一種銅離子螯合型納米粒子生物涂層的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種銅離子螯合型納米粒子生物涂層的制備方法。首先利用PLL與銅離子之間的螯合作用制備出PLL/銅離子復(fù)合物，再利用PLL與硫酸軟骨素之間能發(fā)生靜電交互作用形成納米粒子的特性，將PLL/銅離子復(fù)合物與硫酸軟骨素進行混合，形成銅離子螯合型納米離子。然后在316L不銹鋼表面制備DM涂層，利用DM與伯氨基可發(fā)生西弗堿反應(yīng)的特性，將含有氨基的納米粒子固定至樣品表面，從而構(gòu)建具有抗凝、抗增生及刺激內(nèi)皮再生的多功能表面。本發(fā)明在316L不銹鋼表面構(gòu)建具有多種生物功能特性的納米粒子涂層，顯著改善了材料的抗凝及抗增生性能，同時能提高內(nèi)皮損傷修復(fù)能力。
【專利說明】
一種銅離子螯合型納米粒子生物涂層的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及納米粒子制備技術(shù)和無機材料表面改性技術(shù)，特別涉及不銹鋼基心血管植入材料表面的生物改性方法。
【背景技術(shù)】
[0002]316L不銹鋼具有良好的機械性能和優(yōu)異的耐腐蝕性能，在生物醫(yī)用材料領(lǐng)域如骨材料、牙種植體、心血管植入材料等有著廣泛的應(yīng)用。但對于一些特殊應(yīng)用的領(lǐng)域，如作為血管支架材料用于冠心病的治療，其安全性和生物相容性還遠(yuǎn)未達到臨床要求。其中，316L不銹鋼血液相容性差以及對于血管內(nèi)膜增生和炎癥反應(yīng)等無抑制作用是制約其應(yīng)用的主要方面。
[0003]通過對材料表面進行生物化改性，構(gòu)建合理的生物微環(huán)境，賦予材料良好的抗凝、抗增生及誘導(dǎo)內(nèi)皮再生能力是改善其生物相容性的有效方法。銅離子是一種人體所必須的關(guān)鍵金屬離子，雖然銅攝入過量會引起重金屬中毒，但微量的銅離子對調(diào)控細(xì)胞信號通路及生物學(xué)應(yīng)答方面具有重要作用。特別的，銅離子具有刺激血管細(xì)胞胞外基質(zhì)重建、增強血管再生以及誘導(dǎo)NO釋放等功能，對調(diào)控血管內(nèi)平衡、抑制內(nèi)膜再生、抑制血栓形成具有顯著作用。硫酸軟骨素(CS)是一種廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)中的糖胺聚糖，具有優(yōu)異的清除膽固醇和防治動脈粥樣硬化的功能。此外，也具有良好的刺激血管內(nèi)皮生長和一定的抗凝效果。
[0004]多聚賴氨酸(PLL)是一種富含氨基的氨基酸聚合物，在酸性及中性環(huán)境下呈強正電性，能與成負(fù)電性的CS通過靜電交互作用形成具有三維結(jié)構(gòu)的納米粒子。此外，多聚賴氨酸因其特殊的分子構(gòu)象，可通過側(cè)鏈氨基以及酰胺I帶與銅離子發(fā)生強烈的螯合作用。利用PLL與CS及銅離子之間的相互作用，可制備出銅離子螯合型PLL/CS納米粒子，并進一步利用納米粒子中PLL衍生的氨基可與多巴胺涂層發(fā)生西弗堿反應(yīng)的特性，在材料表面構(gòu)建納米粒子涂層。
[0005]這種納米粒子生物涂層能顯著提高材料表面的血液相容性，抑制平滑肌細(xì)胞的過度增生，同時促進血管內(nèi)皮細(xì)胞再生，刺激損傷修復(fù)。而目前尚無將銅離子螯合型PLL/CS納米粒子作為生物涂層用于316L不銹鋼材料表面生物化改性的相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種銅離子螯合型納米粒子生物涂層的制備方法，通過該方法對316L不銹鋼材料表面進行生物化改性可有效提高材料的血液相容性，抑制內(nèi)膜增生并刺激內(nèi)皮再生。
[0007]本發(fā)明實現(xiàn)以上目的采用的技術(shù)方案是，一種銅離子螯合型納米粒子生物涂層的制備方法，其步驟包含:
[0008]A、銅離子螯合型納米粒子的制備:將濃度為0.lmM-10.0mM的CuC12水溶液與濃度為2.0-5.0mg/ml分子量150-300KDa的多聚賴氨酸PLL溶液等體積混合，室溫下靜置1-3小時;然后將上述復(fù)合液與濃度為10-50mg/ml的硫酸軟骨素溶液等體積混合，即得銅離子螯合型納米粒子懸液；
[0009]B、聚多巴胺涂層的沉積:在316L醫(yī)用不銹鋼表面沉積聚多巴胺涂層，并于60°C下熱處理12小時；
[0010]C、納米粒子生物涂層的制備:將B步驟中沉積有聚多巴胺涂層的樣品浸泡于A步驟獲得的納米粒子懸液中，在15-40°C下振蕩反應(yīng)6-24小時，雙蒸水漂洗后得到目標(biāo)物。
[0011 ]參見說明書附圖1，本發(fā)明的反應(yīng)過程與機理分為兩個部分，第一部分為銅離子螯合型納米粒子的制備。在pH=5的NaCl體系中，利用銅離子與PLL分子中伯胺基及酰胺I帶之間特異性的螯合作用，首先制備PLL/銅離子復(fù)合物;其次利用CS與PLL可發(fā)生靜電交互作用形成納米粒子的特性，制備得到含銅離子的PLL/CS納米粒子。第二部分為材料表面納米粒子涂層的制備。首先利用多巴胺在弱堿性條件下能與金屬表面發(fā)生配位結(jié)合并自聚成膜的特性，在316L不銹鋼表面制備出具多巴胺涂層。得到的多巴胺涂層具有二次反應(yīng)性，能與納米粒子中PLL衍生的伯胺基發(fā)生西弗堿反應(yīng)，利用該特性可將含銅離子的PLL/CS固定在多巴胺涂層表面，從而實現(xiàn)納米粒子涂層的構(gòu)建。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0013]—、利用生物分子與金屬離子之間的特異性作用，創(chuàng)造性的制備出一種銅離子螯合型納米粒子，并用于316L不銹鋼表面生物化改性。通過該種方法，可在不影響化學(xué)價態(tài)的前提下將銅離子引入材料表面，從而正常發(fā)揮其生物功能。
[0014]二、通過靜電交互作用制備的納米粒子，其內(nèi)部生物分子活性得到較好的保持。同時，納米粒子特殊的三維結(jié)構(gòu)有利于控制金屬離子和生物分子的釋放，實現(xiàn)長期調(diào)控血管內(nèi)細(xì)胞生物行為。
[0015]三、納米粒子涂層的構(gòu)建工藝及固定方法均簡單易操作，無需昂貴復(fù)雜的設(shè)備，工藝成本較低，可控制性強，效果顯著。
[0016]四、316L不銹鋼表面多巴胺涂層的制備及納米粒子的固定均采用浸泡方式進行，可保證材料各個部分能均勻的固定上生物分子，有利于實現(xiàn)各種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的器械表面的生物功能化修飾，適用范圍廣。
【附圖說明】
[0017]圖1為銅離子螯合型納米粒子涂層的構(gòu)建過程示意圖。(A)納米粒子的制備；(B)多巴胺涂層的制備；(C)納米粒子在多巴胺涂層表面的固定。
[0018]圖2為納米粒子固定前后，樣品表面阿辛藍(lán)染色結(jié)果顯微對比照片。
[0019]圖3為不同樣品表面傅立葉紅外光譜結(jié)果。其中，A為多巴胺涂層;B為不含銅離子的納米涂層;C為含銅離子納米涂層。
[0020]圖4為納米粒子涂層的釋放行為圖，其中:(A)模擬體內(nèi)流場條件下，納米粒子涂層中硫酸軟骨素和銅離子的釋放行為；(B)15min內(nèi)，納米粒子涂層催化NO供體釋放NO的定量檢測結(jié)果。
[0021]圖5為樣品表面血小板粘附316L不銹鋼和納米粒子涂層2小時后的掃描電鏡對照圖片。
[0022]圖6為血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞在樣品表面培養(yǎng)3天后的熒光染色結(jié)果對照圖片，其中:A和B分別為血管內(nèi)皮細(xì)胞在316L不銹鋼和納米粒子涂層樣品表面培養(yǎng)3天后的熒光染色結(jié)果對照圖片，C和D分別為平滑肌細(xì)胞在316L不銹鋼和納米粒子涂層樣品表面培養(yǎng)3天后的熒光染色結(jié)果對照圖片。
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的方法作進一步詳細(xì)的說明。
[0024]實施例一
[0025]參見圖1，本發(fā)明的第一種【具體實施方式】是，一種銅離子螯合型納米粒子生物涂層的制備方法，其步驟為:
[0026]A、銅離子螯合型納米粒子的制備:將濃度為0.1mM的CuCl2水溶液與濃度為2.0mg/ml的多聚賴氨酸(PLL，分子量150-300KDa)溶液等體積混合，室溫下靜置I小時。然后將上述復(fù)合液與濃度為10mg/ml的硫酸軟骨素溶液等體積混合，即得銅離子螯合型納米粒子；
[0027]B、聚多巴胺涂層的沉積:在316L醫(yī)用不銹鋼表面沉積聚多巴胺涂層，并于60°C下熱處理12小時;一方面對樣品烘干，另一方面是加速多巴胺涂層中酚羥基向醌基的轉(zhuǎn)變，便于后續(xù)生物分子的固定
[0028]C、納米粒子生物涂層的制備:將B步驟中沉積有聚多巴胺涂層的樣品浸泡于A步驟獲得的納米粒子懸液中，在15°C下振蕩反應(yīng)24小時，雙蒸水漂洗后即得。
[0029]實施例二
[0030]—種銅離子螯合型納米粒子生物涂層的制備方法，其步驟為:
[0031]A、銅離子螯合型納米粒子的制備:將濃度為10.0mM的CuCl2水溶液與濃度為5.0mg/ml的多聚賴氨酸(PLL，分子量150_300KDa)溶液等體積混合，室溫下靜置3小時。然后將上述復(fù)合液與濃度為50mg/ml的硫酸軟骨素溶液等體積混合，即得銅離子螯合型納米粒子；
[0032]B、聚多巴胺涂層的沉積:在316L醫(yī)用不銹鋼表面沉積聚多巴胺涂層，并于60°C下熱處理12小時；
[0033]C、納米粒子生物涂層的制備:將B步驟中沉積有聚多巴胺涂層的樣品浸泡于A步驟獲得的納米粒子懸液中，在40°C下振蕩反應(yīng)6小時，雙蒸水漂洗后即得。
[0034]實施例三
[0035]—種銅離子螯合型納米粒子生物涂層的制備方法，其步驟為:
[0036]A、銅離子螯合型納米粒子的制備:將濃度為5mM的CuC12水溶液與濃度為3.0mg/ml的多聚賴氨酸(PLL，分子量150-300KDa)溶液等體積混合，室溫下靜置2小時。然后將上述復(fù)合液與濃度為25mg/ml的硫酸軟骨素溶液等體積混合，即得銅離子螯合型納米粒子；
[0037]B、聚多巴胺涂層的沉積:在316L醫(yī)用不銹鋼表面沉積聚多巴胺涂層，并于60°C下熱處理12小時；
[0038]C、納米粒子生物涂層的制備:將B步驟中沉積有聚多巴胺涂層的樣品浸泡于A步驟獲得的納米粒子懸液中，在30°C下振蕩反應(yīng)12小時，雙蒸水漂洗后即得。
【主權(quán)項】
1.一種銅離子螯合型納米粒子生物涂層的制備方法，其步驟包含: A、銅離子螯合型納米粒子的制備:將濃度為0.1mM-10.0mM的CuCl2水溶液與濃度為2.0-5.0mg/ml分子量150-300KDa的多聚賴氨酸PLL溶液等體積混合，室溫下靜置1_3小時;然后將上述復(fù)合液與濃度為10-50mg/ml的硫酸軟骨素溶液等體積混合，即得銅離子螯合型納米粒子懸液； B、聚多巴胺涂層的沉積:在316L醫(yī)用不銹鋼表面沉積聚多巴胺涂層，并于60°C下熱處理12小時； C、納米粒子生物涂層的制備:將B步驟中沉積有聚多巴胺涂層的樣品浸泡于A步驟獲得的納米粒子懸液中，在15-40°C下振蕩反應(yīng)6-24小時，雙蒸水漂洗后得到目標(biāo)物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種銅離子螯合型納米粒子生物涂層的制備方法，其特征在于:所述A步驟中多聚賴氨酸與硫酸軟骨素溶液以雙蒸水作為溶劑，用H CI調(diào)節(jié)其P H值為5.0ο3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種銅離子螯合型納米粒子生物涂層的制備方法，其特征在于:所述所述C步驟中樣品的保存方法為表面濕潤條件下，4°C冷藏保存。
【文檔編號】C09D7/12GK105925173SQ201610236725
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月15日
【發(fā)明人】劉濤, 曾崢, 劉詩卉, 潘長江, 陳俊英, 丁紅燕
【申請人】淮陰工學(xué)院