取出置于低溫保存。
[0012](2)通過水熱合成法制備不同尺寸的碲化鎘量子點:將200 mL10 mmol CdCl2S液和0.5712 g N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)于三口燒瓶中混合均勻，在N2氛圍下，攪拌反應30 min，調(diào)節(jié)pH至8.0。用移液槍取4 mL (I)中的儲備液于三口燒瓶中，攪拌反應10min, Cd2VTe2 /NAC的摩爾比為4:1:7。將反應后的溶液倒入水熱反應爸中，控制反應溫度為150°C，反應時間為0.5-2 h，得到500 -650 nm的碲化鎘量子點水溶液。
[0013](3)制備集成化雙酶-量子點:將30 nmol的橙色量子點，2 mg EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)和I mg NHS (N-羥基琥珀酰亞胺)溶于I mLPBS溶液(pH=7.4)。中混合均勻，在振蕩器上振蕩30 min活化量子點。稱取6 mg HRP和6 mg ChOx，分別用I mL PBS溶液(pH=7.4)溶解。再將溶解后的HRP溶液加入活化后的量子點溶液中繼續(xù)振蕩30 min，然后加入溶解后的ChOx溶液繼續(xù)振蕩2.5 h。最后將反應后的溶液轉(zhuǎn)移到超濾管(micoron YM-10-100000 NMffL, millipore，USA)中，以 10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，將離心管中的上層混合物用I mL PBS溶液(pH=7.4)溶解轉(zhuǎn)移到I mL離心管中，在4 °(:下儲存。將該集成化的雙酶-量子點體系用于化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移分析，轉(zhuǎn)移效率可達48.1%，比游離的雙酶-量子點化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移體系的轉(zhuǎn)移效率有顯著的提高，用于檢測膽固醇，檢出限可達1.6 nM。
【主權(quán)項】
1.一種用于化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移的集成化雙酶-量子點制備方法，其特征在于包括以下三個步驟: (1)將碲粉、硼氫化鈉(NaHB4)和超純水于離心管中反應，碲粉全部溶解后反應完畢，制備得到碲氫化鈉溶液，取出置于低溫保存； (2)將10mM CdCl2溶液和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)于三口燒瓶中混合，在N 2氛圍下，攪拌反應30 min，調(diào)節(jié)pH至8.0 ; 移取(I)中的儲備液于三口燒瓶中，攪拌反應10 min, Cd2+/Te2/NAC的摩爾比為4:1:7 ； 控制反應溫度為150°C，反應時間為0.5-2 h，得到發(fā)射波長為500-650 nm的碲化鎘量子點水溶液； (3)將1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和量子點于0.0lM的pH為7.4的PBS緩沖溶液中混合均勻，量子點、EDC和NHS的摩爾比為15:1:0.8，活化量子點30 min ； 稱取一定量的辣根過氧化物酶(HRP)和葡萄糖氧化酶(GOD)/膽固醇氧化酶(ChOx)，HRP與GOD /ChOx的活性單位比為2:1和30:1，分別用I mL PBS溶液(pH=7.4)溶解； 再將溶解后的HRP溶液加入到活化后的量子點溶液中繼續(xù)振蕩30 min，然后加入溶解后的GOD/ ChOx溶液繼續(xù)振蕩2.5 h ; 反應后的溶液轉(zhuǎn)移到超濾管中，以10000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，將離心管中的上層混合物用I mL PBS溶液溶解轉(zhuǎn)移到I mL離心管中低溫保存，制備得到雙酶-量子點納米材料。2.根據(jù)權(quán)利要求1制備的集成化雙酶-量子點，其特征在于過氧化物酶和氧化酶一起連接在熒光量子點上，構(gòu)成集成化的雙酶-量子點納米器件。3.根據(jù)權(quán)利要求1制備的集成化雙酶-量子點納米材料，其特征在于采用的氧化酶為葡萄糖氧化酶和膽固醇氧化酶。4.權(quán)利要求1-3中制得的集成化雙酶-量子點納米材料在化學發(fā)光-量子點共振能量轉(zhuǎn)移中應用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移的集成化雙酶-量子點制備方法。這種集成化的納米材料由熒光量子點、過氧化物酶、氧化酶組成，以熒光量子點為核心，先后以共價鍵將過氧化物酶和氧化酶連接于量子點上。該集成化的雙酶-量子點納米材料具有良好的穩(wěn)定性和水溶性，發(fā)射波長可調(diào)。將該材料用于化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移時，具有高的轉(zhuǎn)移效率（接近50%），顯著高于游離的雙酶-量子點化學發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移體系。該集成化的雙酶-量子點可用于特異性地檢測氧化酶對應的底物分子、多元分析，細胞或組織成像等。
【IPC分類】C09K11/88, B82Y40/00, G01N21/76, B82Y20/00
【公開號】CN105062490
【申請?zhí)枴緾N201510435035
【發(fā)明人】許淑霞, 李家林, 張信鳳, 李顯明
【申請人】成都理工大學
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月23日