基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針及其合成方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針及其合成方法和應(yīng)用，屬于蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該熒光探針具有化學(xué)穩(wěn)定性好、生物兼容性好，響應(yīng)速度快、靈敏度高、響應(yīng)范圍寬、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，能夠即時(shí)、在線的測(cè)定蛋白質(zhì)。用本發(fā)明熒光探針可對(duì)非金屬蛋白中的牛血清蛋白(BSA)和人血清蛋白(HSA)進(jìn)行選擇性檢測(cè)，檢出限可分別達(dá)到19.8nmol/L(1.32μg/mL)和24.5nmol/L(1.64μg/mL)。
【專利說明】
基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針及其合成方法和 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種在水相中測(cè)定蛋白質(zhì)的熒光探針及其 合成方法和檢測(cè)方法，具體涉及一種基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針及其合成方 法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)是生命體內(nèi)重要的生物大分子，是生命活動(dòng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成生物體內(nèi) 一切組織的基礎(chǔ)物質(zhì)，機(jī)體中的每一個(gè)細(xì)胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)的參與，因此 它與各種形式的生命活動(dòng)有著緊密的聯(lián)系。同時(shí)蛋白質(zhì)翻譯后的修飾、蛋白質(zhì)間相互作用、 蛋白質(zhì)構(gòu)象等問題，仍依賴于通過對(duì)蛋白質(zhì)的研究來解決。因此蛋白質(zhì)的特異性識(shí)別和定 量分析方法研究將直接推動(dòng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究，并且蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)一步深入，將對(duì)藥 物篩選、臨床診斷以及生命奧秘的揭示等領(lǐng)域的發(fā)展起到?jīng)Q定性的作用。
[0003] 目前，定量分析痕量蛋白質(zhì)的方法有分光光度法、熒光光度法、共振瑞利散射光譜 法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法、等離子體共振法、納米粒子法、過渡金屬羰基碎片法等。 在眾多蛋白痕量檢測(cè)方法中，熒光分析法以其選擇性好、靈敏度高、動(dòng)態(tài)響應(yīng)范圍寬、測(cè)試 條件更加接近生命體的生理環(huán)境以及可以實(shí)時(shí)在線檢測(cè)，能夠成像和輸出信號(hào)豐富等優(yōu)點(diǎn) 而被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析。因此，利用熒光傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)各種蛋白質(zhì)檢測(cè)分析的方法 備受關(guān)注。
[0004] 然而，現(xiàn)有的檢測(cè)蛋白的熒光探針分子對(duì)分子合成技術(shù)以及分子的選擇性有著高 度的依賴性，且大多疏水性較強(qiáng)，限制其在水溶液中的應(yīng)用以及對(duì)生物檢測(cè)對(duì)象的傳感。并 且部分熒光化學(xué)傳感器存在檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低等不足。而兩親性膽酸分子具有良好的 生物兼容性、化學(xué)穩(wěn)定性以及面雙親結(jié)構(gòu)，因此可以在水中形成特定的非共價(jià)超分子聚集 體，并且利用膽酸衍生物聚集體的熒光傳感器對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)幾乎沒有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針及其合成 方法和應(yīng)用，該熒光探針靈敏度高、選擇性好、測(cè)試范圍廣;該合成方法操作簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要 求低，適合放大生產(chǎn);該熒光探針能夠廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的檢測(cè)工作中。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針，該熒光探針的結(jié)構(gòu)式如下：
[0009] 式中，n = 2、3或 4。
[0010] 本發(fā)明還公開了上述基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，包括 以下步驟：
[0011] 1)合成芘磺酰基衍生物
[0012] 在氮?dú)鈿夥占氨l件下，將芘磺酰氯的三氯甲烷溶液滴加到二氨基含氧烷烴的 三氯甲烷溶液中，滴加完畢后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2~8h，然后將反應(yīng)液洗滌、干燥、蒸除溶劑三 氯甲烷，再將反應(yīng)物經(jīng)過柱層析分離純化，制得結(jié)構(gòu)式如下的芘磺?；苌铮?br>[0014] 式中，n = 2、3或 4;
[0015] 2)合成末端為溴的芘磺?；苌?br>[0016] 在氮?dú)鈿夥占氨l件下，將溴乙酰溴的二氯甲烷溶液滴加到芘磺?；苌锖?三乙胺的二氯甲烷溶液中，滴加完畢后繼續(xù)反應(yīng)24~30h，將反應(yīng)物經(jīng)過柱層析分離純化， 制得結(jié)構(gòu)式如下的末端為溴的芘磺?；苌铮?br>[0018] 3)合成基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針
[0019]在氮?dú)鈿夥障?，將膽酸鈉加入末端為溴的芘磺?；苌锖偷饣c的N，N-二甲基 甲酰胺溶液中，在70~80°C下加熱回流5~12h，待反應(yīng)液冷卻到室溫后，蒸除溶劑N，N-二甲 基甲酰胺，洗滌后萃取，然后干燥，再經(jīng)過柱層析分離純化，得到基于膽酸修飾的兩親性芘 衍生物熒光探針。
[0020]步驟1)中，芘磺酰氯與二氨基含氧烷烴的摩爾比為1: (5~10);二氨基含氧烷烴為 1，8-二氨基-3，6_二氧辛燒、3，6，9_二氧雜十一燒-1，11-二胺、或3，6，9，12-四氧雜十六燒-1，16-二胺。
[0021 ]步驟1)中，所述洗滌是用飽和食鹽水洗6~7次;所述干燥是用無水硫酸鈉干燥過 夜;所述柱層析分離純化是采用二氯甲烷與甲醇按體積比為(20~40) :1配成的混合溶劑作 為洗脫劑進(jìn)行過柱分離。
[0022]步驟2)中，芘磺?；苌铩逡阴ｄ寮叭野返哪柋葹?: (1.5~3): (1~2)。 [0023]步驟2)中，調(diào)節(jié)滴加速度為5~6s/滴;所述柱層析分離純化是采用乙酸乙酯與石 油醚按體積比為(2~10): 1配成的混合溶劑作為洗脫劑進(jìn)行過柱分離。
[0024] 步驟3)中，末端為溴的芘磺?；苌?、膽酸鈉及碘化鈉的摩爾比為1: (1.5~5): (1.5 ~5)〇
[0025] 步驟3)中，所述洗滌是用飽和食鹽水洗3~4次;所述萃取是用二氯甲烷進(jìn)行萃?。?所述干燥是用無水硫酸鈉干燥過夜;所述柱層析分離純化是采用二氯甲烷與甲醇按體積比 為(15~30):: 1配成的混合溶劑作為洗脫劑進(jìn)行過柱分離。
[0026] 步驟1)、2)、3)中控制氮?dú)饬魉贋? · 6~0 · 8mL/s。
[0027] 本發(fā)明還公開了上述基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針在檢測(cè)蛋白質(zhì)中 的應(yīng)用，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)為牛血清蛋白或人血清蛋白。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0029] 本發(fā)明公開了一種基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針，該探針以熒光量子 產(chǎn)率高、對(duì)微環(huán)境敏感、熒光輸出信號(hào)豐富的芘為報(bào)告基團(tuán)，以含有寡聚乙氧基和仲胺基的 鏈狀分子為親水性連接臂，通過引入生物兼容性好、具有面雙親結(jié)構(gòu)的膽酸基團(tuán)，制備了具 有自組裝能力的膽酸修飾的芘衍生物。該分子探針引入的膽酸具有面雙親結(jié)構(gòu)保證了其在 水相中的聚集，而引入的芘基團(tuán)具有單體和激基締合物多重?zé)晒獍l(fā)射的特點(diǎn)，有望賦予聚 集體系多波長(zhǎng)交互響應(yīng)識(shí)別性能，為創(chuàng)建新型的超分子熒光傳感體系提供了可能。此處需 要對(duì)該熒光探針的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)做出闡述，分析其優(yōu)勢(shì)。該基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒 光探針的化學(xué)穩(wěn)定性好、生物兼容性好、響應(yīng)速度快、選擇性好，可直接進(jìn)行檢測(cè)。
[0030] 本發(fā)明公開的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法操作簡(jiǎn)單，對(duì) 設(shè)備要求低，適合放大生產(chǎn)。用本發(fā)明熒光探針可對(duì)非金屬蛋白中的牛血清蛋白（BSA)和人 血清蛋白（HSA)進(jìn)行選擇性檢測(cè)，檢出限可分別達(dá)到19.8nmol/L( 1.32yg/mL)和24.5nmol/L (1·64yg/mL)。
【附圖說明】
[0031] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1制備的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針檢測(cè)牛血 清蛋白溶液的熒光強(qiáng)度變化曲線圖；
[0032] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1制備的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針檢測(cè)牛血 清蛋白溶液的濃度-Im/Ie值關(guān)系曲線圖；
[0033] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1制備的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針檢測(cè)人血 清蛋白溶液的熒光強(qiáng)度變化曲線圖；
[0034] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例1制備的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針檢測(cè)人血 清蛋白溶液的濃度-Im/Ie值關(guān)系曲線圖；
[0035] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例1制備的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針對(duì)8種蛋白 質(zhì)中牛血清蛋白和人血清蛋白的區(qū)分圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0037] 本發(fā)明公開了一種基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針，該熒光探針的結(jié)構(gòu) 式如下：
[0039] 式中，η為2或3或4。
[0040]上述由膽酸修飾的芘熒光探針的合成方法由下述步驟組成：
[0041 ] 1)合成芘磺?；苌?br>[0042]在流速為0.6~0.8mL/s的氮?dú)獗Ｗo(hù)和冰浴條件下，按摩爾比為1:10將芘磺酰氯的 三氯甲烷溶液滴加到二氨基含氧烷烴的三氯甲烷溶液中，滴加完后室溫?cái)嚢?小時(shí)，將反應(yīng) 液用飽和食鹽水洗6~7次，然后用無水硫酸鈉干燥過夜，蒸除三氯甲烷，用二氯甲烷與甲醇 的體積比為30:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物，得到式I所示的芘磺酰基衍生物， 其反應(yīng)方程式如下：
[0044] 上述的二氨基含氧烷烴為1，8-二氨基-3，6-二氧辛烷、3，6，9-三氧雜^^一烷_1， 11-二胺、3,6,9,12-四氧雜十六烷-1,16-二胺中的任意一種。
[0045] 2)合成末端為溴的芘磺酰基衍生物
[0046] 在流速為0.6~0.8mL/s的氮?dú)獗Ｗo(hù)和冰浴條件下，將溴乙酰溴的二氯甲烷溶液滴 加到芘磺?；苌锖腿野返亩燃淄槿芤褐校{(diào)節(jié)滴加速度為5~6s/滴，芘磺?；?生物、溴乙酰溴、三乙胺的摩爾比為1: (1.5~2): (1~1.5 )，滴加完成后繼續(xù)反應(yīng)24h，用乙 酸乙酯與石油醚的體積比為2:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物，得到式Π 所示的 末端為溴的芘磺?；苌?，其反應(yīng)方程式如下：
[0048] 3)合成基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針
[0049] 在流速為0.6~0.8mL/s的氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，將膽酸鈉加入末端為溴的芘磺?；?生物和碘化鈉的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，末端為溴的芘磺?；苌铩⒛懰徕c、碘化鈉的 摩爾比為1:2:1.5,70°(：加熱回流51 1，待反應(yīng)液冷卻到室溫后，蒸除叱1二甲基甲酰胺溶劑， 用飽和食鹽水洗滌3~4次，加入二氯甲烷萃取，然后用無水硫酸鈉干燥過夜，用二氯甲烷與 甲醇的體積比為20:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物，得到式m所示的基于膽酸修 飾的兩親性芘衍生物熒光探針，其反應(yīng)方程式如下：
[0051]上述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針在檢測(cè)蛋白質(zhì)中的用途，所述的 蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白或人血清白蛋白，其檢測(cè)方法如下：
[0052] 1、配制溶液
[0053] 將50yL濃度為2.5 X 10-3mol/L兩親性芘衍生物熒光探針的乙腈溶液加入25mL容量 瓶中，加 HEPES緩沖溶液（10mm〇l/L，pH 7.4)定容至刻度線，配制成5以111〇1/1熒光探針溶液。 分別稱取一定質(zhì)量的牛血清蛋白和人血清蛋白溶于10mm〇l/L HEPES緩沖溶液中，配制成 0.25mmol/L牛血清蛋白溶液和人血清蛋白溶液。
[0054] 2、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0055] 量取2.5mL 5ymol/L熒光探針溶液于比色皿中，逐漸向其中分別滴加0.25mmol/L 牛血清蛋白溶液或人血清蛋白溶液，用毛細(xì)管攪拌使其混合均勻，所得到的溶液中牛血清 蛋白和人血清蛋白的濃度均為Ο-ΙΟμ mol/L。熒光光譜的測(cè)試均在單光子熒光光譜儀(FS5， Edinburgh)上完成，光源為150W的氙燈，樣品的激發(fā)波長(zhǎng)均為350nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫分別 為2.0和1. Onm。待溶液達(dá)到平衡后，分別繪制熒光強(qiáng)度隨牛血清蛋白和人血清蛋白濃度變 化的焚光光譜圖，并通過采集單體(monomer，380nm)與激基締合物（excimer，490nm)處的焚 光強(qiáng)度，繪制Im/Ie值隨蛋白質(zhì)濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0056] 3、檢測(cè)待測(cè)樣品
[0057]按照上述方法用熒光儀測(cè)量待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的熒光強(qiáng)度，根據(jù)待測(cè)蛋白質(zhì)樣品的 Im/Ie值和濃度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程即可確定人血清蛋白或牛血清蛋白。
[0058]本發(fā)明基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的化學(xué)穩(wěn)定性好、生物兼容性 好、響應(yīng)速度快、選擇性好，可直接進(jìn)行檢測(cè)，如FS5、FLS920型單光子計(jì)數(shù)時(shí)間分辨熒光光 譜儀或其他類似的光學(xué)檢測(cè)器，實(shí)現(xiàn)對(duì)牛血清蛋白和人血清蛋白的選擇性檢測(cè)。
[0059] 實(shí)施例1
[0060]合成結(jié)構(gòu)式如下的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針：
[0062]其合成方法包括如下步驟：
[0063] 1)合成芘磺?；苌?br>[0064]在流速為0.6~0.8mL/s的氮?dú)獗Ｗo(hù)和冰浴攪拌條件下，向盛有50mL三氯甲烷的三 口燒瓶中加入 1 · 47mL(9 · 97mmol) 1，8-二氨基-3，6-二氧辛烷，然后將 0 · 30g(0 · 997mmol)芘 磺酰氯溶于40mL三氯甲烷中并滴加到上述溶液中。滴加完后室溫?cái)嚢?小時(shí)，停止反應(yīng)后， 將反應(yīng)液用飽和食鹽水洗6~7次，然后用無水硫酸鈉干燥過夜，蒸除三氯甲烷，用二氯甲烷 與甲醇的體積比為30:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物，得到式Π 所示的芘磺?；?衍生物，其反應(yīng)方程式如下：
[0066] 2)合成末端為溴的芘磺?；苌?br>[0067] 在流速為0.6~0.8mL/s的氮?dú)獗Ｗo(hù)和冰浴攪拌條件下，將215yL(2.48mmol)溴乙 酰溴溶于10mL二氯甲烷中，并將其滴入溶有0.51g(1.24mmol)芘磺?；苌锖?00yL (1.44mmol)三乙胺的二氯甲烷溶液中，調(diào)節(jié)滴加速度為5~6s/滴，滴加完成后繼續(xù)反應(yīng)24 小時(shí)。用乙酸乙酯與石油醚的體積比為2:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物，得到式 m所示的末端為溴的芘磺?；苌?，其反應(yīng)方程式如下：
[0069] 3)合成基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針
[0070] 在流速為0.6~0.8mL/s的氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，將0.84g(l.96mmol)膽酸鈉加入溶有 0.528(0.98!11111〇1)末端為溴的芘磺酰基衍生物和0.228(1.47111111〇1)碘化鈉的叱^二甲基甲 酰胺溶液中，70°C加熱回流5小時(shí)，待反應(yīng)液冷卻到室溫后，蒸除N，N-二甲基甲酰胺溶劑，用 飽和食鹽水洗滌3~4次，加入二氯甲烷萃取，然后用無水硫酸鈉干燥過夜，用二氯甲烷與甲 醇的體積比為20:1的混合溶劑作為洗脫劑柱層析純化產(chǎn)物，得到式I所示的基于膽酸修飾 的兩親性芘衍生物熒光探針，其收率為57%，其反應(yīng)方程式如下：
[0072]上述結(jié)構(gòu)式I的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的核磁數(shù)據(jù)為：4匪R (5ppm,600MHz,CDCl3) :9.01 (1H) ,8.72(1H),8.37-8.10(7H),7.02(1H),6.35(1H),4.58 (2Η)，3·85(2Η)，3·57-3·35(11Η),3.15(2H),2.44-2.15(5H)，1.98-1·32(16Η),1.23-0.95 (6H),0.94-0.80(6H),0.60(3H).
[0073] 實(shí)施例2
[0074] 合成結(jié)構(gòu)式如下的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針：
[0076]其合成方法步驟如下：
[0077] 在實(shí)施例1的合成芘磺酰基衍生物步驟1中，將所用的1，8-二氨基-3，6-二氧辛烷 用等摩爾質(zhì)量的3,6,9_三氧雜^^一烷-1，11-二氨替換，其它步驟與相應(yīng)的實(shí)施例1相同。
[0078] 實(shí)施例3
[0079]合成結(jié)構(gòu)式如下的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針：
[0081 ]在實(shí)施例1的合成芘磺?；苌锊襟E1中，將所用的1，8-二氨基-3，6-二氧辛烷 用等摩爾質(zhì)量的3，6,9,12-四氧雜十六烷-1，16-二氨替換，其它步驟與相應(yīng)的實(shí)施例1相 同。
[0082] 實(shí)施例4
[0083] 實(shí)施例1合成的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針在水相中檢測(cè)牛血清蛋 白的用途，其使用方法如下：
[0084] 1、配制溶液
[0085]向HEPES緩沖溶液（10mmOl/L，pH7.4)中加入基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒 光探針，配制成5ymol/L熒光探針溶液。稱取一定質(zhì)量的牛血清蛋白溶于10mm〇l/L HEPES緩 沖溶液中，配制成〇. 25mmol/L牛血清蛋白溶液。
[0086] 2、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0087] 量取2.5mL 5ymol/L熒光探針溶液于比色皿中，加入0.25mmol/L牛血清蛋白溶液， 用毛細(xì)管攪拌使其混合均勻，使得混合溶液中牛血清蛋白的濃度分別為〇.1、〇.3、0.5、1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0、7.0和1(^111〇1/1^。熒光光譜的測(cè)試均在單光子熒光光譜儀（？35， Edinburgh)上完成，光源為150W的氙燈，樣品的激發(fā)波長(zhǎng)均為350nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫分別 為2.0和1. Onm。待溶液達(dá)到平衡后，繪制熒光強(qiáng)度隨牛血清蛋白濃度變化的熒光光譜圖，見 圖1。并通過采集單體(monomer，380nm)與激基締合物(excimer，490nm)處的焚光強(qiáng)度，繪制 Im/Ie值隨蛋白質(zhì)濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。
[0088] 由圖1可見，濃度為5ymol/L的熒光探針的熒光強(qiáng)度隨著體系中牛血清蛋白濃度的 增大變化很明顯，說明所制備的熒光探針對(duì)牛血清蛋白的檢測(cè)靈敏度很高。由圖2可見，在 牛血清蛋白濃度為0-3. Oymol/L和3.0-ΙΟμ mol/L時(shí)，Im/Ie呈現(xiàn)不同的線性關(guān)系，線性方程分 別為：
[0089] yi = 1 · 510+1 · 107x 和 y2 = _4 · 636+3 · 338x
[0090] 式中ydPy2為牛血清蛋白濃度分別為0-3.0ymol/L和3.0_10ymol/L時(shí)Im/Ie值，x為 牛血清蛋白濃度，相關(guān)系數(shù)R分別為0.996和0.993。經(jīng)測(cè)試，該熒光探針對(duì)牛血清蛋白的檢 出限為 19 · 8nmol/L( 1 · 32yg/mL) 〇
[0091] 3、檢測(cè)待測(cè)樣品
[0092]向2.5mL 5ymol/L熒光探針溶液中加入不同體積的待測(cè)蛋白質(zhì)樣品，用熒光儀監(jiān) 測(cè)傳感平臺(tái)的熒光強(qiáng)度，通過計(jì)算Im/Ie值和濃度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程即可確定為牛 血清蛋白。
[0093] 實(shí)施例5
[0094]實(shí)施例1合成的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針在水相中檢測(cè)人血清蛋 白的用途，其使用方法如下：
[0095] 1、配制溶液
[0096]向HEPES緩沖溶液（10mmOl/L，pH7.4)中加入基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒 光探針，配制成5ymol/L熒光探針溶液。稱取一定質(zhì)量的人血清蛋白溶于10mm〇l/L HEPES緩 沖溶液中，配制成〇. 25mmol/L人血清蛋白溶液。
[0097] 2、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0098] 量取2.5mL 5ymol/L熒光探針溶液于比色皿中，加入0.25mmol/L人血清蛋白溶液， 用毛細(xì)管攪拌使其混合均勻，使得混合溶液中人血清蛋白的濃度分別為〇.1、〇.3、0.5、1.0、 2.0、3.0、4.0、5.0、7.0和1(^111〇1/1^。熒光光譜的測(cè)試均在單光子熒光光譜儀（？35， Edinburgh)上完成，光源為150W的氙燈，樣品的激發(fā)波長(zhǎng)均為350nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫分別 為2.0和l.Onm。待測(cè)試完畢后，繪制熒光強(qiáng)度隨人血清蛋白濃度變化的熒光光譜圖，見圖3。 并通過采集單體(monomer，380nm)與激基締合物(excimer，490nm)處的焚光強(qiáng)度，繪制Im/Ie 值隨蛋白質(zhì)濃度變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖4。
[0099] 由圖3可見，濃度為5ymol/L的熒光探針的熒光強(qiáng)度隨著體系中人血清蛋白濃度的 增大變化很明顯，說明所制備的熒光探針對(duì)人血清蛋白的檢測(cè)靈敏度很高。由圖4可見，在 人血清蛋白濃度為Ο-ΙΟμ mol/L時(shí)，Im/Ie與人血清蛋白濃度呈立方關(guān)系，方程為：
[0100] y = 1.375+0.450x-0.016x2+0.027x3
[0101 ]式中y為人血清蛋白濃度在Ο-ΙΟμ mol/L時(shí)Im/Ie值，x為人血清蛋白濃度，相關(guān)系數(shù)R 為0.999。經(jīng)測(cè)試，該熒光探針對(duì)人血清蛋白的檢出限為24.5nmol/L( 1.64yg/mL)。
[0102] 3、檢測(cè)待測(cè)樣品
[0103] 向2.5mL 5ymol/L熒光探針溶液中加入不同體積的待測(cè)蛋白質(zhì)樣品，用熒光儀監(jiān) 測(cè)傳感平臺(tái)的熒光強(qiáng)度，通過計(jì)算Im/Ie值和濃度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程即可確定為人 血清蛋白。
[0104] 為了證明本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人按照實(shí)施例4的方法，對(duì)濃度為1.0、3.0、5.0、 7.0和lOymol/L的牛血清蛋白、人血清蛋白、胃蛋白酶、卵清蛋白、β-乳球蛋白、胰蛋白酶、溶 菌酶和魚精蛋白分別進(jìn)行了測(cè)試，測(cè)試結(jié)果見圖5。由圖5可見，在相同條件下，加入8種不同 的蛋白質(zhì)，只有牛血清蛋白和人血清蛋白發(fā)生明顯的比例型響應(yīng)，而其他蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度 均未發(fā)生明顯的變化，說明本發(fā)明的熒光探針(5μπι 〇 1 /L)在1 Ommo 1 /L HEPES緩沖溶液中（pH 7.4)可以很好地選擇性區(qū)分牛血清蛋白和人血清蛋白，然后根據(jù)蛋白質(zhì)不同濃度下對(duì)應(yīng)的 Im/Ie值，結(jié)合牛血清蛋白和人血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程即可確定牛血清蛋白和人血清蛋 白。
[0105] 綜上所述，本發(fā)明采用兩親性熒光探針的超分子聚集體來構(gòu)建熒光傳感體系，既 可以實(shí)現(xiàn)其在水相中的檢測(cè)，又可以實(shí)現(xiàn)基于動(dòng)態(tài)聚集體調(diào)控的熒光傳感，減少對(duì)有機(jī)合 成的依賴。另外，我們構(gòu)建的熒光化學(xué)傳感器具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針，其特征在于，該熒光探針的結(jié)構(gòu)式 如下：式中，n = 2、3或4。2. 權(quán)利要求1所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特征在 于，包括以下步驟： 1) 合成芘磺酰基衍生物 在氮?dú)鈿夥占氨l件下，將芘磺酰氯的三氯甲烷溶液滴加到二氨基含氧烷烴的三氯 甲烷溶液中，滴加完畢后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2~8h，然后將反應(yīng)液洗滌、干燥、蒸除溶劑三氯甲 烷，再將反應(yīng)物經(jīng)過柱層析分離純化，制得結(jié)構(gòu)式如下的芘磺?；苌铮菏街?，n = 2、3或4; 2) 合成末端為溴的芘磺酰基衍生物 在氮?dú)鈿夥占氨l件下，將溴乙酰溴的二氯甲烷溶液滴加到芘磺酰基衍生物和三乙 胺的二氯甲烷溶液中，滴加完畢后繼續(xù)反應(yīng)24~30h，將反應(yīng)物經(jīng)過柱層析分離純化，制得 結(jié)構(gòu)式如下的末端為溴的芘磺?；苌铮?) 合成基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針 在氮?dú)鈿夥障?，將膽酸鈉加入末端為溴的芘磺酰基衍生物和碘化鈉的N，N-二甲基甲酰 胺溶液中，在70~80°C下加熱回流5~12h，待反應(yīng)液冷卻到室溫后，蒸除溶劑N，N-二甲基甲 酰胺，洗滌后萃取，然后干燥，再經(jīng)過柱層析分離純化，得到基于膽酸修飾的兩親性芘衍生 物熒光探針。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特 征在于，步驟1)中，芘磺酰氯與二氨基含氧烷烴的摩爾比為1: (5~10);二氨基含氧烷烴為 1，8-二氨基-3，6_二氧辛燒、3，6，9_二氧雜十一燒_1，11-二胺、或3，6，9，12-四氧雜十六燒-1，16-二胺。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特 征在于，步驟1)中，所述洗滌是用飽和食鹽水洗6~7次;所述干燥是用無水硫酸鈉干燥過 夜;所述柱層析分離純化是采用二氯甲烷與甲醇按體積比為(20~40): 1配成的混合溶劑作 為洗脫劑進(jìn)行過柱分離。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特 征在于，步驟2)中，芘磺?；苌铩逡阴ｄ寮叭野返哪柋葹?: (1.5~3): (1~2)。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特 征在于，步驟2)中，調(diào)節(jié)滴加速度為5~6s/滴;所述柱層析分離純化是采用乙酸乙酯與石油 醚按體積比為(2~10): 1配成的混合溶劑作為洗脫劑進(jìn)行過柱分離。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特 征在于，步驟3)中，末端為溴的芘磺?；苌铩⒛懰徕c及碘化鈉的摩爾比為1: (1.5~5): (1.5 ~5)〇8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特 征在于，步驟3)中，所述洗滌是用飽和食鹽水洗3~4次;所述萃取是用二氯甲烷進(jìn)行萃取； 所述干燥是用無水硫酸鈉干燥過夜;所述柱層析分離純化是采用二氯甲烷與甲醇按體積比 為(15~30):: 1配成的混合溶劑作為洗脫劑進(jìn)行過柱分離。9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針的合成方法，其特 征在于，步驟1)、2)、3)中控制氮?dú)饬魉贋?.6~0.8mL/s。10. 權(quán)利要求1所述的基于膽酸修飾的兩親性芘衍生物熒光探針在檢測(cè)蛋白質(zhì)中的應(yīng) 用，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)為牛血清蛋白或人血清蛋白。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK106047339SQ201610472271
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月23日
【發(fā)明人】丁立平, 范俊梅, 鄭德民, 卜雨, 崔華華, 房喻
【申請(qǐng)人】陜西師范大學(xué)