一種pH熒光探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于有機(jī)小分子熒光探針領(lǐng)域，具體涉及一種pH熒光探針及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] pH是衡量溶液酸堿性的尺度，許多細(xì)胞生物化學(xué)過程如細(xì)胞生長等過程均會(huì)涉及 生物分子的質(zhì)子化和去質(zhì)子化過程，并伴隨著細(xì)胞微環(huán)境pH的改變。人體細(xì)胞內(nèi)pH值與 細(xì)胞、酶和組織的許多重要生理過程如細(xì)胞增殖和凋亡、藥物耐藥性、離子運(yùn)輸、內(nèi)吞作用 和肌肉收縮等活動(dòng)密切相關(guān)。通常細(xì)胞中存在兩個(gè)pH值范圍，一種是近中性，如細(xì)胞液中 的pH值范圍為6. 8-7. 4 ;還有一種是酸性，如溶酶體的pH值范圍為4. 5-5. 5,內(nèi)涵體的pH 值范圍為5. 4-6. 2稱為酸性細(xì)胞器。不正常的pH值可能導(dǎo)致心肺和神經(jīng)系統(tǒng)的疾病，如阿 爾茨海默綜合癥、癌癥，嚴(yán)重的甚至可能危及生命。因此，精確并快速地檢測pH對(duì)于細(xì)胞分 析和診斷具有重要意義。
[0003] 監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)pH值的動(dòng)態(tài)變化對(duì)于理解細(xì)胞內(nèi)許多生理功能的規(guī)則機(jī)制有著重要 的作用。相較于微電極、NMR和吸收光譜等pH測量方法，熒光光譜檢測技術(shù)對(duì)于在時(shí)空分 布上檢測pH變化具有獨(dú)特的優(yōu)勢。此外，熒光技術(shù)具有操作簡單、響應(yīng)快速、高信噪比、高 靈敏度以及大多數(shù)情況下對(duì)細(xì)胞無損傷等優(yōu)點(diǎn)。熒光染料或熒光試劑作為分子探針在生命 科學(xué)領(lǐng)域備受矚目。目前報(bào)道的許多pH熒光探針的Stokes位移較小，在造影時(shí)容易受到 激發(fā)光的干擾。因此，具有較大Stokes位移的pH熒光探針在生物和化學(xué)等方面都具有極 大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的就是為了提供一種pH熒光探針及其應(yīng)用，其具有較大光譜移動(dòng)。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 一種pH焚光探針，其化學(xué)名稱為：鵬化I-甲基(4-羥基甲氧基）苯乙稀 基吡啶鹽，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0007]
上述pH熒光探針的合成方法：將碘化1，2-二甲基吡啶鹽和香草醛（4-羥基-3-甲 氧基苯甲醛）按摩爾比1:2_1:3加入到正丁醇溶液中，加哌嗪，在回流條件（加熱至90~ 1〇〇°(：回流）下反應(yīng)3〇-6〇!^11，得到碘化1-甲基-2-(4-羥基-3-甲氧基）苯乙烯基吡啶鹽， 所述香草醛與正丁醇溶液的質(zhì)量體積比為〇. 304:20-0. 456:25 ;所述香草醛與所述哌嗪的 質(zhì)量比為 〇? 456:0. 02-0. 316:0. 01。
[0009] 上述pH熒光探針作為檢測細(xì)胞內(nèi)pH的指示劑。
[0010] 上述pH熒光探針在細(xì)胞標(biāo)記中的應(yīng)用。
[0011] 上述pH熒光探針對(duì)H+有熒光選擇性：在PBS緩沖溶液（pH7. 4)中，探針分子的濃 度為 10yM，分別加入H+，等當(dāng)量的Mn2+，Ni2+，F(xiàn)e3+，Zn2+，Cu2+，Cd2+，Ag+，Hg2+，Pb2+，1000 倍的 1(+、似+、0&2+、1% 2+，測定熒光強(qiáng)度的變化，本發(fā)明所述碘化1-甲基-2-(4-羥基-3-甲氧基） 苯乙烯基吡啶鹽對(duì)H+有獨(dú)特的熒光選擇性。
[0012] 本發(fā)明的有益效果：
[0013] 本發(fā)明提供了一種較大光譜移動(dòng)的吡啶鹽類pH熒光探針，實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明在 pH4. 37-10. 30溶液中發(fā)生質(zhì)子化或去質(zhì)子化反應(yīng)，其熒光強(qiáng)度產(chǎn)生相應(yīng)變化。溶液顏色由 綠色變?yōu)榧t色。
[0014] 在pH6. 5到8. 5的變化范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度變化非常明顯，并且常見金屬離子的存在 不會(huì)對(duì)其pH響應(yīng)性能造成干擾，適用于胞內(nèi)中性或弱堿性環(huán)境pH檢測。本化合物具有較 大的Stokes位移（149nm)，可以更好地降低激發(fā)在造影中的干擾。實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明化合物 在乙醇-水（1:9,v/v)溶液中對(duì)H+有獨(dú)特的熒光選擇性、較高的抗其他離子干擾能力，且 熒光光譜具有較大的Stokes位移，在細(xì)胞生物學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用前景。
[0015] 本發(fā)明化合物在不同PH值時(shí)溶液顏色變化非常明顯，顏色由綠色變?yōu)榧t色，可通 過溶液的顏色變化定性判斷環(huán)境的pH值，是一種較好的可視化PH熒光探針，具有操作簡 單，靈敏度高及對(duì)細(xì)胞實(shí)時(shí)原位地觀測pH變化等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明化合物（10yM)的乙醇-水（l:9，V/v)溶液進(jìn)行H+熒光滴定圖；圖 中Intensity為強(qiáng)度，Wavelength為波長；
[0017] 圖2為本發(fā)明化合物（10yM)的乙醇-水（l:9，v/v)溶液中，加入不同體積的HC1 和NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH(4. 37-10. 30)，六個(gè)小瓶從左到右pH分別為4. 37、6. 03、6. 89、7. 90、 9. 05、10. 30,六個(gè)小瓶從左到右顏色變化為：綠色、黃色、橙色、橙紅色，紅色，深紅色；
[0018] 圖3為本發(fā)明化合物（10yM)的乙醇-水（l:9，v/v)溶液中加入其他不同離子后 的熒光強(qiáng)度變化柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明化合物的合成方案如下式所示：
[0020]
[0021] 實(shí)施例1
[0022] -種pH焚光探針，其化學(xué)名稱為：鵬化1_甲基_2_ (4_羥基_3_甲氧基）苯乙稀 基吡啶鹽，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0023] WI 1.^
[0024] 上述化合物的合成步驟如下：
[0025] 稱取0?235g(l.Ommol)碘化1，2-二甲基吡啶鹽和0?316g香草醛于50ml圓底燒 瓶中，加入20ml正丁醇，加0.Olg哌嗪，混合溶液加熱至回流，反應(yīng)45min。TLC檢測反應(yīng) 完成后，冷卻至室溫，有大量固體析出，減壓抽濾，正丁醇重結(jié)晶，得0. 215g黃色固體，產(chǎn)率 58. 3%〇
[0026] 熔點(diǎn)測定：mp:258-261°C
[0027]紅外光譜測定：TR(KBr，cm3 3439, 3103,1634,1618,1594,1566,1522,1247,1128
[0028]核磁共振氫譜測定NMR(400MHZ，DMSO) :S9. 77 (s，1H)，S8. 88 (d，J= 6. 4HZ， 1H)，5 8.49 (d，J= 7. 6HZ，1H)，5 8.43 (m，lH)，5 7.90 (d，J=16Hz，lH)，5 7.82 (m，lH)， S7. 41 (d，J= 1. 6HZ，1H)，S7. 40 (d，J= 16HZ，1H)，S7. 30 (dd，J= 1. 6HZ，8. 4HZ，1H)， 8 6. 88 (d,J= 8. 0HZ, 1H),8 4. 39 (s, 3H),8 3. 90 (s, 3H)
[0029] 本發(fā)明化合物（10yM)的乙醇-水（1:9,v/v)溶液中，加入不同體積的HC1和 NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH(4. 37-10. 30)，pH分別為 4. 37,4. 89,4. 92, 5. 52, 5. 64,6. 23, 7. 0, 7. 08， 7. 46,8. 16,8. 36,8. 7,8. 86,8. 95,9. 1，9. 64,9. 71，9. 95,10. 30 ;進(jìn)行H+熒光滴定測試，如圖 1所示。激發(fā)波長Xex= 375nm，狹縫寬度激發(fā)和發(fā)射均為10nm。由圖1表明：在pH6. 5 到8. 5的變化范圍內(nèi)熒光強(qiáng)度變化非常明顯，可適用于胞內(nèi)中性或弱堿性環(huán)境pH檢測。且 本化合物具有較大的Stokes位移，酸性條件下最大發(fā)射峰為510nm，位移值為135nm;堿性 條件下最大發(fā)射峰為524nm，位移值為149nm。可以更好地降低激發(fā)在造影中的干擾。
[0030] 本發(fā)明化合物（10yM)的乙醇-水（l:9，V/v)溶液中，加入不同體積的HC1和NaOH 水溶液調(diào)節(jié)pH(4. 37-10. 30)，pH分別為 4. 37, 6. 03, 6. 89, 7. 90, 9. 05, 10. 30,溶液顏色變化 分別為綠色、黃色、橙色、橙紅色，紅色，紅色，如圖2所示。由圖2可以看出當(dāng)溶液pH有酸 性到堿性時(shí)，顏色變化為綠色、黃色、橙黃色、紅色，顏色差距明顯，肉眼可視。
[0031] 吡啶鹽類pH熒光探針的應(yīng)用，本發(fā)明化合物對(duì)H+有熒光選擇性：在PBS緩沖溶液 (pH7. 4)中，探針分子的濃度為10yM，分別加入H+等當(dāng)量的Mn2+，Ni2+，F(xiàn)e3+，Zn2+，Cu2+，Cd2+， 八匕取2+，8&2+，1000倍（即101111)的1( +、恥+、0&2+、1%2+，測定熒光強(qiáng)度變化發(fā)現(xiàn) ：本發(fā)明化合 物對(duì)H+的熒光選擇性，對(duì)其它金屬離子有較強(qiáng)的抗干擾能力，如圖3所示，過渡金屬離子的 存在不會(huì)對(duì)本化合物的熒光產(chǎn)生明顯的影響，因此不會(huì)對(duì)其pH熒光響應(yīng)性能產(chǎn)生干擾。另 外細(xì)胞中具有較高濃度的K+、Na+、Ca2+和Mg2+等堿金屬和堿土金屬離子，也不會(huì)對(duì)本化合 物的熒光產(chǎn)生明顯的改變。顯然本化合物具有良好的pH響應(yīng)專一性，符合應(yīng)用到細(xì)胞內(nèi)檢 測pH變化的要求。
[0032] 實(shí)施例2
[0033]稱取0?235g碘化1，2-二甲基吡啶鹽和0?304g香草醛于50ml圓底燒瓶中，加入 20ml正丁醇，加0.Olg哌嗪，混合溶液加熱至回流，反應(yīng)30min。TLC檢測反應(yīng)完成后，冷卻 至室溫，有大量固體析出，減壓抽濾，正丁醇重結(jié)晶，得〇.214g黃色固體。產(chǎn)率58.0%。
[0034] 產(chǎn)物的熔點(diǎn)測定，紅外光譜測定，核磁共振氫譜測定都同實(shí)施例1。
[0035] 實(shí)施例3
[0036] 稱取0? 235g碘化1，2-二甲基吡啶鹽和0? 456g香草醛于50ml圓底燒瓶中，加入 25ml正丁醇，加0. 02g哌嗪，混合溶液加熱至回流，反應(yīng)60min。TLC檢測反應(yīng)完成后，冷卻 至室溫，有大量固體析出，減壓抽濾，正丁醇重結(jié)晶，得0. 215g黃色固體。產(chǎn)率58. 3%。
[0037] 產(chǎn)物的熔點(diǎn)測定，紅外光譜測定，核磁共振氫譜測定都同實(shí)施例1。
[0038] 上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范 圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不 需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種pH焚光探針，其特征是，化學(xué)名稱為：鵬化1-甲基-2-(4-羥基-3-甲氧基）苯 乙烯基吡啶鹽，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：2. 如權(quán)利要求1所述的探針的合成方法，其特征是，將碘化1，2-二甲基吡啶鹽和香草 醛按摩爾比1:1-1:3加入到正丁醇溶液中，加哌嗪，在回流條件下反應(yīng)30-60min，得到碘化 1-甲基-2-(4-羥基-3-甲氧基）苯乙烯基吡啶鹽，所述香草醛與正丁醇溶液的質(zhì)量體積比 為0. 304:20-0. 456:25 ;所述香草醛與所述哌嗪的質(zhì)量比為0. 456:0. 02-0. 316:0. 01。3. 如權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征是，所述回流在加熱至90~KKTC進(jìn)行。4. 如權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征是，所述香草醛與正丁醇溶液的質(zhì)量體積比 為 0?136:20。5. 如權(quán)利要求2所述的合成方法，其特征是，在回流條件下反應(yīng)45min。6. 權(quán)利要求1所述的探針在檢測細(xì)胞內(nèi)pH值的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1所述的探針在細(xì)胞標(biāo)記中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種pH熒光探針，化學(xué)名稱為：碘化1-甲基-2-(4-羥基-3-甲氧基)苯乙烯基吡啶鹽，其合成方法為：將碘化1,2-二甲基吡啶鹽和香草醛按摩爾比1:1-1:3加入到正丁醇溶液中，加哌嗪，在回流條件下反應(yīng)0.5-1小時(shí)，得到碘化1-甲基-2-(4-羥基-3-甲氧基)苯乙烯基吡啶鹽，所述香草醛與正丁醇溶液的質(zhì)量體積比為0.304:20-0.456:25；所述香草醛與所述哌嗪的質(zhì)量比為0.456:0.02-0.316:0.01。本發(fā)明化合物在不同PH值時(shí)溶液顏色變化非常明顯，顏色有綠色變?yōu)榧t色，可通過溶液的顏色變化定性判斷環(huán)境的pH值，是一種較好的可視化PH熒光探針。
【IPC分類】G01N21/64, C09K11/06, C07D213/30
【公開號(hào)】CN105131937
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510439791
【發(fā)明人】丁靜, 葛海燕, 葛燕青, 李艷玲
【申請(qǐng)人】泰山醫(yī)學(xué)院
【公開日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年7月23日