個前角細胞的 尼氏體特征區(qū)域的平均灰度值和面積（％ )，因尼氏體平均灰度與面積（％ )也可反映出神經(jīng) 細胞胞質(zhì)中尼氏體對染色液的親和力的顯示程度(見表2)。
[0054]表2 1~3組與4組在染色脊髓神經(jīng)胞質(zhì)中尼氏體灰度值及面積（％ )
[0056] *P〈0.01VS2組 **P〈0 · 01VS 對照組
[0057]由表2反映出，在3組尼氏體的平均灰度值最低，可見采用本發(fā)明所述染液對尼氏 體含量的顯示程度為最好，而1組尼氏體的平均灰度值最高，說明采用美藍染液對尼氏體含 量的顯示程度為最差，其中，3組和4組的平均灰度值與1組、2組相比，有明顯下降，說明其染 液對尼氏體的含量的顯示程度有明顯的增加，在統(tǒng)計學(xué)上有差異(P〈〇.01);而3組的平均灰 度值與4組相比有明顯下降，在統(tǒng)計學(xué)上有差異(P〈0.01);說明其染液對尼氏體含量的顯示 程度有明顯增加，然而1組和2組之間尼氏體平均灰度的差異相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 同時，也可反映出在實施例染色中，1組面積（％ )明顯小于3組，有非常顯著性差異（P〈 0.01)，4組面積（％ )明顯大于1、2組，但無顯著性差異(P>0.05)，而2組面積（％ )大于1組，但 無顯著性差異(P>〇.〇5)。
[0058]尼氏體的形態(tài)觀察結(jié)果
[0059] 在對1-3組7天、10天和14天染色和4組染色所得的神經(jīng)細胞胞質(zhì)中尼氏體進行觀 察分析，在1組的14天染色中，顯著高于4組和1-3組7天和10天染色笫2組(P〈0.01)，而7天和 10天染色2組之間尼氏體的變化表達發(fā)生的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);在經(jīng)3組14天采 用本發(fā)明所述染液染色后，在正常動物脊髓神經(jīng)細胞胞質(zhì)中布滿著天藍色呈斑網(wǎng)狀尼氏 體;而在它經(jīng)過7天染色后，可在神經(jīng)細胞胞漿中出現(xiàn)淺而少的尼氏體，經(jīng)染色10天后，神經(jīng) 細胞胞質(zhì)中尼氏體數(shù)量比7天中的尼氏體稍多，可見隨著染色時間的延長，尼氏體的著色數(shù) 量會有所增加，直至14天染色后，尼氏體著色增加不在顯著。由附圖4統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，1-3組與4組尼氏體平均灰度之間，發(fā)生的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
[0060]由此可見，經(jīng)這4種染液染色所獲得的染色效果優(yōu)劣不一，1組染液染色效果不如 其余3組，其中，2組背景顏色的對比效果較3組染色液稍差，而3組的細胞胞質(zhì)中的尼氏體染 色背景顏色對比度在4組中為最好，便于觀察以及3組染液染色的鮮艷程度、清晰程度和重 復(fù)使用率優(yōu)于其它3個組的配制方法(P〈0.05);而4組染色時間最短，但著色偏深，而且染液 配制過程中較為繁瑣，使用不方便。
[0061]總的說來，在1~4組染色效果上進行比較，它們均可染出尼氏體，而3組染液的染 色效果為最佳，細胞中尼氏體呈天藍色，核仁、核膜及核染色質(zhì)分辨良好;而4組染色結(jié)果優(yōu) 于1組和2組。在實驗組（1~3組）以及對照組(4組）的染色結(jié)果相比較，4組能清晰的顯示出 神經(jīng)細胞質(zhì)中尼氏體成分，但其結(jié)果稍遜于3組，故選用3組（即本發(fā)明所述染液，染色14天） 進行染色，能更好的達到提高實驗教學(xué)與科研質(zhì)量的要求。此外，也可對脊髓神經(jīng)細胞胞質(zhì) 中尼氏體的染色與制作切片的好壞，以及對測量的可靠性與評估的客觀性指標(biāo)都具有一定 的影響，所以，對脊髓切片染色與制作技術(shù)的進一步提高，將有助于測量與分析法的更廣 泛、更有效的應(yīng)用。
[0062] 本發(fā)明所述染液進行染色的具體實施例如下：
[0063] 染液 1:
[0064] 該染液1由美藍、硫堇、氯化鈉以及70 % -80 %的乙醇溶液組成，乙醇溶液作為溶 劑：
[0065] (1)質(zhì)量百分比為1 %或0.8 %的硫堇乙醇染色液；
[0066] (2)質(zhì)量百分比為1 %的美藍乙醇染色液；
[0067] (3)按硫堇乙醇染色液:美藍乙醇染色液:0.9%氯化鈉溶液的體積比為1:1:9進行 配制成神經(jīng)細胞尼氏體染液。
[0068]染液 2:
[0069] 該染液2由美藍、硫堇、氯化鈉以及70 % -80 %的乙醇溶液組成，乙醇溶液作為溶 劑：
[0070] (1)質(zhì)量百分比為1 %或1 %的硫堇乙醇染色液；
[0071] (2)質(zhì)量百分比為1 %的美藍乙醇染色液；
[0072] (3)按硫堇乙醇染色液:美藍乙醇染色液:0.9%氯化鈉溶液的體積比為1:1:9進行 配制成神經(jīng)細胞尼氏體染液。
[0073]染液 3:
[0074] 該染液3由美藍、硫堇、氯化鈉以及70 % -80 %的乙醇溶液組成，乙醇溶液作為溶 劑：
[0075] (1)質(zhì)量百分比為1 %或0.8 %的硫堇乙醇染色液；
[0076] (2)質(zhì)量百分比為1 %的美藍乙醇染色液；
[0077] (3)質(zhì)量百分比為0.1-0.2%的天青A乙醇染色液；
[0078] (4)質(zhì)量百分比為0.1-0.2%的天青B乙醇染色液；
[0079] (5)按硫堇乙醇染色液：美藍乙醇染色液：天青A乙醇染色液：天青B乙醇染色液： 0.9%氯化鈉溶液的體積比為1:1:1:1:9進行配制成神經(jīng)細胞尼氏體染液。
[0080] 染液 4:
[0081 ] 該染液4由美藍、硫堇、氯化鈉以及70 % -80 %的乙醇溶液組成，乙醇溶液作為溶 劑：
[0082] (1)質(zhì)量百分比為1 %或1 %的硫堇乙醇染色液；
[0083] (2)質(zhì)量百分比為1 %的美藍乙醇染色液；
[0084] (3)質(zhì)量百分比為0.1-0.2 %的天青A乙醇染色液；
[0085] (4)質(zhì)量百分比為0.1-0.2%的天青B乙醇染色液；
[0086] (5)按硫堇乙醇染色液：美藍乙醇染色液：天青A乙醇染色液：天青B乙醇染色液： 0.9%氯化鈉溶液的體積比為1:1:1:1:9進行配制成神經(jīng)細胞尼氏體染液。
[0087] 取貓脊髓的頸或腰膨大處的組織，橫切長為0.4~0.5cm的組織4塊，放入固定液固 定16~20小時；其中固定液是由體積比為1:3:16的冰醋酸、40 %甲醛溶液、70 %酒精液組 成。再取出脊髓組織經(jīng)蒸餾水洗洗后，等自然干燥，經(jīng)1%火棉膠液處理短時，取出等自然干 燥后，放入配制好的染液1-4中分別染色14天;入5%的鉬酸銨溶液處理20~24小時，入95% 酒精，100%酒精脫水各2小時，入二甲苯透明6小時后，軟蠟浸2次，每次30~40分鐘;硬蠟浸 2次，每次60分鐘；常規(guī)石蠟包埋。用石蠟切片機將蠟塊切成厚5微米的蠟帶；展片與烘干24 ~48小時后，經(jīng)二甲苯脫蠟2次，各20~30分鐘，用中性樹膠封固。顯微鏡下觀察結(jié)果：染液 1-4染色后的貓神經(jīng)組織切片均細胞染色清晰，尼氏體分布豐富而均勻，呈天藍色至蘭紫 色，與藍色的細胞核有明顯的區(qū)別。
[0088] 表3、染液1-4對應(yīng)的組織切片染色效果
[0089]
[0090] 以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出的是，上述優(yōu)選實施方式不應(yīng)視為對 本發(fā)明的限制，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)當(dāng)以權(quán)利要求所限定的范圍為準(zhǔn)。對于本技術(shù)領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，還可以做出若干改進和潤飾，這些改 進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種用于神經(jīng)組織尼氏體染色的染料組合物，其特征在于：所述染料組合物由W下 組分按重量份組成：1.0重量份美藍和0.8-1.0重量份硫堇；所述美藍的分子結(jié)構(gòu)式如下：所述硫堇的分子結(jié)構(gòu)式如下：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于神經(jīng)組織尼氏體染色的染料組合物，其特征在于:所述染 料組合物由W下組分按重量份組成：1.0重量份美藍和1.0重量份硫堇。3. 權(quán)1-權(quán)2任一所述的染料組合物形成的神經(jīng)組織尼氏體染液，其特征在于:所述染液 由美藍、硫堇、氯化鋼W及70%-80%的乙醇溶液組成，乙醇溶液作為溶劑： (1) 質(zhì)量百分比為1%或〇.8%-1%的硫堇乙醇染色液； (2) 質(zhì)量百分比為1%的美藍乙醇染色液； (3) 按硫堇乙醇染色液:美藍乙醇染色液:0.9%氯化鋼溶液的體積比為1:1:9進行配制 成神經(jīng)細胞尼氏體染液。4. 一種用于神經(jīng)組織尼氏體染色的染料組合物，其特征在于：所述染料組合物由W下 組分按重量份組成：1.0重量份美藍、0.8-1.0重量份硫堇、0.1-〇. 2重量份天青A和0.1-〇. 2 重量份天青B;所述天青A的分子結(jié)構(gòu)式如下：所述天青B的分子結(jié)構(gòu)式如下5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于神經(jīng)組織尼氏體染色的染料組合物，其特征在于:所述染 料組合物由W下組分按重量份組成：1.0重量份美藍、1.0重量份硫堇、0.1-0.2重量份天青A 和0.1-0.2重量份天青B。6. 權(quán)4-權(quán)5任一所述的染料組合物形成的神經(jīng)組織尼氏體染液，其特征在于:所述染液 由美藍、硫堇、氯化鋼W及70%-80%的乙醇溶液組成，乙醇溶液作為溶劑： (1) 質(zhì)量百分比為1%或〇.8%-1%的硫堇乙醇染色液； (2) 質(zhì)量百分比為1%的美藍乙醇染色液； (3) 質(zhì)量百分比為0.1-0.2%的天青A乙醇染色液； (4) 質(zhì)量百分比為0.1-0.2%的天青B乙醇染色液； (5)按硫堇乙醇染色液：美藍乙醇染色液:天青A乙醇染色液:天青B乙醇染色液:0.9% 氯化鋼溶液的體積比為1:1:1:1:9進行配制成神經(jīng)組織尼氏體染液。7. -種對神經(jīng)組織尼氏體染色的染色方法，其特征在于:所述染色方法包括W下步驟： 1)動物組織用固定液固定20-24小時后干燥； 2) 放入權(quán)3或權(quán)6任一所述的染液進行染色7-14天； 3) 固定處理20-24小時； 4) 乙醇分色與脫水、石蠟包埋切片。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的染色方法，其特征在于:所述步驟1)中動物組織為整塊的動物 神經(jīng)組織。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的染色方法，其特征在于：所述步驟1)中固定液由W下成分組 成:冰醋酸、40 %甲醒溶液、70 %酒精液按體積比為1:3:16。10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的染色方法，其特征在于:所述步驟1)中干燥的方式為固定液 固定所得動物組織經(jīng)自然干燥后，再放入1 %火棉膠液中處理，再次自然干燥;所述步驟3) 中固定處理為將步驟2)所得染色后動物組織放入5%的鋼酸錠水溶液中固定處理20-24小 時;所述步驟4)中所述乙醇為95%-100%乙醇溶液。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種生物組織染色領(lǐng)域，具體涉及一種用于神經(jīng)組織尼氏體染色的染料組合物、染液及染色方法。所述用于神經(jīng)組織尼氏體染色的染料組合物由以下組分按重量份組成：1.0重量份美藍和0.8-1.0重量份硫堇；經(jīng)本發(fā)明所述染料組合物染色后的動物神經(jīng)組織切片的分辨率、美觀度和清晰度幾個方面均比傳統(tǒng)的Pischinger氏染色方法以及其它幾種單種染色液染色方法的效果更好。
【IPC分類】G01N1/30, C09B21/00, C09B67/22
【公開號】CN105504873
【申請?zhí)枴緾N201510848670
【發(fā)明人】龔林, 候思奎, 陳明
【申請人】龔林, 候思奎, 陳明
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年11月26日