Rgd功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料、其修飾方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種RGD功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料，其修飾方法及應(yīng)用，屬于納米材料領(lǐng)域。所述納米材料由以下修飾方法得到：(一)利用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺?聚乙二醇通過配體交換方法將油酸修飾的納米粒改性為表面氨基化的水溶性粒子；(二)將羧基化的2?氰基苯并噻唑偶聯(lián)到表面氨基化的水溶性粒子表面；(三)接著在RGD功能多肽分子氨基端構(gòu)建出半胱氨酸末端殘基；(四)將含有半胱氨酸殘基的多肽特異性修飾到特異性連接臂修飾的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米粒表面，制成RGD功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料具有非常強的靶向腫瘤能力，具有廣泛的應(yīng)用價值。
【專利說明】
RGD功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料、其修飾方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及納米材料領(lǐng)域，具體地說是一種RGD功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米 材料，其修飾方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 上轉(zhuǎn)換納米材料是一種熒光納米材料，通過稀土離子的摻雜由低能量紅外或者近 紅外光激發(fā)，輻射出高能量的可見光。稀土摻雜NaYF4:Yb/Er可以通過對稀土元素?fù)诫s比例 的調(diào)節(jié)實現(xiàn)多色發(fā)光，也可以通過對摻雜元素種類進行調(diào)節(jié)，實現(xiàn)磁學(xué)和光學(xué)的多模態(tài)信 號轉(zhuǎn)換。上轉(zhuǎn)換熒光納米材料是已知的最有效的可以實現(xiàn)多模態(tài)顯像的納米材料之一，在 生物分析化學(xué)和生物成像等方面有著巨大潛力。
[0003] 為了實現(xiàn)納米材料的生物功能，需要對其表面進行功能化修飾。在生物學(xué)功能化 方面，針對不同的生物分子，如寡聚核苷酸、蛋白質(zhì)(含抗原、抗體、酶）、多肽等，不同的修飾 方法已經(jīng)被用來對上轉(zhuǎn)化納米粒表面進行功能化修飾。其中將革E分子和納米粒表面之間的 氨基和羧基偶聯(lián)反應(yīng)是對納米材料功能化的首選方案，比如，Sisi Cui等人(ACS Nano, 2013,1,676-688.)利用靶向葉酸受體的葉酸分子作為靶標(biāo)分子，將其羧基用N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)和二環(huán)己基碳酰亞胺(DDC)活化，然后與稀土上轉(zhuǎn)化納米材料表面親水性配體殼 聚糖上氨基進行偶聯(lián)，通過酰胺鍵的形式將葉酸分子的羧基和納米顆粒表面的氨基相連 接，從而構(gòu)建了靶向到癌部位的納米顆粒。但所用到的葉酸為小分子靶標(biāo)，結(jié)構(gòu)簡單易于結(jié) 構(gòu)修飾，對于多肽或者蛋白這種方法存在明顯不足，最突出的問題就是由于多肽或者蛋白 質(zhì)分子中可反應(yīng)的氨基通常不止一個而使產(chǎn)物中存在大量的異構(gòu)體，而且如果氨基恰好處 于蛋白質(zhì)的生物活性位點上，則可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的失活。同時，這種連接方法反應(yīng)活性較 低，連接到納米材料表面的生物分子較少。
[0004] 由于上述方法在標(biāo)記過程當(dāng)中的非特異性標(biāo)記，基于"點擊化學(xué)"的修飾方法受到 了越來越多的關(guān)注，比如Joshua I .Cutler等人(Nano·Lett ,2010，10，1477-1480)，首先將 寡核苷酸的末端構(gòu)建出炔基，接著將納米粒表面修飾出疊氮基團，通過"點擊化學(xué)"將靶寡 核苷酸分子修飾在納米粒表面完成對納米粒的功能化修飾，但是炔基和疊氮基團之間的縮 合反應(yīng)，通常是需要在銅離子的介導(dǎo)下才能完成的。眾所周知，銅作為一種常見的重金屬離 子，在生理條件下能影響生物大分子構(gòu)象的變化，從而使其功能受到影響。所以，在修飾納 米材料的過程當(dāng)中會不可避免的影響到納米粒表面生物大分子的功能。同時由于純化不徹 底造成銅離子的殘留，會有潛在的生物毒性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種RGD功能多肽修飾的稀 土上轉(zhuǎn)化納米材料。
[0006] 本發(fā)明進一步的技術(shù)任務(wù)是提供上述納米材料的修飾方法。
[0007] 本發(fā)明更進一步的技術(shù)任務(wù)是提供上述納米材料的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是按以下方式實現(xiàn)的：RGD功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材 料，其特點是由以下修飾方法得到：
[0009] 首先利用二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇（DSPE-PEG-OH和DSPE-PEG-Nh2)通 過配體交換方法將油酸修飾的納米粒改性為表面氨基化的水溶性粒子；
[0010] 隨后將羧基化的2-氰基苯并噻唑(COOH-CBT)偶聯(lián)到表面氨基化的水溶性粒子表 面，得到特異性連接臂修飾的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米粒；
[0011] 接著在RGD功能多肽分子氨基端構(gòu)建出半胱氨酸末端殘基，得到半胱氨酸修飾的 RGD功能多肽；
[0012] 最后將半胱氨酸修飾的RGD功能多肽特異性修飾到特異性連接臂修飾的水溶性稀 土上轉(zhuǎn)化納米粒表面，制成R⑶功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料。
[0013] 修飾反應(yīng)式為：
[0014]
[00?5 ]作為優(yōu)選，上述稀土上轉(zhuǎn)化納米材料RGD功能多肽的修飾方法包括以下步驟：
[0016] 1)表面氨基化的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米材料的制備：
[0017] 取表面油酸包裹的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料用三氯甲烷分散，加入二硬脂?；字?乙醇胺-聚乙二醇，超聲反應(yīng)一定時間后減壓濃縮除去三氯甲烷，純化得到聚乙二醇(PEG) 修飾的表面氨基化的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米材料，如采用去離子水重新分散離心，棄去上 清液(除去未包裹的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇），得到聚乙二醇(PEG)修飾的表面 氨基化的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米材料；
[0018] 2)水溶性稀土上轉(zhuǎn)換納米材料表面特異性連接臂修飾：
[0019] 將羧基化的2-氰基苯并噻唑（COOH-CBT)的羧基活化，制備成琥珀酰亞胺酯溶液， 接著將氨基化的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米材料用三氯甲烷分散，將制備得到的琥珀酰亞胺酯 溶液加入到納米材料分散液中，加入一定量的堿，反應(yīng)完成后，除去未反應(yīng)的原料(如未反 應(yīng)的羧基化的2-氰基苯并噻唑），并提純得到特異性連接臂修飾的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米 材料；
[0020] 3)半胱氨酸修飾的RGD功能多肽：
[0021]在R⑶功能多肽溶液中加入N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯 (B0c-NH2-Cys(Trt)-OSu)，調(diào)節(jié)體系pH值至8-8.5，使RGD功能多肽的末端氨基與N-叔丁氧 羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯偶聯(lián)制備出含有受保護半胱氨酸殘基的多肽， 接著將得到的保護性多肽在裂解液的作用下，脫去半胱氨酸的保護基團，并用半制備HPLC 純化，得到半胱氨酸修飾的RGD功能多肽；
[0022] 4)稀土上轉(zhuǎn)化納米材料表面R⑶功能化多肽修飾：
[0023]將步驟1)得到的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米材料的碳酸鹽緩沖溶液，加入步驟3)得到 的半胱氨酸修飾的RGD功能多肽的碳酸鹽緩沖溶液中，同時加入防止巰基氧化的還原劑，反 應(yīng)一段時間后，純化得到R⑶功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料。
[0024] 步驟1)所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG-Oi^PDSPE-PEG-NH 2) 優(yōu)選為二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇3000或二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇 2000。二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇混合液中二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG-NH2)的摩爾百分比率為5%-20 %，總二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇總濃度為10-40mM。超聲反應(yīng)的反應(yīng)時間優(yōu)選為10-40min。
[0025] 步驟2)所述羧基化的2-氰基苯并噻唑(COOH-CBT)的結(jié)構(gòu)式如下：
[0026]
[0027] 式中，X為氧原子或者氮原子;m為0、1、2、3或者4。
[0028]步驟2)中活化羧基所用的活化劑優(yōu)選為二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)和N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)，以摩爾比計，其反應(yīng)當(dāng)量關(guān)系為羧基化的2-氰基苯并噻唑:二環(huán)己基碳酰亞胺： N-羥基琥珀酰亞胺= 1:(1-1.5) :(1-1.5);
[0029]所述堿為N，N-二異丙基乙胺(DIEA)和/或者三乙胺(TEA);
[0030] 加入堿后再反應(yīng)時間3-5h。
[0031 ]步驟3)所述半胱氨酸修飾的RGD功能多肽具有式(I)所示的結(jié)構(gòu)：
[0032]
[0033]式（I)中，半胱氨酸為L構(gòu)型或者D構(gòu)型。
[0034]步驟3)中，在RGD功能多肽溶液中加入N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥 珀酰亞胺酯(Boc-NH2-Cy s (Trt)-OSu)的具體方法優(yōu)選為:N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-半胱 氨酸琥珀酰亞胺酯(B0c-NH 2-Cys(Trt)-OSu)先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲基亞砜，隨后 再將N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯(B 0c-NH2-Cys(Trt)-OSu)溶液 加入到含有R⑶功能多肽的碳酸鹽緩沖體系中，N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥 珀酰亞胺酯與RGD功能多肽的摩爾比率范圍為（I. 2-1.5):1，偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)時間為0.5-lh〇
[0035]步驟3)中可以選用現(xiàn)有技術(shù)中任意一種堿劑進行pH值調(diào)節(jié)，優(yōu)先為以N，N_二異丙 基乙胺(DIEA)和/或者三乙胺(TEA)調(diào)節(jié)體系pH值至8-8.5。
[0036]步驟3)中所述裂解液可選用現(xiàn)有技術(shù)中任意一種裂解液，如三氟乙酸/二氯甲烷 體系或三氟乙酸/三異丙基硅烷/和去離子水體系，但為了達(dá)到最佳效果，優(yōu)選為三氟乙酸 (TFA)、三異丙基硅烷(TIS)和去離子水(H 2O)的混合溶液，三氟乙酸、三異丙基硅烷和去離 子水的體積百分比為95% : 1-5% : 1-5%，反應(yīng)時間為5-10min。
[0037] 步驟4)中所述還原劑優(yōu)選為三（2-羰基乙基）磷鹽酸鹽(TCEP'HCl)，三(2-羰基乙 基）磷鹽酸鹽與半胱氨酸修飾的RGD功能多肽的摩爾比率范圍為（2-5):1，反應(yīng)時間為5-IOmin0
[0038]通過大量實驗可以看出，本發(fā)明的R⑶功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料具有 非常強的靶向腫瘤能力，在制備腫瘤組織的靶向檢測制劑中可以得到廣泛的應(yīng)用。
【附圖說明】
[0039]附圖1為實施例中脫掉半胱氨酸側(cè)鏈保護后的C(RGDfK)多肽高分辨質(zhì)譜圖；
[0040]附圖2為實施例中功能性c (RGDf K)多肽對稀土上轉(zhuǎn)化納米材料修飾前后的透射電 鏡(TEM)圖；
[0041 ]附圖3為實施例中功能性C(RGDfK)多肽對稀土上轉(zhuǎn)化納米材料修飾前后在980nm 激發(fā)光激發(fā)下的熒光發(fā)射圖；
[0042]附圖4為實驗例中注射納米材料后的活體熒光成像圖。
[0043]實施方式
[0044] 下面的實施例、制劑實施例以更詳細(xì)地說明本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0045] 【實施例1】
[0046]本發(fā)明的R⑶功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料由以下修飾方法得到：
[0047] (1)表面氨基化的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米材料的制備
[0048] 稱取20.2mg的油酸包裹的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料(OA-UCNPs)分散于IOmL三氯甲烷 中，再稱取二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇3000(DSPE-PEG3Q(X)-OH和DsPE-PEG3(XX)-NH 2) 10.2mg溶于5mL的三氯甲烷，共同加入至lj50mL圓底燒瓶中，室溫下超聲處理30min，然后用減 壓濃縮除去三氯甲烷，得到的白色固體用5mL去離子水超聲分散后，再用超純水清洗3次，除 去未包裹的二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇3000, 1000 Or X 5min離心5min，沉淀真空干 燥得到白色粉末，即表面氨基化的水溶性稀土上轉(zhuǎn)換納米材料。
[0049] 所用的二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇3000中DsPE-PEG3(XX)-NH2摩爾百分比率 為10%，總二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇3000濃度為20mM。
[0050] (2)特異性連接臂的制備
[0051]
[0052] 取化合物1 (2-氰基-6-羥基苯并噻唑）（350.4mg，2mmol)于反應(yīng)瓶中，加入化合物 溴乙酸叔丁酯2 (390 · 3mg，3mmoI)，碳酸鉀（I · 39g，IOmmo I)及6mL的無水N，N-二甲基甲酰胺， 100°C下攪拌回流，TLC檢測反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻反應(yīng)液，用水-二氯甲烷體系萃取2次，合 并有機層，無水碳酸鈉干燥后減壓濃縮，硅膠柱分離純化，最終得到淡黃色固體粉末(化合 物3)499.411^，產(chǎn)率86%。1!1匪1?(〇)(：13,40冊!^)57.95((1，1!1，了 = 8.9)，6.98((1(1，1!1，了 = 2.3,8.9),6.94(d,lH ,J = 2.3),4.9(br t, 1H) ,3.89(d,2H ,J = 5.1), 1,5(s,9H) .MS:calcd for C14H16N3O2S 290.1 ,found 290.3〇
[0053]
[0054] 稱取化合物3 50.4mg于反應(yīng)瓶中，加入三氟乙酸5mL，冰浴下反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后， 減壓濃縮反應(yīng)液，硅膠柱分離純化，最終得到淡黃色固體粉末(化合物4一一羧基化的2-氰 基苯并噻唑）36.711^，產(chǎn)率91%。1!1匪1?(0)3〇0,40010^)57.87((1，1!1，了 = 9.8)，7.04-7.08 (m,2H),3.99(s,2H).MS:calcd for CioH8N3O2S 234.0,found 234.2〇
[0055] (3 )PEG化的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料表面C00H-CBT修飾
[0056]稱取20.3mg的特異性連接臂（羧基化的2-氰基苯并噻唑，C00H-CBT)溶于2mL的N， N-二甲基甲酰胺，加入21 .Img二環(huán)己基碳酰亞胺(DCC)和11.8mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 反應(yīng)時間為3h，過濾除去沉淀，保留濾液備用。稱取20.3mg的氨基化的水溶性稀土上轉(zhuǎn)換納 米材料分散于5mL的N，N-二甲基甲酰胺中，再將上述特異性連接臂活化酯溶液加入到納米 材料溶液中，然后加入33. Img N，N-二異丙基乙胺(DIEA)，在室溫下攪拌3h，之后將體系離 心，收集底部沉淀，依次用N，N-二甲基甲酰胺(2次)和超純水(2次)清洗，除去未反應(yīng)的特異 性連接臂，1000 Or X 5min離心，沉淀真空干燥得到白色粉末，即偶聯(lián)有連接臂的水溶性稀土 上轉(zhuǎn)換納米材料。
[0057] (4)RGD功能性多肽的半胱氨酸修飾
[0058] 稱取N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯Boc-NH2-Cy s (Trt)- OSu 26.8mg溶于200yL二甲基甲酰胺;稱取環(huán)狀五肽c (RGDfK) 19.3mg用300yL碳酸鹽緩沖體 系溶解，將Boc-NH2-Cys(Trt)-OSu二甲基甲酰胺加入到多肽水溶液中，以N，N-二異丙基乙 胺調(diào)節(jié)體系pH=8.2，室溫下反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后用半制備HPLC純化目標(biāo)產(chǎn)物，收集相應(yīng) 餾分，最終得到白色凍干粉，隨后稱取產(chǎn)物25.3mg，加入裂解液ImU室溫下反應(yīng)10min。反應(yīng) 液傾入IOmL冰乙醚中，出現(xiàn)大量白色絮狀沉淀，離心收集白色沉淀用去500yL離子水復(fù)溶， 最終用半制備HPLC純化目標(biāo)多肽，收集相應(yīng)餾分，最終得到白色凍干粉(半胱氨酸修飾的 RGD功能多肽）。
[0059]如附圖1所示，脫掉半胱氨酸側(cè)鏈保護后的C(RGDfK)多肽分子離子峰[M+H] +為 707.3283，其理論值為 707.3294。
[0000] (5)稀土上轉(zhuǎn)換納米材料環(huán)狀五肽C(RGDfK)功能化修飾
[00611稱取20.2mg的偶聯(lián)有特異性連接臂的水溶性稀土上轉(zhuǎn)換納米材料，分散于5mL的 碳酸鹽緩沖體系，再稱取2. Img的末端半胱氨酸化的多肽(半胱氨酸修飾的RGD功能多肽)溶 于500yL的碳酸鹽緩沖體系，稱取1.6mg三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽(TCEP.HC1)加入到多肽水 溶液中，隨后將多肽溶液加入到偶聯(lián)有特異性連接臂的水溶性稀土上轉(zhuǎn)換納米材料中，以 N，N-二異丙基乙胺調(diào)節(jié)體系酸堿度，使反應(yīng)體系pH值為8.2,在室溫下攪拌反應(yīng)lOmin，之后 將體系離心，收集底部沉淀，用超純水清洗3次，除去未反應(yīng)的多肽，1000 Or X 5min離心，沉 淀真空干燥得到淡黃色固體粉末，即c (RGDf K)功能化的稀土上轉(zhuǎn)換納米材料。
[0062]所述裂解液成分為三氟乙酸(TFA)，三異丙基硅烷(TIS)和去離子水(H2O)的混合 溶液，其體積百分比為TFA/TIS/H20 (95%:2.5%:2.5%)。
[0063]本發(fā)明的RGD功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料具有非常強的靶向腫瘤能力。 通過下面試驗例及應(yīng)用試驗進行詳細(xì)說明。
[0064]【試驗例一】
[0065]對功能性C(RGDfK)多肽對稀土上轉(zhuǎn)化納米材料修飾前后做透射電鏡(TEM)。圖2左 圖為特異性連接臂偶聯(lián)的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米材料的透射電鏡（TEM)圖；右圖為c (RGDfK)功能化修飾后的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料的透射電鏡(TEM)圖；從透射電鏡圖看出多肽 功能化修飾前后對其粒徑基本無影響。
[0066]【試驗例二】
[0067]以980nm激發(fā)光激發(fā)修飾前后的功能性C(RGDfK)多肽對稀土上轉(zhuǎn)化納米材料。圖3 虛線為特異性連接臂偶聯(lián)的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米材料的熒光發(fā)射譜;實線圖為C(RGDfK) 功能化修飾后的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料的熒光發(fā)射譜。從熒光發(fā)射譜看出多肽功能化修飾前 后對其熒光發(fā)射譜基本無影響。
[0068]【應(yīng)用試驗】
[0069] 應(yīng)用步驟：
[0070] (1)4T1荷瘤裸鼠動物模型的建立：
[0071] (2)c(RGDfK)功能化稀土上轉(zhuǎn)化納米材料4Τ1乳腺癌靶向近紅外熒光成像：
[0072] 1)4T1荷瘤裸鼠動物模型的建立:4T1小鼠的乳腺癌細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。 收集細(xì)胞，離心，反復(fù)洗滌3次，最終將細(xì)胞重懸，得到5xl06/mL的4Τ1細(xì)胞懸液，吸取IOOyL 皮下注射入Athymic nude小鼠，形成種植瘤模型。當(dāng)腫瘤總體積達(dá)IOOmm3時進行活體成像 實驗。
[0073] 2)4T1乳腺癌靶向近紅外熒光成像:實驗組所用材料為C(RGDfK)功能化稀土上轉(zhuǎn) 化納米材料將功能化上轉(zhuǎn)化納米粒;對照組實驗所用為未經(jīng)修飾的上轉(zhuǎn)化納米粒。兩種納 米材料都稀釋到1.5mg/mL，尾靜脈注射進荷瘤模型小鼠（200μ!7小鼠），使用經(jīng)980nm激發(fā)光 源改造過的Lumina 11小動物活體成像系統(tǒng)進行活體光學(xué)成像。激發(fā)光波長980nm，功率密 度為0.5W/cm2,發(fā)射光譜濾光片為790nm-810nm。注射后對不同組別的不同4T1荷瘤裸鼠進 行腫瘤區(qū)域光學(xué)成像。
[0074]圖4左圖為實驗組(注射C(RGDfK)功能化上轉(zhuǎn)化納米粒），右圖為對照組(注射未經(jīng) 功能化上轉(zhuǎn)化納米粒）。通過圖4可以發(fā)現(xiàn)左圖腫瘤區(qū)域的信號明顯強于右圖相應(yīng)位置的信 號，說明經(jīng)過靶向多肽修飾后的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料其靶向腫瘤能力有明顯提高。
【主權(quán)項】
1. R⑶功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料，其特征在于由以下修飾方法得到： 首先利用二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇通過配體交換方法將油酸修飾的納米粒 改性為表面氨基化的水溶性粒子； 隨后將羧基化的2-氰基苯并噻唑偶聯(lián)到表面氨基化的水溶性粒子表面，得到特異性連 接臂修飾的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米粒； 接著在RGD功能多肽分子氨基端構(gòu)建出半胱氨酸末端殘基，得到半胱氨酸修飾的RGD功 能多肽； 最后將半胱氨酸修飾的R⑶功能多肽特異性修飾到特異性連接臂修飾的水溶性稀土上 轉(zhuǎn)化納米粒表面，制成R⑶功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的R G D功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料，其特征在于，所述 修飾方法包括以下步驟： 1) 表面氨基化的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米材料的制備： 取表面油酸包裹的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料用三氯甲烷分散，加入二硬脂?；字Ｒ掖?胺-聚乙二醇，超聲反應(yīng)一定時間后減壓濃縮除去三氯甲烷，純化得到聚乙二醇修飾的表面 氨基化的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米材料； 2) 水溶性稀土上轉(zhuǎn)換納米材料表面特異性連接臂修飾： 將羧基化的2-氰基苯并噻唑的羧基活化，制備成琥珀酰亞胺酯溶液，接著將氨基化的 水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米材料用三氯甲烷分散，將制備得到的琥珀酰亞胺酯溶液加入到納米 材料分散液中，加入一定量的堿，反應(yīng)完成后，除去未反應(yīng)的原料，并提純得到特異性連接 臂修飾的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米材料； 3) 半胱氨酸修飾的RGD功能多肽： 在RGD功能多肽溶液中加入N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯，調(diào) 節(jié)體系pH值至8-8.5,使R⑶功能多肽的末端氨基與N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸 琥珀酰亞胺酯偶聯(lián)制備出含有受保護半胱氨酸殘基的多肽，接著將得到的保護性多肽在裂 解液的作用下，脫去半胱氨酸的保護基團，并用半制備HPLC純化，得到半胱氨酸修飾的RGD 功能多肽； 4) 稀土上轉(zhuǎn)化納米材料表面RGD功能化多肽修飾： 將步驟1)得到的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米材料的碳酸鹽緩沖溶液，加入步驟3)得到的半 胱氨酸修飾的RGD功能多肽的碳酸鹽緩沖溶液中，同時加入防止巰基氧化的還原劑，反應(yīng)一 段時間后，純化得到R⑶功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的R G D功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料，其特征在于:步驟 1) 所用的二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇混合液中二硬脂?；字Ｒ掖及返哪柊?分比率為5%-20%，總二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇總濃度為10-40mM，超聲反應(yīng)的 反應(yīng)時間為10-40min。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的R G D功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料，其特征在于:步驟 2) 所述羧基化的2-氰基苯并噻唑的結(jié)構(gòu)式如下：式中，X為氧原子或者氮原子;m為0、1、2、3或者4。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的RGD功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料，其特征在于:步驟 2) 中活化羧基所用的活化劑為二環(huán)己基碳酰亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺，以摩爾比計，其反 應(yīng)當(dāng)量關(guān)系為羧基化的2-氰基苯并噻唑：二環(huán)己基碳酰亞胺:N-羥基琥珀酰亞胺=1: (1-1.5):(1-1.5)； 所述堿為N，N-二異丙基乙胺和/或者三乙胺； 加入堿后再反應(yīng)時間3-5h。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的R G D功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料，其特征在于:步驟 3) 所述半胱氨酸修飾的RGD功能多肽具有式(I)所示的結(jié)構(gòu)：式(I)中，半胱氨酸為L構(gòu)型或者D構(gòu)型。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的R G D功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料，其特征在于:步驟 3) 中N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯先溶解于二甲基甲酰胺或者二甲 基亞砜，隨后再將N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯溶液加入到含有 RGD功能多肽的碳酸鹽緩沖體系中，N-叔丁氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸琥珀酰亞胺酯 與R⑶功能多肽的摩爾比率范圍為(1.2-1.5): 1，偶聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)時間為0.5-lh; 所述裂解液為三氟乙酸、三異丙基硅烷和去離子水的混合溶液，三氟乙酸、三異丙基硅 燒和去離子水的體積百分比為95% : 1-5% : 1-5%，反應(yīng)時間為5-10min。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的R G D功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料，其特征在于:步驟 4) 中所述還原劑為三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽，三(2-羰基乙基)磷鹽酸鹽與半胱氨酸修飾的 R⑶功能多肽的摩爾比率范圍為(2-5): 1，反應(yīng)時間為5-10min。9. 稀土上轉(zhuǎn)化納米材料R⑶功能多肽的修飾方法，其特征在于： 首先利用二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇通過配體交換方法將油酸修飾的納米粒 改性為表面氨基化的水溶性粒子； 隨后將羧基化的2-氰基苯并噻唑偶聯(lián)到表面氨基化的水溶性粒子表面，得到特異性連 接臂修飾的水溶性稀土上轉(zhuǎn)化納米粒； 接著在RGD功能多肽分子氨基端構(gòu)建出半胱氨酸末端殘基，得到半胱氨酸修飾的RGD功 能多肽； 最后將半胱氨酸修飾的R⑶功能多肽特異性修飾到特異性連接臂修飾的水溶性稀土上 轉(zhuǎn)化納米粒表面，制成R⑶功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料。10.權(quán)利要求1所述RGD功能多肽修飾的稀土上轉(zhuǎn)化納米材料在制備腫瘤組織的祀向檢 測制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C09K11/06GK105860962SQ201610326562
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】袁雙虎, 劉治國, 黃勇, 楊國仁, 趙書強, 賈永峰, 于金明
【申請人】山東省腫瘤醫(yī)院