一種活細(xì)胞超分辨光學(xué)成像探針及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種活細(xì)胞超分辨光學(xué)成像探針及其制備方法，所述以量子點(diǎn)作為熒光團(tuán)，在量子點(diǎn)表面同時(shí)偶聯(lián)細(xì)胞膜穿透肽和核酸適配體，所述細(xì)胞膜穿透肽用以使探針穿透活細(xì)胞膜，所述核酸適配體用以與活細(xì)胞核膜受體蛋白特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)探針的細(xì)胞核定位。本發(fā)明利用具有閃爍效應(yīng)的量子點(diǎn)作為熒光團(tuán)，其高的發(fā)光強(qiáng)度和熒光閃爍特性，使其適用于基于單分子定位法的超分辨光學(xué)成像；同時(shí)，本發(fā)明使用具有閃爍效應(yīng)的量子點(diǎn)作為熒光團(tuán)，不需要特殊的成像緩沖液，因此適用于活細(xì)胞超分辨成像；另外，本發(fā)明操作簡(jiǎn)單方便，造價(jià)低廉，有效地節(jié)約了時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本。
【專利說明】
一種活細(xì)胞超分辨光學(xué)成像探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種活細(xì)胞超分辨光學(xué)成像探針及其制備方法，屬于納米材料技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]光學(xué)顯微鏡的分辨率受到衍射極限的限制，通常只能達(dá)到200-300nm。近年來，科學(xué)家們針對(duì)光學(xué)顯微鏡的分辨率極限，開發(fā)出了幾類能突破衍射極限的超分辨光學(xué)顯微鏡，例如受激發(fā)射損耗顯微鏡(STED)、結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(SIM)、隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡(STORM)以及光活化定位顯微鏡(PALM)等。其中，以ST0RM/PALM技術(shù)能達(dá)到的分辨率最為突出，它們的成像原理相似，都基于單分子定位技術(shù)。2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)即是授予了三位在超分辨熒光顯微成像領(lǐng)域取得開創(chuàng)性成果的科學(xué)家。
[0003]PALM/ST0RM技術(shù)中，熒光標(biāo)記探針至關(guān)重要，它能直接決定成像效果(如分辨率、成像速度等)1ALM/ST0RM技術(shù)要求標(biāo)記探針具有以下特點(diǎn):量子產(chǎn)率高、亮態(tài)占空比小、可開關(guān)次數(shù)多、光穩(wěn)定性好、標(biāo)記密度高以及生物毒性低等。目前已有不少可用于PALM/ST0RM成像的有機(jī)染料分子(如Alexa fluo 647、Cy3、Cy5)以及熒光蛋白等。但就上述PALM/ST0RM技術(shù)所需探針的特點(diǎn)來說，這些已有的光學(xué)標(biāo)記探針或多或少存在著一些不足，例如量子產(chǎn)率不夠高、光穩(wěn)定性不好、靶向特異性差等。因此，開發(fā)滿足PALM/ST0RM技術(shù)應(yīng)用需求的，可用于活細(xì)胞光學(xué)超分辨成像的探針依舊是目前超分辨成像領(lǐng)域亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種活細(xì)胞超分辨光學(xué)成像探針及其制備方法，是一種適用于活細(xì)胞的核膜受體超分辨光學(xué)成像的探針及其制備方法。
[0005]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]—種活細(xì)胞超分辨光學(xué)成像探針，以量子點(diǎn)作為焚光團(tuán)，在量子點(diǎn)表面同時(shí)偶聯(lián)細(xì)胞膜穿透肽和核酸適配體，所述細(xì)胞膜穿透肽用以使探針穿透活細(xì)胞膜，所述核酸適配體用以與活細(xì)胞核膜受體蛋白特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)探針的細(xì)胞核定位。該探針能穿透活細(xì)胞膜進(jìn)入活細(xì)胞，并最終定位至活細(xì)胞核膜受體上，以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞核膜受體的超分辨率光學(xué)成像。
[0007]優(yōu)選的，所述細(xì)胞膜穿透肽和核酸適配體均通過羧基配體連接在量子點(diǎn)上，羧基配體為小分子配體;羧基配體的一端為巰基，羧基配體通過巰基共價(jià)連接至量子點(diǎn)表面;羧基配體的另一端為羧基，羧基配體通過羧基偶聯(lián)細(xì)胞膜穿透肽和核酸適配體。
[0008]優(yōu)選的，所述核酸適配體5‘端修飾氨基，細(xì)胞膜穿透肽和核酸適配體均通過氨基羧基偶聯(lián)反應(yīng)連接至量子點(diǎn)表面。
[0009]—種活細(xì)胞超分辨光學(xué)成像探針的制備方法，包括如下步驟:
[0010](I)為具有熒光閃爍(blink)效應(yīng)的量子點(diǎn)修飾羧基配體;羧基配體的一端為巰基，羧基配體的另一端為羧基，羧基配體通過巰基共價(jià)連接至量子點(diǎn)表面；
[0011](2)在修飾了羧基配體的量子點(diǎn)表面同時(shí)偶聯(lián)細(xì)胞膜穿透肽和核酸適配體;核酸適配體5‘端修飾氨基，細(xì)胞膜穿透肽和核酸適配體均通過氨基羧基偶聯(lián)反應(yīng)連接至量子點(diǎn)表面；
[0012](3)超濾提純獲得基于量子點(diǎn)的活細(xì)胞超分辨光學(xué)成像探針。
[0013]所述量子點(diǎn)具有熒光閃爍(blink)效應(yīng)，能夠適用于基于單分子定位法的超分辨率光學(xué)成像應(yīng)用
[0014]有益效果:本發(fā)明提供的活細(xì)胞超分辨光學(xué)成像探針及其制備方法，相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下優(yōu)點(diǎn):1、本發(fā)明利用具有閃爍效應(yīng)的量子點(diǎn)作為熒光團(tuán)，其高的發(fā)光強(qiáng)度和熒光閃爍特性，使其適用于基于單分子定位法的超分辨光學(xué)成像;2、本發(fā)明使用具有閃爍效應(yīng)的量子點(diǎn)作為熒光團(tuán)，不需要特殊的成像緩沖液，因此適用于活細(xì)胞超分辨成像;3、本發(fā)明操作簡(jiǎn)單方便，造價(jià)低廉，有效地節(jié)約了時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本。
【附圖說明】
[0015]圖1為本發(fā)明探針的制備過程；
[0016]圖2為本發(fā)明探針穿透活細(xì)胞膜并定位至活細(xì)胞核膜受體蛋白的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明。
[0018]本實(shí)施例中涉及的量子點(diǎn)為CdSe/ZnS油相量子點(diǎn)，其熒光發(fā)射波長(zhǎng)為640nm;涉及的羧基小分子配體為巰基乙酸;涉及的細(xì)胞膜穿透肽為YGRKKRRQRRR，涉及的核酸適配體序
[0019]在制備探針時(shí)，首先取500yL CdSe/ZnS量子點(diǎn)，加入ImL甲醇并以3000rpm離心lOmin，棄除上清后將沉淀分散至2mL氯仿中。加入10yL四甲基氫氧化銨和10yL巰基乙酸后，劇烈攪拌2h。加入2mL去離子水，靜止分層后收集上層的修飾了羧基配體的量子點(diǎn)。
[0020]然后在離心管中加入4mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和6mg的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)粉末后，加入200yL的修飾了羧基配體的量子點(diǎn)溶液，再加入400yL的去離子水，室溫振蕩反應(yīng)30min。之后加入10yL 10mg/mL的細(xì)胞膜穿透肽和10yLΙΟμΜ的核酸適配體，室溫過夜振蕩反應(yīng)。最后將混合溶液移至超濾管中以8000rpm，12min超濾提純四次，將沉淀分散至200yL PBSdOmM pH 7.4)緩沖液中即得到了基于量子點(diǎn)的活細(xì)胞超分辨光學(xué)成像探針。
[0021]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種活細(xì)胞超分辨光學(xué)成像探針，其特征在于:以量子點(diǎn)作為熒光團(tuán)，在量子點(diǎn)表面同時(shí)偶聯(lián)細(xì)胞膜穿透肽和核酸適配體，所述細(xì)胞膜穿透肽用以使探針穿透活細(xì)胞膜，所述核酸適配體用以與活細(xì)胞核膜受體蛋白特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)探針的細(xì)胞核定位。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活細(xì)胞超分辨光學(xué)成像探針，其特征在于:所述細(xì)胞膜穿透肽和核酸適配體均通過羧基配體連接在量子點(diǎn)上，羧基配體為小分子配體;羧基配體的一端為巰基，羧基配體通過巰基共價(jià)連接至量子點(diǎn)表面;羧基配體的另一端為羧基，羧基配體通過羧基偶聯(lián)細(xì)胞膜穿透肽和核酸適配體。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的活細(xì)胞超分辨光學(xué)成像探針，其特征在于:所述核酸適配體5‘端修飾氨基，細(xì)胞膜穿透肽和核酸適配體均通過氨基羧基偶聯(lián)反應(yīng)連接至量子點(diǎn)表面。4.一種活細(xì)胞超分辨光學(xué)成像探針的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)為具有熒光閃爍效應(yīng)的量子點(diǎn)修飾羧基配體;羧基配體的一端為巰基，羧基配體的另一端為羧基，羧基配體通過巰基共價(jià)連接至量子點(diǎn)表面； (2)在修飾了羧基配體的量子點(diǎn)表面同時(shí)偶聯(lián)細(xì)胞膜穿透肽和核酸適配體;核酸適配體5 ‘端修飾氨基，細(xì)胞膜穿透肽和核酸適配體均通過氨基羧基偶聯(lián)反應(yīng)連接至量子點(diǎn)表面； (3)超濾提純獲得基于量子點(diǎn)的活細(xì)胞超分辨光學(xué)成像探針。
【文檔編號(hào)】C09K11/88GK105950133SQ201610304618
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月10日
【發(fā)明人】宗慎飛, 蔣曉月, 王著元, 崔平, 崔一平
【申請(qǐng)人】東南大學(xué)