檢測(cè)二價(jià)鐵離子的方法及其試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及檢測(cè)二價(jià)鐵離子的方法及其試劑盒。具體地，本發(fā)明的探針為一種包含N-O功能團(tuán)的苯并噻唑乙烯二甲基苯胺類(lèi)化合物，其可作為二價(jià)鐵離子熒光探針用于二價(jià)鐵離子的檢測(cè)。包含這類(lèi)探針的試劑盒可實(shí)現(xiàn)如下的技術(shù)效果中的至少一個(gè)：高選擇性地識(shí)別二價(jià)鐵離子；可以快速對(duì)二價(jià)鐵離子實(shí)現(xiàn)響應(yīng)；可以實(shí)現(xiàn)對(duì)二價(jià)鐵離子的超靈敏分析；性質(zhì)穩(wěn)定，可以長(zhǎng)期保存使用；有利于在生理水平條件下對(duì)二價(jià)鐵離子進(jìn)行檢測(cè)；以及具有較強(qiáng)的抗干擾能力。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
檢測(cè)二價(jià)鐵離子的方法及其試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種包含N-0功能團(tuán)的苯并噻唑乙烯類(lèi)化合物作為二價(jià)鐵離子熒光探 針，其可在生理水平條件下對(duì)二價(jià)鐵離子高選擇性超靈敏識(shí)別中應(yīng)用，或者其可測(cè)定樣品 中二價(jià)鐵離子的濃度。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為人體中的必須元素和最豐富的過(guò)度元素，鐵離子在生命系統(tǒng)中扮演著非常重 要的角色。鐵離子的氧化還原反應(yīng)在氧氣輸送，抗血素合成，酶反應(yīng)，新陳代謝和電子轉(zhuǎn)移 等生命體內(nèi)的一些生理活動(dòng)起著關(guān)鍵作用。一旦生命體內(nèi)的鐵離子含量不能維持在正常的 生理水平范圍內(nèi)，生命體便會(huì)發(fā)生許多病變，包括癌癥，肝炎，腎功能衰竭，心血管疾病，老 年癡呆和帕金森綜合癥等。鐵是人體不可缺少的微量元素，它是構(gòu)成血紅蛋白、肌紅蛋白及 多種酶的重要成分，如果體內(nèi)缺少鐵，可影響血紅蛋白、肌紅白蛋的合成，可使某些酶，如細(xì) 胞色素 c、核糖核苷酸還原酶、琥珀酸脫氫酶等的活性降低。這些酶與生物氧化、組織呼吸、 神經(jīng)遞質(zhì)的分解與合成有著密切關(guān)系，因此，鐵的缺乏可引起很多生理上的變化，從而導(dǎo)致 免疫力低下，智力降低和機(jī)體抗感染能力降低，影響機(jī)體體溫調(diào)節(jié)能力，神經(jīng)機(jī)能紊亂，工 作效率降低等各種疾病，最常見(jiàn)的是缺鐵性貧血。
[0003] 鑒于此，發(fā)展能夠有效檢測(cè)特別是能夠在生理水平條件下檢測(cè)二價(jià)鐵離子的分析 方法是極其重要和有意義的?，F(xiàn)如今已報(bào)導(dǎo)的檢測(cè)二價(jià)鐵離子的分析方法包括光譜分析 法，無(wú)汞法、分光光度法、硝化絡(luò)合分光光度法、熒光探針檢測(cè)等方法。在這些眾多的檢測(cè)方 法中，熒光探針由于其特有的優(yōu)點(diǎn)而成為研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。然而，目前報(bào)道的熒光探針 仍存在一些問(wèn)題，包括選擇性不夠好、響應(yīng)速度不夠快、合成復(fù)雜以及水溶性不夠好等。由 于生命體內(nèi)的其他金屬離子如鈉離子，鉀離子，鈣離子，鎂離子，鋁離子，三價(jià)鐵離子和銅離 子等其他金屬離子，它會(huì)對(duì)二價(jià)鐵離子的檢測(cè)構(gòu)成潛在干擾，因此，發(fā)展高選擇性探針成為 急需解決的課題。生物體內(nèi)的鐵離子含量只占0.004%，這給生命體內(nèi)二價(jià)鐵離子的檢測(cè)帶 來(lái)很大困難，因此發(fā)展能夠高靈敏性檢測(cè)生命體內(nèi)二價(jià)鐵離子的分析方法是必要的。總之， 發(fā)展高選擇性、高靈敏度、合成簡(jiǎn)單的、水溶性好的二價(jià)鐵離子熒光探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員 急需解決的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本領(lǐng)域急需一種制備簡(jiǎn)單、水溶性好的高選擇性超靈敏二價(jià)鐵離子熒光探針，從 而能夠有效檢測(cè)特別是能夠在生理水平條件下檢測(cè)二價(jià)鐵離子。為此，本發(fā)明合成了一類(lèi) 新穎的二價(jià)鐵離子的熒光探針，其合成簡(jiǎn)單、水溶性好、選擇性高、靈敏度高、能夠快速識(shí)別 二價(jià)鐵離子。本發(fā)明的探針可在生理水平條件下進(jìn)行二價(jià)鐵離子的測(cè)定。
[0005] 具體而言，本發(fā)明提供了一種二價(jià)鐵離子熒光探針，其為包含N-0功能團(tuán)的苯并噻 唑乙烯類(lèi)化合物，其結(jié)構(gòu)如下：
[0007]優(yōu)選的，本發(fā)明的熒光探針是：
[0009] 本發(fā)明還提供了二價(jià)鐵離子熒光探針的制備方法，其是通過(guò)將對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的探 針的相應(yīng)的苯并噻唑乙烯苯胺類(lèi)化合物與間氯過(guò)氧苯甲酸通過(guò)在室溫?cái)嚢?小時(shí)而合成制 得。優(yōu)選的，本發(fā)明的對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的探針的相應(yīng)的苯胺類(lèi)化合物是苯并噻唑乙烯二甲基 苯胺化合物。
[0010] 本發(fā)明還提供了用于檢測(cè)樣本(例如血液樣本）中二價(jià)鐵離子濃度的檢測(cè)制劑或 試劑盒，其包含本發(fā)明的探針。優(yōu)選地，本發(fā)明的檢測(cè)制劑或試劑盒還包含產(chǎn)品的使用說(shuō)明 書(shū)。還優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒還包含用于測(cè)定樣本中的二價(jià)鐵離子濃度的緩沖劑。
[0011] 本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣本(例如血液樣本）中二價(jià)鐵離子濃度的方法，其包括將本 發(fā)明的探針與待測(cè)樣本接觸的步驟。
[0012] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明的探針在制備用于檢測(cè)樣本(例如血液樣本）中二價(jià)鐵離 子濃度的制劑中的用途。
[0013] 本發(fā)明還提供了本發(fā)明的探針在制備用于檢測(cè)樣本(例如血液樣本）中二價(jià)鐵離 子濃度的試劑盒中的用途。
[0014] 本發(fā)明的二價(jià)鐵離子熒光探針可與二價(jià)鐵離子進(jìn)行作用，產(chǎn)生熒光光譜的變化， 從而實(shí)現(xiàn)對(duì)二價(jià)鐵離子的定量檢測(cè)
[0015] 具體而言，本發(fā)明的二價(jià)鐵離子熒光探針?lè)謩e與三價(jià)鐵離子、鉀離子、鈣離子、鎂 離子、鈉離子、鋁離子以及人體內(nèi)的其他離子進(jìn)行作用均不能導(dǎo)致熒光光譜的明顯改變，從 而實(shí)現(xiàn)對(duì)二價(jià)鐵離子的選擇性識(shí)別，進(jìn)而可任選地用于排除這些三價(jià)鐵離子、鉀離子、鈣離 子、鎂離子、鈉離子、鋁離子、鉛離子以及人體內(nèi)其他離子的存在對(duì)二價(jià)鐵離子的定量測(cè)定 的干擾。
[0016] 本發(fā)明的二價(jià)鐵離子熒光探針的水溶性較好，從而可有利于生理水平條件下對(duì)二 價(jià)鐵離子的檢測(cè)。
[0017] 可選擇地，本發(fā)明的二價(jià)鐵離子熒光探針的穩(wěn)定性好，進(jìn)而能夠長(zhǎng)期保存使用。
[0018] 進(jìn)一步的，本發(fā)明的二價(jià)鐵離子熒光探針是快速高選擇性二價(jià)鐵離子熒色探針， 且合成簡(jiǎn)單，有利于商業(yè)化的推廣應(yīng)用。
【附圖說(shuō)明】
[0019]圖1是探針(5μΜ)加入Fe2+(5yM)在不同體系下的熒光光譜。
[0020]圖2是探針(5μΜ)加入Fe2+(5yM)響應(yīng)時(shí)間的測(cè)試結(jié)果。
[0021]圖3是不同濃度Fe2+ (0 - 8μΜ)對(duì)探針(5μΜ)焚光光譜的影響。
[0022]圖4是不同濃度Fe2+ (0 - 2μΜ)對(duì)探針(5μΜ)熒光光譜滿足良好的線性關(guān)系。
[0023]圖5是不同金屬離子分析物(20μΜ)以及過(guò)氧化氫(200μΜ)、谷胱甘肽(200μΜ)、谷胱 甘肽（ImM)對(duì)探針(5μΜ)熒光光譜的影響。
【具體實(shí)施方式】：
[0024]本發(fā)明提供了上述快速高選擇性二價(jià)鐵離子熒光探針的合成路線、方法及其光譜 性能。
[0025]本發(fā)明的二價(jià)鐵離子熒光探針是一類(lèi)包含Ν-0功能團(tuán)的苯并噻唑乙烯類(lèi)化合物， 其具有以下結(jié)構(gòu)通式
[0027] 上式中：R!，R2，R3，R4，Rs，R6，R7，Rs為氫原子，直鏈或支鏈烷基，直鏈或支鏈烷氧基， 磺酸基，酯基，羧基;1?1，1?2，1?3，1?4，1^，1?6，辦和1?8可以相同或不同。
[0028]該類(lèi)二價(jià)鐵離子熒光熒光探針的合成路線和方法如下：
[0030] 具體地，本發(fā)明的熒光探針可以通過(guò)如下方法制備，將一定摩爾比（例1:1-1:1.5) 的苯并噻唑乙烯苯胺類(lèi)化合物(例如苯并噻唑乙烯二甲基苯胺化合物)和碳酸氫鈉溶于二 氯甲烷中，冷卻到零攝氏度后加入間氯過(guò)氧苯甲酸，三者的摩爾比為（1:1.1:1.1)然后在室 溫(例如25°C)下攪拌一段時(shí)間（例如3h)，然后利用高壓栗進(jìn)行抽濾，得到濾餅，濾餅成為我 們的粗產(chǎn)品。如果要得到較純的產(chǎn)品，可以將濾餅用二氯甲烷和石油醚的混合體系(例如v/ v，l:5)進(jìn)行重結(jié)晶得到純品。
[0031] 因此，本發(fā)明還提供了間氯過(guò)氧苯甲酸在制備用于檢測(cè)二價(jià)鐵離子的熒光探針中 的用途。
[0032]本發(fā)明還提供了包含N-0功能團(tuán)的苯并噻唑乙烯類(lèi)化合物在制備用于檢測(cè)二價(jià)鐵 離子的熒光探針中的用途。
[0033]本發(fā)明的尚選擇性超尚靈敏識(shí)別^價(jià)鐵尚子焚光探針的顯者特征是能夠尚選擇 性超靈敏識(shí)別二價(jià)鐵離子以及在其他高濃度自然氨基酸和人體內(nèi)的其他離子的存在下能 夠準(zhǔn)確對(duì)二價(jià)鐵離子進(jìn)行定量分析。
[0034] 下面將通過(guò)借助以下實(shí)施例來(lái)更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是說(shuō)明性的， 應(yīng)該明白，本發(fā)明并不受下述實(shí)施例的限制。
[0035] 實(shí)施例1
[0037](方案1)將331mg( lmmol)苯并噻唑乙稀二甲基苯胺化合物和84mg( lmmol)碳酸氫 鈉溶于15mL二氯中，冷卻到零攝氏度，再加入173mg(lmmol)間氯過(guò)氧苯甲酸在室溫下攪拌 3h，然后利用高壓栗進(jìn)行抽濾，得到濾餅，濾餅成為我們的粗產(chǎn)品。如果要得到較純的產(chǎn)品， 可以將濾餅用二氯甲烷和石油醚的混合體系（例如v/V，1:5)進(jìn)行重結(jié)晶得到純品。得到紅 色純凈產(chǎn)品284.5mg，產(chǎn)率為82 %。
[0038](方案2)將331mg(lmmol)苯并噻唑乙稀二甲基苯胺化合物和92.4mg(l. lmmol)碳 酸氫鈉溶于15mL二氯中，冷卻到零攝氏度，再加入190.3mg(l. lmmol)間氯過(guò)氧苯甲酸在室 溫下攪3h，然后利用高壓栗進(jìn)行抽濾，得到濾餅，濾餅成為我們的粗產(chǎn)品。如果要得到較純 的產(chǎn)品，可以將濾餅用二氯甲烷和石油醚的混合體系(例如v/v，1:5)進(jìn)行重結(jié)晶得到純品。 得到紅色純凈產(chǎn)品312.3mg，產(chǎn)率為90%。
[0039](方案3)將331mg(lmmol)苯并噻唑乙稀二甲基苯胺化合物和126mg( 1.5mmol)碳酸 氫鈉溶于15mL二氯中，冷卻到零攝氏度，再加入259.5mg( 1.5mmol)間氯過(guò)氧苯甲酸在室溫 下攪拌3h，然后利用高壓栗進(jìn)行抽濾，得到濾餅，濾餅成為我們的粗產(chǎn)品。如果要得到較純 的產(chǎn)品，可以將濾餅用二氯甲烷和石油醚的混合體系(例如v/v，1:5)進(jìn)行重結(jié)晶得到純品。 得到紅色純凈產(chǎn)品294.6mg，產(chǎn)率為85%。
[0040](方案4)將331mg(lmmol)苯并噻唑乙稀二甲基苯胺化合物和168mg(2mmol)碳酸氫 鈉溶于15mL二氯中，冷卻到零攝氏度，再加入346mg(2mmol)間氯過(guò)氧苯甲酸在室溫下攪拌 3h，然后利用高壓栗進(jìn)行抽濾，得到濾餅，濾餅成為我們的粗產(chǎn)品。如果要得到較純的產(chǎn)品， 可以將濾餅用二氯甲烷和石油醚的混合體系（例如v/V，1:5)進(jìn)行重結(jié)晶得到純品。得到紅 色純凈產(chǎn)品305.3mg，產(chǎn)率為88 %。
[0041 ](方案5)將331mg( lmmol)苯并噻唑乙稀二甲基苯胺化合物和92.4mg( 1. lmmol)碳 酸氫鈉溶于15mL二氯中，冷卻到零攝氏度，再加入190.3mg(l. lmmol)間氯過(guò)氧苯甲酸在室 溫下攪拌8h，然后利用高壓栗進(jìn)行抽濾，得到濾餅，濾餅成為我們的粗產(chǎn)品。如果要得到較 純的產(chǎn)品，可以將濾餅用二氯甲烷和石油醚的混合體系（例如v/v，1:5)進(jìn)行重結(jié)晶得到純 品。得到紅色純凈產(chǎn)品322.7mg，產(chǎn)率為93%。
[0042] 4 匪R(400MHz，DMS0)S(*10-6) :3.039(s，6H)，7.55-7.58(m，7H)，7.89-7.91(m， 4H).
[0043] 實(shí)施例2
[0044] (圖1)是探針(5μΜ)加入Fe2+(5yM)在不同體系下的熒光光譜。體系包含無(wú)水乙醇和 超純水按不同比例配成。
[0045] 通過(guò)圖1，我們發(fā)現(xiàn)無(wú)水乙醇:水(3:7)體系是最適合測(cè)定的體系。
[0046] 實(shí)施例3
[0047](圖2)是探針(5μΜ)加入Fe2+(5yM)響應(yīng)時(shí)間的測(cè)試結(jié)果。首先，移取50yL的探針儲(chǔ) 備液（lmM)放進(jìn)10mL比色管中，向其加入3mL無(wú)水乙醇，然后再加入O.lmL的HEPES溶液(pH 7.4，500mM)，用超純水定容至10mL，最后再加入5yL的二價(jià)鐵離子儲(chǔ)備液(10mM)，快速搖勻， 計(jì)時(shí)測(cè)定，其中所使用的探針是實(shí)施例1中所制備的探針。測(cè)試結(jié)果顯示響應(yīng)時(shí)間為15min。 結(jié)果如圖2所不。
[0048] 實(shí)施例4
[0049](圖3)不同濃度Fe2+(0 - 8μΜ)對(duì)探針（5μΜ)熒光光譜的影響；（圖4)不同濃度Fe2+ (0 - 2μΜ)對(duì)探針（5μΜ)熒光光譜滿足良好的線性關(guān)系。上述測(cè)定是在無(wú)水乙醇：水(3:7)體 系(5mMHEPES，pH 7.4)下進(jìn)行的，所使用的探針是實(shí)施例1中所制備的探針，且所有光譜測(cè) 試都是在25°C下二價(jià)鐵離子加入作用15min后測(cè)得的。
[0050]可以看出，伴隨著探針溶液中Fe2+濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且在0_2μΜ的 Fe2+濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)e2+的濃度和熒光強(qiáng)度成線性關(guān)系。目前，大多數(shù)已報(bào)道的生命體血液中 二價(jià)鐵離子的含量小于10uM正好落入本發(fā)明的探針的檢測(cè)范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明的探針能 較精確地確定待測(cè)血液樣本中二價(jià)鐵離子的含量。
[0051 ] 實(shí)施案例五
[0052]圖5不同金屬離子分析物（20μΜ)以及Η202(200μΜ)、谷胱甘肽（200μΜ)、谷胱甘肽 (lmM)對(duì)探針(5μΜ)進(jìn)行選擇干擾。
[0053]分析物包括:半胱氨酸CYS、谷胱甘肽GSH、鉀離子K+、鈣離子Ca2+、鈉離子Na+、鎂離 子Mg2+、鋁離子A13+、鋅離子Zn2+、三價(jià)鐵離子Fe3+、鉛離子Pb 2+、鎳離子Ni2+、銅離子Cu2+、銀離 子Ag+，鈷離子Co 2+、鎘離子Cd2+。所有測(cè)試條件是在無(wú)水乙醇比水(3:7) (5mM HEPES，pH 7.4) 中完成，所使用的探針是實(shí)施例1中所制備的探針，且所有光譜都是在25°C下分析物加入作 用15min后測(cè)得的。具體地，移取50yL的探針儲(chǔ)備液（lmM)放進(jìn)10mL比色管中，然后加入3mL 無(wú)水乙醇，再移取相應(yīng)體積的上述分析物儲(chǔ)備液(50mM)加入熒光管內(nèi)，然后移取0. lmL的 HEPES溶液(pH 7.4,500mM)，最后用超純水定容至10mL。搖勻，靜置15min，即可測(cè)定。結(jié)果如 圖5所示。
[0054]從圖5可以看出，生物體內(nèi)存在的常見(jiàn)金屬離子與過(guò)氧化氫不會(huì)明顯干擾探針對(duì) 二價(jià)鐵離子的定性與定量檢測(cè)。
[0055]雖然用上述實(shí)施方式描述了本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解的是，在不背離本發(fā)明的精神的前 提下，本發(fā)明可進(jìn)行進(jìn)一步的修飾和變動(dòng)，且這些修飾和變動(dòng)均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測(cè)樣本中二價(jià)鐵離子含量的試劑盒，其包含具有W下結(jié)構(gòu)的化合物：其中：Ri，R2，R3，R4，Rs，Rs，化，Rs為獨(dú)立地選自由氨原子、直鏈或支鏈烷基、直鏈或支鏈燒 氧基、橫酸基、醋基和徑基組成的組;且其中的Ri，化，化，R4，化，Rs，R?和Rs可W相同或不同。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述的化合物是：3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述的樣本是血液樣本。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包括使用說(shuō)明書(shū)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的試劑盒，其還包括用于檢測(cè)樣本中二價(jià)鐵離子含 量的緩沖劑。6. 權(quán)利要求1或2中所定義的化合物在制備用于檢測(cè)樣本中二價(jià)鐵離子含量的試劑盒 中的用途。7. 根據(jù)權(quán)利要求6的用途，其中所述的樣本為血液樣本。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述的試劑盒還包括用于檢測(cè)樣本中二價(jià)鐵離子 含量的緩沖劑。9. 檢測(cè)樣品中二價(jià)鐵離子含量的方法，其包括將權(quán)利要求1或2中所定義的化合物與樣 本相接觸的步驟。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的樣本為血液樣本。
【文檔編號(hào)】C09K11/06GK105985771SQ201510761595
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年11月10日
【發(fā)明人】舒?zhèn)? 柳彩云, 朱寶存, 唐成城, 王作凱, 王雅偉
【申請(qǐng)人】濟(jì)南大學(xué)