超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷工藝的制作方法
【專利摘要】為解決藍(lán)靛果花色苷提取效率低問(wèn)題，本發(fā)明提供了超聲波?微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷工藝，該具體過(guò)程為：步驟a,原料預(yù)處理；步驟b,酸化乙醇與原料混合；步驟c,超聲波?微波協(xié)同處理；步驟d,分離；步驟e,定容；步驟f,測(cè)吸光值。該工藝設(shè)置4個(gè)變量：乙醇濃度、處理時(shí)間、微波功率和料液比；利用design expert軟件根據(jù)Box?Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化出最佳提取工藝為乙醇濃度58.51％，處理時(shí)間3.21min，微波功率287.08W，料液比1:59.60g/mL，花色苷含量為33.5887mg/g藍(lán)靛果粉末。本發(fā)明以長(zhǎng)白山產(chǎn)藍(lán)靛果為原料，以0.1％(v/v)鹽酸乙醇為提取劑，經(jīng)超聲波?微波協(xié)同處理，可大大縮短提取時(shí)間，有效提高花色苷含量，為藍(lán)靛果花色苷提取提供一種新方法，具有較好的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的開(kāi)發(fā)前景。
【專利說(shuō)明】超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷工藝
[0001]技術(shù)領(lǐng)域:本發(fā)明涉及一種藍(lán)靛果花色苷提取方法，特別涉及一種超聲波-微波協(xié) 同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷工藝。
【背景技術(shù)】 [0002] :藍(lán)靛果(Loniceraedulis)別稱藍(lán)靛果忍冬、黑瞎子果(黑龍江）、狗奶子 (大興安嶺）、羊奶子（大興安嶺）、山茄子（勃利縣）等，在植物分類學(xué)上屬忍冬科 (Caprifoliaceae)忍冬屬(Lonicera L.)。藍(lán)靛果為多年生灌木，生于濕草地、林間或山溪 附近，是一種純天然、無(wú)污染的優(yōu)質(zhì)野生果，東亞特有的植物之一，為長(zhǎng)白山植物藥志所記 載，被世界糧農(nóng)組織定為世界稀有珍貴野生漿果。
[0003] 藍(lán)靛果果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，果實(shí)中含有大量的花色苷，具有清除自由基、抗異變、抗衰 老、抗炎癥、抗腫瘤、改善視力、預(yù)防和治療心血管疾病、提高免疫力等多種生理活性功能， 是一種值得研究和開(kāi)發(fā)的天然食用色素資源，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。
[0004] 近年來(lái)對(duì)藍(lán)靛果花色苷的提取進(jìn)行了大量研究，藍(lán)靛果花色苷的提取方法主要有 傳統(tǒng)有機(jī)溶劑萃取、超聲波輔助提取、微波輔助提取、超臨界C0 2萃取，然而這些方法均存在 一定的缺陷，傳統(tǒng)有機(jī)溶劑萃取操作簡(jiǎn)單，但得率低、溶劑消耗量大、生產(chǎn)周期長(zhǎng);超聲波輔 助提取和微波輔助提取得率高于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑萃取，但是生產(chǎn)周期長(zhǎng)，成本高；超臨界C0 2 萃取得率高，但生產(chǎn)成本過(guò)高?，F(xiàn)今，超聲波-微波聯(lián)用被廣泛用于生物活性物質(zhì)的提取，具 有明顯的效果，多數(shù)研究表明，其主要原因是聲空化作用產(chǎn)生的強(qiáng)烈聲沖流和超聲波的剪 切作用以及微波的熱效應(yīng)和輻射作用會(huì)加速細(xì)胞壁的破裂利于活性物質(zhì)的釋放，同時(shí)，超 聲波-微波具有簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、效率高、各項(xiàng)參數(shù)易調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 基于此，本發(fā)明提供了一種超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷的 方法，利用超聲波-微波協(xié)同作用的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)藍(lán)靛果花色苷的高效快速提取。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】
:基于上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，本發(fā)明提出一種超聲波-微波協(xié)同輔助 酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷的方法，以克服傳統(tǒng)提取方法提取時(shí)間長(zhǎng)、耗能多、得率低等缺 點(diǎn)。
[0007] 其工藝流程及其控制條件如下：
[0008] a.原料預(yù)處理:將置于-20°C冰柜冷凍保存的藍(lán)靛果取出放于冷凍干燥機(jī)中冷凍 干燥，干燥后的果實(shí)破碎成粉末過(guò)1_尼龍篩網(wǎng)后儲(chǔ)存在室溫下備用。
[0009] b.酸化乙醇混合:取一定量的藍(lán)靛果粉末，按照比例加入0.1 % (v/v)鹽酸乙醇。
[0010] c.超聲波-微波協(xié)同處理:將上述混合液移至反應(yīng)瓶置于超聲波-微波協(xié)同處理室 中，在一定處理時(shí)間(min)和微波功率(W)條件下進(jìn)行超聲波-微波協(xié)同處理。
[0011] d.分離:將經(jīng)超聲波-微波協(xié)同處理的混合液置于低速離心機(jī)中離心(4000r/min， 15min)，取上清液，即為花色苷提取液。
[0012] e .定容:準(zhǔn)確吸取1.25mL花色苷提取液，加入50mL容量瓶中，分別用pHl. 0的氯化 鉀-鹽酸緩沖溶液和PH4.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液定容備用。
[0013] f.測(cè)定吸光值：分別取適量上述溶液置于試管中，于40°C恒溫水浴中水浴40min 后，以蒸餾水為空白對(duì)照分別在510nm和700nm下測(cè)定吸光值，計(jì)算花色苷含量。
[0014] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：
[0015] 1.本發(fā)明首次采用超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷，在超聲波 和微波協(xié)同作用下，植物細(xì)胞破壁裂解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，促進(jìn)藍(lán)靛果細(xì)胞內(nèi)花色苷活性成 分的釋放，提高花色苷得率，縮短提取時(shí)間，減少耗能，真正達(dá)到高效提取。
[0016] 2.本發(fā)明的方法具有操作工藝簡(jiǎn)單、易行，生產(chǎn)成本低，提取效率高，產(chǎn)品質(zhì)量好 等顯著優(yōu)點(diǎn)。
[0017] 3.本發(fā)明得到的藍(lán)靛果花色苷，可作為一種天然食品添加劑應(yīng)用于食品和保健食 品等各領(lǐng)域。
【附圖說(shuō)明】：
[0018] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0019] 圖1是乙醇濃度變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響規(guī)律圖；
[0020] 圖2是處理時(shí)間變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響規(guī)律圖；
[0021 ]圖3是微波功率變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響規(guī)律圖；
[0022]圖4是料液比變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響規(guī)律圖；
【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1、超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) [0024] 1、樣品準(zhǔn)備與試驗(yàn)過(guò)程
[0025] (1)將置于-20 °C冰柜冷凍保存的藍(lán)靛果取出放于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，干燥后 的果實(shí)破碎成粉末過(guò)1_尼龍篩網(wǎng)后儲(chǔ)存在室溫下備用。
[0026] (2)取一定量的藍(lán)靛果粉末，按照比例加入0.1% (v/v)鹽酸乙醇后移至反應(yīng)瓶置 于超聲波-微波協(xié)同處理室中，在一定處理時(shí)間(min)和微波功率(W)條件下進(jìn)行超聲波-微 波協(xié)同處理。
[0027] (3)離心（4000以1^11，151^11)，準(zhǔn)確吸取1.251^上清液即花色苷提取液，加入501^ 容量瓶中，分別用PH1.0的氯化鉀-鹽酸緩沖溶液和pH4.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液定容。 [0028] (4)分別取適量定容后的溶液置于試管中，于40°C恒溫水浴中水浴40min后，以蒸 餾水為空白對(duì)照分別在510nm和700nm下測(cè)定吸光值，通過(guò)pH示差法計(jì)算花色苷含量。
[0029] (5)花色苷含量計(jì)算公式為:花色苷含量扣_)= x 1000 ε χ ox F0
[0030] 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析
[0031] (1)單因素試驗(yàn)
[0032]以乙醇濃度、處理時(shí)間、微波功率和料液比為主要影響因素，花色苷含量為評(píng)價(jià)指 標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每次試驗(yàn)平行測(cè)定三次，取其平均值。
[0033] (2)響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)
[0034]根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量響較顯著的乙醇濃度、處理時(shí)間、 微波功率和料液比這四個(gè)因素，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并利用design expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，建立二次多項(xiàng)回歸模型，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。設(shè)計(jì)因素水 平表見(jiàn)表1。
[0035] 表1響應(yīng)面試驗(yàn)變量與編碼表
[0037] 以乙醇濃度(Xi)、處理時(shí)間（X2)、微波功率(X3)和料液比（Χ4)為自變量，以藍(lán)靛果 花色苷含量為響應(yīng)值(Υ)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。
[0038] 表2響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果
[0039]
[0040]
[00411 (3)模型的建立和統(tǒng)計(jì)分析
[0042]利用design-expert軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，去除不顯著項(xiàng)后，得 到響應(yīng)變量（乙醇濃度、處理時(shí)間、微波功率和料液比）與響應(yīng)值(花色苷含量)之間的二次 多項(xiàng)回歸方程：
[0043] Y = -l〇5.46000+2.07542Χι+21.47083X2+0.052525X3+1.21758X 4-〇. 095000XiX2-2 · 30000E-004XiX3-1 · 27500E-003XiX4_6 · 25000E-004X2X3-0 · 10325X2X4+2 · 52500E-004X3X4-0.013913Xi2-1.49000X2 2-9.07500E-005X3-7.41250E-003X4
[0044] F檢驗(yàn)可判定各因子與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著性，P值越小，說(shuō)明變量越顯著。由 方差分析表(表3)可知，，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著（R 2 = 0.9927)，模型 顯著水平小于0.0001，所以該回歸方差模型極顯著;失擬項(xiàng)P = 〇.〇855>0.05,表明該模型相 對(duì)于絕對(duì)誤差不顯著，回歸方程不失擬，可以用于超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛 果花色苷工藝研究。
[0045] 表3二次回歸模型方差分析結(jié)果
[0046]
[0048] (4)試驗(yàn)結(jié)果分析與優(yōu)化
[0049] 模型分析可知，超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷最佳工藝參數(shù)： 乙醇濃度58.51 %，處理時(shí)間3.21min，微波功率287.08W，料液比1:59.60g/mL，在此條件下， 得到的花色苷含量為33.5887mg/g藍(lán)靛果粉末。
[0050] 試驗(yàn)1、超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷過(guò)程試驗(yàn)
[0051 ] (1)將置于-20 °C冰柜冷凍保存的藍(lán)靛果取出放于冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥，干燥后 的果實(shí)破碎成粉末過(guò)1_尼龍篩網(wǎng)后儲(chǔ)存在室溫下備用。
[0052] (2)取一定量的藍(lán)靛果粉末，按照比例加入0.1% (v/v)鹽酸乙醇后后移至反應(yīng)瓶 置于超聲波-微波協(xié)同處理室中，在一定處理時(shí)間(min)和微波功率(W)條件下進(jìn)行超聲波-微波協(xié)同處理。
[0053] (3)離心（4000以1^11，151^11)，準(zhǔn)確吸取1.251^上清液即花色苷提取液，加入501^ 容量瓶中，分別用PH1.0的氯化鉀-鹽酸緩沖溶液和pH4.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液定容。 [0054] (4)分別取適量定容后的溶液置于試管中，于40°C恒溫水浴中水浴40min后，以蒸 餾水為空白對(duì)照分別在510nm和700nm下測(cè)定吸光值，通過(guò)pH示差法計(jì)算花色苷含量為 33.51mg/g藍(lán)靛果粉末。
[0055]試驗(yàn)2、乙醇濃度變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響
[0056]在處理時(shí)間3min、微波功率200W、料液比1:80的條件下，將酸化乙醇濃度設(shè)定為 40-80 %共5個(gè)變化值;其余同試驗(yàn)1，結(jié)果如圖1。
[0057]當(dāng)酸化乙醇濃度小于60%時(shí)，藍(lán)靛果花色苷含量隨乙醇濃度的增大而提高，這可 能是由于隨著乙醇濃度的增大，溶劑的滲透能力也隨之增大，有利于花色苷類水溶性物質(zhì) 的溶出；當(dāng)酸化乙醇濃度大于60%時(shí)，藍(lán)靛果花色苷含量下降，這可能是由于乙醇濃度過(guò)大 時(shí)，極性過(guò)低反而不利于花色苷類物質(zhì)的溶出，導(dǎo)致花色苷含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，最佳 的酸化乙醇濃度為60 %。
[0058]試驗(yàn)3、處理時(shí)間變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響
[0059]在酸化乙醇濃度60%、微波功率200W、料液比1:80的條件下，將處理時(shí)間設(shè)定為1-5min共5個(gè)變化值;其余同試驗(yàn)1，結(jié)果如圖2。
[0060]當(dāng)處理時(shí)間小于3min時(shí)，藍(lán)靛果花色苷含量隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，這可能是 由于在超聲波-微波協(xié)同作用下，植物細(xì)胞破壁裂解，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，促進(jìn)藍(lán)靛果細(xì)胞內(nèi) 花色苷活性成分的釋放，增加提取量；當(dāng)處理時(shí)間大于3min時(shí)，藍(lán)靛果花色苷含量下降，這 可能是由于隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，體系溫度升高，熱敏性花色苷活性成分遭到破壞并發(fā)生 降解，使花色苷的提取量降低，導(dǎo)致花色苷含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，最佳的處理時(shí)間為 3min〇
[0061 ]試驗(yàn)4、微波功率變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響
[0062]在酸化乙醇濃度60%、處理時(shí)間3min、料液比1:80的條件下，將微波功率設(shè)定為 100-500W個(gè)共5個(gè)變化值;其余同試驗(yàn)1，結(jié)果如圖3。
[0063]當(dāng)微波功率小于300W時(shí)，藍(lán)靛果花色苷含量隨著微波功率增大而提高，這可能是 由于增大微波功率，微波的熱效應(yīng)和輻射作用會(huì)相應(yīng)的加強(qiáng)，從而加速細(xì)胞壁的破裂利于 活性物質(zhì)的釋放，促進(jìn)花色苷的溶出；當(dāng)微波功率大于300W時(shí)，藍(lán)靛果花色苷含量降低，這 可能是由于隨著功率的不斷增加，產(chǎn)生的熱效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，溫度也隨之升高，從而使熱敏性 花色苷活性成分遭到破壞并發(fā)生降解，使花色苷提取量降低，導(dǎo)致花色苷含量出現(xiàn)下降趨 勢(shì)。因此，最佳的微波功率為300W。
[0064]試驗(yàn)5、料液比變化對(duì)藍(lán)靛果花色苷含量的影響
[0065]在酸化乙醇濃度60%、處理時(shí)間3min、微波功率300W的條件下，將料液比設(shè)定為1: 40-1:80個(gè)共5個(gè)變化值;其余同試驗(yàn)1，結(jié)果如圖4。
[0066]當(dāng)料液比小于1:60時(shí)，藍(lán)靛果花色苷含量隨著料液比增大而提高，這可能是由于 提取溶劑體積的增大擴(kuò)大了組織細(xì)胞內(nèi)外的濃度差，促進(jìn)藍(lán)靛果花色苷向提取溶劑中擴(kuò) 散，有利于花色苷溶出；當(dāng)料液比大于1:60時(shí)，藍(lán)靛果花色苷含量降低，這可能是由于溶劑 過(guò)多影響了超聲波微波與藍(lán)靛果細(xì)胞間的作用，影響了花色苷的溶出，使花色苷提取量降 低，導(dǎo)致花色苷含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，最佳的料液比為1:60。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷工藝，其特征在于，以藍(lán)靛果 為原料，利用超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷并借助響應(yīng)面優(yōu)化提取工 藝，其工藝流程和操作步驟如下： 超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷工藝流程：原料預(yù)處理-酸化乙醇 混合4超聲波-微波協(xié)同處理4分離4定容4測(cè)吸光值； 超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷操作步驟與要點(diǎn)如下： (1) 原料預(yù)處理：將置于-20°c冰柜冷凍保存的藍(lán)靛果取出放于冷凍干燥機(jī)中冷凍干 燥，干燥后的果實(shí)破碎成粉末過(guò)Imm尼龍篩網(wǎng)后儲(chǔ)存在室溫下備用； (2) 酸化乙醇混合:取一定量的藍(lán)靛果粉末，按比例加入0.1 % (v/v)鹽酸乙醇； (3) 超聲波-微波協(xié)同處理:將上述混合液移至反應(yīng)瓶置于超聲波-微波協(xié)同處理室中， 在一定處理時(shí)間(min)和微波功率(W)條件下進(jìn)行超聲波-微波協(xié)同處理； (4) 分離：將經(jīng)超聲波-微波協(xié)同處理的混合液置于低速離心機(jī)中離心（4000r/min， 15min)，取上清液，即為花色苷提取液； (5) 定容：準(zhǔn)確吸取1.25mL花色苷提取液，加入50mL容量瓶中，分別用pHl. O的氯化鉀-鹽酸緩沖溶液和PH4.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液定容備用； (6) 測(cè)吸光值:分別取適量上述溶液置于試管中，于40°C恒溫水浴中水浴40min后，以蒸 餾水為空白對(duì)照分別在510nm和700nm下測(cè)定吸光值，計(jì)算花色苷含量。2. 如權(quán)利要求書1所述的超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷工藝，其特 征在于，所述酸化乙醇過(guò)程中，酸化乙醇濃度為40%-80%，藍(lán)靛果粉末與酸化乙醇料液比 為1:40-1:80g/mL。3. 如權(quán)利要求書1所述的超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷工藝，其特 征在于，所述超聲波-微波協(xié)同處理?xiàng)l:處理時(shí)間為l-5min，微波功率為100-500W。4. 如權(quán)利要求書1所述的超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷工藝，其特 征在于，所述pHl. 0的氯化鉀-鹽酸緩沖溶液和pH4.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液配制方法（1) P H1.0的氯化鉀-鹽酸緩沖溶液：按照2 5 : 6 7的比例將濃度為0.2 m 〇 I / L的氯化鉀溶液和 0.2mol/L的鹽酸溶液均勻混合，pH計(jì)校正；（2)pH4.5的醋酸鈉-醋酸緩沖溶液:按照1:1的比 例將濃度為〇. 2mol/L的醋酸溶液和0.2mol/L的醋酸鈉溶液均勻混合，pH計(jì)校正。5. 如權(quán)利要求書1所述的超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷工藝，其特 征在于，所述花色苷含量計(jì)算方法為pH示差法： 花色苷含量(mg/g)=AxMwxKx%i〇〇〇 ε χ b X F0 式中：A- (Asio -A700nm)pHl · 0- (Asio -A700nm)pH4 · 5 Mw-矢車菊素葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，449.2g/mol; b-光程的厘米數(shù)，lcm; ε-矢車菊素葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26,900L · CnT1 · mor1; η -樣品總的稀釋倍數(shù)； V-提取液的總體積，mL; Vo-樣品體積，mL。6. 如權(quán)利要求書1所述的超聲波-微波協(xié)同輔助酸化乙醇提取藍(lán)靛果花色苷工藝，其特
【文檔編號(hào)】C09B61/00GK105885469SQ201610423463
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年6月14日
【發(fā)明人】周亞軍, 于清華, 程森耀, 張長(zhǎng)成, 王淑杰, 陳治旭, 周瑞祎
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)