專(zhuān)利名稱(chēng)：測(cè)定結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的檢測(cè)和測(cè)量以及各種CTGF相關(guān)疾病和紊亂的診斷和檢測(cè)。
背景技術(shù)：
結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是有絲分裂、趨化和胞外基質(zhì)誘導(dǎo)因子用于成纖維細(xì)胞和其它結(jié)締組織細(xì)胞或其它能產(chǎn)生胞外基質(zhì)的細(xì)胞。CTGF多肽和基因序列鑒定自一些種類(lèi)，包括人。(參見(jiàn)例如Ryseck等，(1991)Cell Growth Differ 2225-233；國(guó)際出版號(hào)WO 00/27868，2000年5月18日出版；Bradham等，(1991)J Cell Biol1141285-1294)。人CTGF是1047個(gè)核苷的可讀框編碼的349個(gè)殘基多肽，相對(duì)全長(zhǎng)cDNA，起始位點(diǎn)在約核苷130且TGA終止位點(diǎn)在約核苷1177。(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,408,040；GenBank登錄號(hào)NP001892)病理上，CTGF參與的情況中結(jié)締組織過(guò)度生長(zhǎng)且胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，包括疾病如纖維化和皮膚及主要器官的過(guò)度創(chuàng)傷、癌癥、全身硬化癥、血管發(fā)生、動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化癥、糖尿病腎病和腎高血壓。(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,408,040；國(guó)際出版號(hào)WO 01/15729，2001年3月8日出版)此外，CTGF片段與一些生物活性相關(guān)。(參見(jiàn)例如，國(guó)際出版號(hào)WO 00/36939，2000年10月12日出版；國(guó)際出版號(hào)WO 00/36936，2000年6月22日出版；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,876,730；Brigstock等，(1997)J Biol Chem 27220275-20282；Ball等，(1998)Biol Reprod59828-835)盡管存在關(guān)于CTGF及其不同生物活性和疾病相關(guān)聯(lián)的知識(shí)，沒(méi)有可靠檢測(cè)區(qū)別和不同于CTGF片段的CTGF的方法和測(cè)量確定生物樣品中CTGF和CTGF片段水平的方法。例如，目前檢測(cè)CTGF的方法依賴(lài)肝素分離和濃縮CTGF多肽，或包括不區(qū)分多種CTGF片段的ELISA試驗(yàn)。(參見(jiàn)例如，Sato等，(2000)J Rheumatology27149-153；Tamanti等，(1998)Biochem Biophys Res Commun 251748-752；和Riser等，(2000)J Am Soc Nephrol 1125-38)因此，需要有助于檢測(cè)、測(cè)量和測(cè)量生物樣品中CTGF和多種CTGF形式如CTGF片段水平的試驗(yàn)系統(tǒng)。具體的是，需要選擇性鑒定不同于CTGF的具體CTGF片段的方法，可鑒定和測(cè)量不同疾病狀態(tài)中包含的具體CTGF片段。
發(fā)明概述本文描述了檢測(cè)CTGF和CTGF片段的方法，測(cè)量CTGF和CTGF片段水平的方法，診斷、確定預(yù)測(cè)和監(jiān)控多種CTGF相關(guān)情況、疾病或紊亂療效的方法。
一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)CTGF的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括檢測(cè)樣品中CTGF N-末端片段的存在，其中CTGF N-末端片段不同于CTGF C-末端片段和CTGF。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括檢測(cè)樣品中CTGF C-末端片段的存在，其中CTGF C-末端片段不同于CTGF N-末端片段和CTGF。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括檢測(cè)樣品中CTGF的存在，其中CTGF不同于CTGF N-末端和C-末端片段。
發(fā)明進(jìn)一步提供測(cè)量CTGF水平的方法。一方面，所述方法包括測(cè)量樣品中CTGFN-末端片段的水平，其中CTGF N-末端片段不同于CTGF C-末端片段和CTGF。另一方面，所述方法包括測(cè)量樣品中CTGF C-末端片段的水平，其中CTGF C-末端片段不同于CTGF N-末端片段和CTGF。另外一方面，所述方法包括測(cè)量樣品中CTGF的水平，其中CTGF不同于CTGF N-末端和C-末端片段。
在一些實(shí)施方案中，所述方法包括使樣品接觸第一種特異性結(jié)合CTGF區(qū)域的試劑、分離試劑、測(cè)量結(jié)合的CTGF的水平。此外，所述方法可進(jìn)一步包括加入第二試劑，它選自特異性結(jié)合第一試劑的第二試劑或特異性結(jié)合與第一試劑結(jié)合區(qū)域不同的CTGF區(qū)域的第二試劑、除去未結(jié)合的第二試劑、測(cè)量結(jié)合的第二試劑的量。在具體實(shí)施方案中，第一和第二試劑是抗CTGF抗體，結(jié)合CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的不同區(qū)域。在其它具體實(shí)施方案中，第一或第二試劑是任選連接載體的肝素。
本發(fā)明還涉及診斷CTGF相關(guān)疾病的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括獲得樣品、測(cè)量樣品中CTGF N-末端片段的水平并與CTGF N-末端片段的標(biāo)準(zhǔn)水平比較，其中樣品中CTGF N-末端片段量增加或減少指示CTGF相關(guān)疾病的存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括獲得樣品、測(cè)量樣品中CTGF C-末端片段的水平并與CTGF C-末端片段的標(biāo)準(zhǔn)水平比較，其中樣品中CTGF C-末端片段量增加或減少指示CTGF相關(guān)疾病的存在。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括獲得樣品、測(cè)量樣品中CTGF的水平并與CTGF的標(biāo)準(zhǔn)水平比較，其中樣品中CTGF量增加或減少指示CTGF相關(guān)疾病的存在。例如，樣品中CTGF N-末端片段增加也許指示纖維化疾病如腎纖維化、肝纖維化、心臟纖維化、硬皮病和炎性關(guān)節(jié)疾病。
還提供了預(yù)測(cè)CTGF相關(guān)疾病的方法。一方面，所述方法包括獲得樣品、檢測(cè)樣品中CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段或CTGF的水平，與標(biāo)準(zhǔn)水平比較，其中確定水平和標(biāo)準(zhǔn)水平間的差異指示CTGF相關(guān)疾病的預(yù)測(cè)。例如，樣品中相較標(biāo)準(zhǔn)更高水平的CTGF N-末端片段可指示情況較差的預(yù)測(cè)，如癌癥、糖尿病、器官移植、腹膜透析或心肌梗塞。
還提供了監(jiān)控CTGF相關(guān)疾病的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括在時(shí)間第一點(diǎn)從受試者中獲得第一個(gè)樣品，在時(shí)間第二點(diǎn)從受試者中獲得第二個(gè)樣品，比較第一個(gè)樣品中CTGF N-末端片段的水平和第二個(gè)樣品中CTGF N-末端片段的水平，其中第一個(gè)樣品中CTGF N-末端片段水平和第二個(gè)樣品中CTGF N-末端片段水平間的差異指示CTGF相關(guān)疾病的進(jìn)展。同樣考慮類(lèi)似的方法，其中比較第一個(gè)和第二個(gè)樣品中CTGF C-末端片段的水平或CTGF的水平。
本發(fā)明還涉及監(jiān)控治療CTGF相關(guān)疾病的療法功效的方法。在多種實(shí)施方案中，所述方法包括從受試者獲得樣品，受試者患CTGF相關(guān)疾病并接受對(duì)此疾病的`治療；測(cè)量樣品中CTGF或CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平；比較CTGF或CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平和標(biāo)準(zhǔn)水平，其中樣品中確定的水平和標(biāo)準(zhǔn)水平間的差異指示CTGF相關(guān)疾病療法的療效。另一方面，標(biāo)準(zhǔn)水平通過(guò)測(cè)量樣品中CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平來(lái)確定，樣品在較早時(shí)間點(diǎn)或治療開(kāi)始前從相同受試者獲得。
在任何前述方法中，樣品可獲自任何來(lái)源。一方面，樣品獲自哺乳動(dòng)物，在一個(gè)具體實(shí)施方案中哺乳動(dòng)物是人。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品可以是體液如尿或血漿。此外，檢測(cè)或測(cè)量CTGF的方法可結(jié)合另外標(biāo)記的檢測(cè)和測(cè)量以進(jìn)一步確定對(duì)受試者情況的診斷、預(yù)測(cè)等。例如，測(cè)量尿中清蛋白分泌率與測(cè)量CTGF N-末端片段結(jié)合，可進(jìn)一步確定腎疾病。
發(fā)明進(jìn)一步提供用于檢測(cè)CTGF的存在或測(cè)量CTGF水平的試劑盒。所述試劑盒可用于例如診斷CTGF相關(guān)疾病。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含至少一種第一試劑和至少一種第二試劑，第一試劑與CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段特異反應(yīng)，第二試劑被標(biāo)記且能形成與CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段或第一試劑的復(fù)合體。在一些具體實(shí)施方案中，第一和第二試劑是抗CTGF抗體，結(jié)合CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的不同區(qū)域。在其它具體實(shí)施方案中，第一或第二試劑是任選連接載體的肝素。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，第二試劑與CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合第一試劑。
發(fā)明還試劑篩選化合物的方法，該化合物影響CTGF或CTGF N-末端片段或CTGFC-末端片段的水平。在一些方面，所述方法包括獲得樣品、測(cè)量樣品中CTGF或CTGFN-末端片段或CTGF C-末端片段的第一種水平、使樣品與化合物接觸、測(cè)量CTGF或CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的第二種水平；比較第一種和第二種水平，其中第一種水平和第二種水平間的差異指示化合物，化合物影響CTGF或CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及方法用于鑒定CTGF相關(guān)疾病的誘因。在一些方面，所述方法包括獲得樣品、測(cè)量樣品中CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段或CTGF的第一種水平、比較樣品中N-末端片段、C-末端片段或CTGF的水平和標(biāo)準(zhǔn)水平，其中樣品中CTGF N-末端片段、CTGF C-末端片段或CTGF量增加或減少指示CTGF相關(guān)疾病的誘因。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及方法用于確定具體疾病是否與CTGF相關(guān)，即鑒定CTGF相關(guān)疾病。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括從患具體疾病的受試者中獲得樣品、測(cè)量樣品中CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段或CTGF的水平、比較此水平和標(biāo)準(zhǔn)非疾病水平，其中第一個(gè)樣品中水平和標(biāo)準(zhǔn)非疾病水平間的差異指示CTGF相關(guān)疾病療法的存在。疾病可與CTGF N-末端片段、CTGF C-末端片段或CTGF水平增加相關(guān)聯(lián)；或與CTGF N-末端片段、CTGF C-末端片段或CTGF水平減少相關(guān)聯(lián)。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A、1B和1C列出CTGF分子結(jié)構(gòu)、具體試驗(yàn)的描述和本發(fā)明的示范試劑。圖1A顯示編碼CTGF的多核苷酸轉(zhuǎn)錄物的外顯子結(jié)構(gòu)、CTGF蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)、特異性結(jié)合CTGF N-末端或C-末端片段上抗原表位的示范抗體試劑。圖1B顯示蛋白質(zhì)印跡，證明試劑特異性結(jié)合CTGF N-末端片段或C-末端片段的特異性。圖1C顯示本發(fā)明考慮的不同雙重試劑“夾層(sandwich)”試驗(yàn)?zāi)Ｊ胶涂捎糜诟髟囼?yàn)的示范試劑。
圖2列出的數(shù)據(jù)顯示ELISA(酶聯(lián)免疫吸附)測(cè)定的特異性，此測(cè)定檢測(cè)與CTGFN-末端片段和C-末端片段不同的CTGF(N-C夾層試驗(yàn))水平。
圖3列出的數(shù)據(jù)顯示ELISA測(cè)定的特異性，此測(cè)定檢測(cè)與CTGF C-末端片段不同的CTGF和CTGF N-末端片段(N-N夾層試驗(yàn))水平。
圖4列出的數(shù)據(jù)顯示ELISA測(cè)定的特異性，此測(cè)定檢測(cè)與CTGF N-末端片段不同的CTGF和CTGF C-末端片段(C-C夾層試驗(yàn))水平。
圖5A、5B和5C通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析列出數(shù)據(jù)顯示細(xì)胞培養(yǎng)物上清中CTGF和CTGF片段的水平。
圖6列出的結(jié)果證明正常人中CTGF N-末端片段的穩(wěn)定性高于CTGF。
圖7A和7B列出的數(shù)據(jù)顯示透析液中CTGF N-末端片段的水平，透析液獲自進(jìn)行腹膜透析的受試者。患者診斷為患1型糖尿病、腎小球腎炎或多囊纖維化。
圖8列出的數(shù)據(jù)顯示與正常、健康個(gè)體相比，獲自腎纖維化患者血清樣品中CTGF和CTGF片段的水平。纖維化的主要原因診斷為移植排斥、化學(xué)毒性或自身免疫纖維化。
圖9列出的數(shù)據(jù)顯示血清樣品中CTGF和CTGF片段的水平，樣品獲自器官移植患者和慢性器官移植排斥的患者。
圖10列出數(shù)據(jù)顯示與正常、健康個(gè)體相比，心肌梗塞或進(jìn)行性肝纖維化患者血清中CTGF和CTGF片段的水平。
圖11列出數(shù)據(jù)顯示與正常血清相比，炎性關(guān)節(jié)疾病個(gè)體的滑液中CTGF和CTGF片段的水平。
圖12A和12B列出數(shù)據(jù)顯示玻璃狀液中CTGF和CTGF片段的水平，玻璃狀液來(lái)自患多種眼病的受試者。
圖13列出數(shù)據(jù)顯示血清樣品中CTGF N-末端片段的水平，樣品獲自患多種癌癥的個(gè)體。
圖14A和14B列出數(shù)據(jù)顯示1型糖尿病個(gè)體的尿中CTGF N-末端片段的水平。圖12A顯示1型糖尿病患者中CTGF N-末端片段的水平，患者無(wú)蛋白尿、少量蛋白尿或大量蛋白尿。圖12B顯示示1型糖尿病患者中尿CTGF N-末端片段水平和白蛋白分泌到尿中速度間的相互關(guān)系。
圖15顯示人CTGF的核酸序列(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)。結(jié)構(gòu)域用方框和陰影表示，且鑒定如下IGF-BP(胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白基序)、VWC(Von Willebrand C型結(jié)構(gòu)域)和TSP1(1型血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域)。還顯示了相鄰?fù)怙@子的邊界。
圖16顯示人CTGF的氨基酸序列(hCTGF；SEQ ID NO2)和直向同源的母牛(bCTGF)、豬(pCTGF)、大鼠(rCTGF)和小鼠(FISP12)CTGF序列間的對(duì)比。序列對(duì)比用CLUSTALW多序列對(duì)比程序進(jìn)行(v.1.74；Thompson等，(1994)Nucleic Acids Res224673-4680)。
發(fā)明的描述在描述本發(fā)明的組合物和方法前，要理解本發(fā)明不限于所述具體方法、操作、細(xì)胞系、試驗(yàn)和試劑，因?yàn)檫@些可以變化。也要理解本文所用術(shù)語(yǔ)旨在描述本發(fā)明具體實(shí)施方案，附加權(quán)利要求中所列的不想限制本發(fā)明范圍。
必須指出，除非上下文另有明確說(shuō)明，本文和附加權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式包括復(fù)數(shù)。因此，例如“一種片段”包括這種片段的復(fù)數(shù)，“抗體”指一種或更多抗體和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等價(jià)物等。
除非另有說(shuō)明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的意義與此發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍理解的相同。盡管與本文所述類(lèi)似或相同的任何方法和材料可用于實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明，現(xiàn)在描述優(yōu)選方法、裝置和材料。本文所引用的所有出版物全部納入供參考，用于描述和揭示出版物中報(bào)導(dǎo)的方法、試劑和工具，出版物可用與發(fā)明相關(guān)使用。本文不允許發(fā)明由于以前的發(fā)明而不能使此公告提前。
除非另有說(shuō)明，本發(fā)明會(huì)使用化學(xué)、生物化學(xué)、分子生物、細(xì)胞生物、遺傳學(xué)、免疫學(xué)和藥理學(xué)的常規(guī)方法，在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中充分得到解釋。參見(jiàn)例如Gennaro(1990)Remington藥物科學(xué)(Remington’s PharmaceuticalSciences)，第18版，Mack Publishing公司；Colowick等，酶學(xué)中的方法(MethodsIn Enzymology)，Academic Press有限公司；Weir和Blackwell(1986)實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)(Handbook of Experimental Immunology)，I-IV卷，Blackwell ScientificPublicationsManiatis等，(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular CloningALaboratory Manual)，第2版，I-III卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel等，(1999)分子生物簡(jiǎn)短操作(Short Protocols in Molecular Biology)，第4版，John Wiley&Sons；Ream等，(1988)分子生物技術(shù)強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)室課程(Molecular Biology TechniquesAn Intensive Laboratory Course)，AcademicPress；Newton和Graham(1997)PCR(PCR)(生物技術(shù)入門(mén)系列)，第2版，SpringerVerlag)。
定義“結(jié)締組織生長(zhǎng)因子”或“CTGF”指充分純化的CTGF的氨基酸序列，純化CTGF獲自任何種類(lèi)，具體是哺乳動(dòng)物包括大鼠、兔、牛、綿羊、豬、鼠、馬，特別是人類(lèi)，且來(lái)自任何來(lái)源，天然、合成、半合成或重組。
一方面，“結(jié)締組織生長(zhǎng)因子”或“CTGF”之多肽序列，包括至少部分CTGF N-末端片段和至少部分CTGF C-末端片段。
涉及CTGF或任何變體或其片段中所用術(shù)語(yǔ)“N-末端片段”和“N-片段”指任何含序列的多肽，序列獲自CTGF多肽氨基末端部分。CTGF N-末端片段可包括所有、沒(méi)有或部分從起始甲硫氨酸殘基到無(wú)半胱氨酸“鉸鏈”區(qū)域的CTGF。此外，CTGF N-末端片段可包括所有、沒(méi)有或部分胰島素生長(zhǎng)因子-結(jié)合蛋白基序和/或von Willebrand C型結(jié)構(gòu)域。CTGF N-末端片段可包括所有、沒(méi)有或部分無(wú)半胱氨酸的區(qū)域。另外，CTGF N-末端片段可以是15個(gè)或更多任何上述定義CTGF N-末端片段中包含的連續(xù)氨基酸。
一方面，CTGF的“N-末端片段”或“N-片段”指獲自人CTGF氨基末端部分的多肽序列。這種片段可包括從SEQ ID NO2的氨基酸殘基1到約氨基酸殘基198的全部區(qū)域，或從SEQ ID NO2的約氨基酸23到約氨基酸198。鉸鏈區(qū)域中N-末端片段的邊界可任選由SEQ ID NO2中定義的一些蛋白酶之一來(lái)確定，如SEQ IDNO2的殘基179和180間、殘基182和183間、殘基188和189間的胰凝乳蛋白酶切割位點(diǎn)；SEQ ID NO2的殘基183和184間、殘基196和197間的纖溶酶切割位點(diǎn)；SEQ ID NO2的殘基169和170間的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1切割位點(diǎn)。此外，人CTGF的N-末端片段可包括所有、沒(méi)有或部分從SEQ ID NO2的氨基酸27到氨基酸97、SEQ ID NO2的氨基酸103到氨基酸166或SEQ ID NO2的氨基酸167到氨基酸198的區(qū)域。另外，人CTGF的N-末端片段可以是15個(gè)或更多任何上述定義CTGF N-末端片段中包含的連續(xù)氨基酸。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的CTGF N-末端片段包括的序列選自下列人CTGF(SEQ ID NO2)區(qū)域和其獲自不同種類(lèi)的直向同源片段，具體是哺乳動(dòng)物種類(lèi)包括大鼠、兔、牛、綿羊、豬、鼠和馬氨基酸殘基23到氨基酸殘基96(外顯子2編碼)；氨基酸殘基27到氨基酸殘基97(IGF-BP基序)；氨基酸殘基97到氨基酸殘基180(外顯子3編碼)；氨基酸殘基103到氨基酸殘基166(VWC結(jié)構(gòu)域)；氨基酸殘基167到氨基酸殘基198(無(wú)半胱氨酸的鉸鏈)，不被相應(yīng)CTGF C-末端片段包括；氨基酸殘基23到氨基酸殘基180(外顯子2和3編碼)；氨基酸殘基27到氨基酸殘基166(IGF-BP和VWC結(jié)構(gòu)域)；氨基酸殘基23到氨基酸殘基198。
CTGF的“C-末端片段”和“C-片段”是指包含CTGF多肽羧基末端部分序列的任何多肽或其任何變體或片段。C-末端片段可包括所有、沒(méi)有或部分從無(wú)半胱氨酸鉸鏈區(qū)域到蛋白質(zhì)末端的CTGF。此外，C-末端片段可包括所有、沒(méi)有或部分1型血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域和/或半胱氨酸-結(jié)基序。另外，CTGF C-末端片段可以是15個(gè)或更多任何上述定義CTGF C-末端片段中包含的連續(xù)氨基酸。
一方面，CTGF的“C-末端片段”和“C-片段”指獲自人CTGF羧基末端部分的多肽序列。這種片段可包括從SEQ ID NO2的氨基酸殘基181到約氨基酸殘基349的全部區(qū)域。鉸鏈區(qū)域中C-末端片段的邊界可任選由SEQ ID NO2中定義的一些蛋白酶之一來(lái)確定，如上面定義的胰凝乳蛋白酶、纖溶酶和骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1切割位點(diǎn)。此外，人CTGF C-末端片段可包括所有、沒(méi)有或部分從SEQ ID NO2的氨基酸201到氨基酸242、SEQ ID NO2的氨基酸247到氨基酸349、SEQ ID NO2的氨基酸248到氨基酸349或SEQ ID NO2的氨基酸249到氨基酸346的區(qū)域。另外，人CTGF C-末端片段可以是15個(gè)或更多任何上述定義CTGF C-末端片段中包含的連續(xù)氨基酸。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的CTGF C-末端片段包括的序列選自下列人CTGF(SEQ ID NO2)區(qū)域和其獲自不同種類(lèi)的直向同源片段，具體是哺乳動(dòng)物種類(lèi)包括大鼠、兔、牛、綿羊、豬、鼠和馬氨基酸殘基181到氨基酸殘基251(外顯子4編碼)；氨基酸殘基201到氨基酸殘基242(1型血小板反應(yīng)蛋白基序)；氨基酸殘基252到氨基酸殘基349(外顯子5編碼)；氨基酸殘基249到氨基酸殘基346(半胱氨酸結(jié)結(jié)構(gòu)域)；氨基酸殘基167到氨基酸殘基198部分(無(wú)半胱氨酸的鉸鏈)，不被相應(yīng)CTGF N-末端片段包括；氨基酸殘基201到氨基酸殘基346(TP1和CK結(jié)構(gòu)域)；氨基酸殘基247到氨基酸殘基348；氨基酸殘基248到氨基酸殘基348。
術(shù)語(yǔ)CTGF的“無(wú)半胱氨酸區(qū)域”或“鉸鏈區(qū)域”指任何獲自人CTGF(SEQ ID NO2)約氨基酸殘基167到約氨基酸殘基198的多肽和獲自不同種類(lèi)的直向同源片段，具體是哺乳動(dòng)物種類(lèi)包括大鼠、兔、牛、綿羊、豬、鼠和馬。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列”或“多肽”或“幾種多肽”在本文中指寡肽、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列以及它們的片段，指天然產(chǎn)生或合成的分子。多肽或氨基酸片段是任何多肽部分，保持至少一種多肽結(jié)構(gòu)和/或功能特征。CTGF片段包括任何CTGF多肽序列部分，保持至少一種CTGF結(jié)構(gòu)或功能特征。“氨基酸序列”指天然產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子的多肽序列，“氨基酸序列”和類(lèi)似術(shù)語(yǔ)不打算將氨基酸序列限于所討論蛋白質(zhì)分子相關(guān)的完整天然序列。
術(shù)語(yǔ)“核酸”或“多肽”或“幾種多肽”指寡核苷酸、核苷序列或多核苷酸或它們的任何片段，指天然或合成來(lái)源的DNA或RNA，DNA或RNA可以是單或雙鏈且可代表正義和反義鏈，指肽核酸(PNA)，或指天然或合成來(lái)源的任何DNA-類(lèi)似或RNA-類(lèi)似物質(zhì)。多核苷酸片段是任何多核苷酸序列部分，保持至少一種多核苷酸結(jié)構(gòu)或功能特征。多核苷酸片段可以有不同長(zhǎng)度，例如大于60個(gè)核苷長(zhǎng)度、至少100個(gè)核苷長(zhǎng)度、至少1000個(gè)核苷長(zhǎng)度或至少10,000個(gè)核苷長(zhǎng)度。
“改變的”多核苷酸包括不同核苷酸的缺失、插入或取代，這將產(chǎn)生編碼相同或功能相等多肽的多核苷酸。該定義包括具有多態(tài)性的序列，此多態(tài)性容易或不容易用特定的寡核苷酸探針檢測(cè)，或通過(guò)不合適或不需要的等位基因與不同于受試者多核苷酸序列正常染色體基因座的基因座的雜交的缺失來(lái)檢測(cè)。
“改變的”多肽可包含缺失、插入或取代氨基酸殘基，產(chǎn)生沉默變化且導(dǎo)致功能相等多肽。只要保持編碼多肽的生物或免疫活性，仔細(xì)考慮的氨基酸取代可在殘基極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩性性質(zhì)相似性基礎(chǔ)上進(jìn)行。例如，負(fù)電荷氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；正電荷氨基酸可包括賴(lài)氨酸和精氨酸；有類(lèi)似親水值的具無(wú)電荷極性頭部基團(tuán)的氨基酸可包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，甘氨酸和丙氨酸，天冬酰胺和谷氨酰胺，絲氨酸和蘇氨酸，苯丙氨酸和酪氨酸。
多肽或氨基酸“變體”是從具體氨基酸序列改變一個(gè)或更多氨基酸的氨基酸序列。多肽變體可以有保守性變化，其中取代氨基酸結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)類(lèi)似被取代氨基酸，如用異亮氨酸取代亮氨酸。變體也可有保守性變化，其中取代氨基酸物理性質(zhì)不同于被取代氨基酸，如用色氨酸取代甘氨酸。類(lèi)似的小變化也可包括氨基酸缺失或插入或兩者都有。優(yōu)選的是，氨基酸變體保持特定多肽的一些結(jié)構(gòu)或功能特征?？砂l(fā)現(xiàn)確定取代、插入或缺失哪些氨基酸殘基的指南，例如使用本領(lǐng)域熟知的計(jì)算機(jī)程序，如LASERGENE軟件(DNASTAR有限公司，Madison，WI)。
多核苷酸變體是特定多核苷酸序列的變體，優(yōu)選與特定多核苷酸序列有至少約80％的多核苷酸序列相似性，更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％。本領(lǐng)域技術(shù)人員贊同遺傳密碼簡(jiǎn)并性的結(jié)果是可產(chǎn)生多種編碼具體蛋白質(zhì)的不同多核苷酸序列，一些攜帶與任何已知和天然產(chǎn)生基因的多核苷酸序列最小同源性。因此，發(fā)明考慮各個(gè)可能的多核苷酸序列變化，變化可在可能的密碼子選擇基礎(chǔ)上通過(guò)選擇組合來(lái)產(chǎn)生。這些組合是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)三密碼子遺傳密碼，且所有這些變化被具體揭示。
“缺失”是氨基酸或核苷序列中的變化，導(dǎo)致一個(gè)或更多氨基酸殘基或核苷的缺乏。
術(shù)語(yǔ)“插入”或“加入”指多肽或多核苷酸序列中的變化，與天然產(chǎn)生分子相比，分別導(dǎo)致一個(gè)或更多氨基酸殘基或核苷的加入。
術(shù)語(yǔ)“功能等價(jià)物”在本文中指擁有至少一種特定多肽或多核苷酸的功能和/或結(jié)構(gòu)特征的多肽或多核苷酸。功能等價(jià)物可包含能行使具體功能的修飾。術(shù)語(yǔ)“功能等價(jià)物”確定為包括分子的片段、突變體、雜合體、變體、類(lèi)似物或化學(xué)衍生物。
術(shù)語(yǔ)“微陣列”指任何分子排列，如底物上的核酸、氨基酸、抗體等。底物可以是任何適當(dāng)載體，如珠、玻璃、紙、硝化纖維、尼龍或任意合適的膜等。底物可以是任何剛性或半剛性載體，包括但不限于膜、過(guò)濾器、干膠片、芯片、載玻片、纖維、珠，包括磁性或非磁性珠、膠、管、平板、聚合物、微粒、毛細(xì)管等。底物可提供包被表面和/或具有多種表面形式，如核酸、氨基酸等可結(jié)合的孔、釘、渠、通道和孔隙。
“抗原性”是指當(dāng)?shù)孜锉灰塍w內(nèi)時(shí)刺激免疫應(yīng)答和生成抗體的能力。表現(xiàn)抗原性特征的試劑被稱(chēng)為抗原的?？乖噭┛砂ǖ幌抻诙喾N大分子，例如蛋白質(zhì)、脂蛋白、多糖、核酸、細(xì)菌和細(xì)菌成分以及病毒和病毒成分?？乖沃窩TGF多肽片段，優(yōu)選約五到十五個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的片段，此片段保持至少一種CTGF多肽活性的生物或免疫方面。
“免疫原性”指引起生物體免疫應(yīng)答的能力。表現(xiàn)免疫原性特征的試劑被稱(chēng)為免疫原性的。免疫試劑可包括但不限于多種大分子，例如蛋白質(zhì)、脂蛋白、多糖、核酸、細(xì)菌和細(xì)菌成分以及病毒和病毒成分。免疫原試劑通常有相當(dāng)高的分子量(常大于10kDa)。免疫原片段指CTGF多肽片段，優(yōu)選約五到十五個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的片段，此片段保持至少一種CTGF多肽活性的生物或免疫方面。
術(shù)語(yǔ)“抗體”指獲自任何來(lái)源的免疫球蛋白或抗體，包括細(xì)胞系活動(dòng)物如小鼠、大鼠、兔、雞、火雞、山羊、馬、人等?？贵w也可獲自遺傳改變的細(xì)胞或轉(zhuǎn)基因植物或改造以產(chǎn)生非宿主內(nèi)源抗體的動(dòng)物?？贵w可以是任何同種型，包括IgA、IgD、IgE、IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4或IgM。此外，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整分子和其片段，如能結(jié)合抗原決定簇的Fab、F(ab’)2和Fv片段，且包括多克隆或單克隆抗體。抗體也可指嵌合抗體，如結(jié)合一個(gè)或更多獨(dú)特抗原的二價(jià)和三價(jià)抗體。
結(jié)合CTGF或CTGF片段的抗體可用完整多肽或含感興趣小肽的片段作為免疫抗原來(lái)制備。用于免疫動(dòng)物的多肽或寡肽可獲自RNA翻譯或化學(xué)合成，如需要可結(jié)合載體蛋白質(zhì)。普遍使用的載體化學(xué)偶聯(lián)肽，肽包括例如牛血清白蛋白、甲狀腺球蛋白和匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)。
術(shù)語(yǔ)“紊亂”和“疾病”都可以使用且指任何偏離正常的情況。
本文所用短語(yǔ)“CTGF相關(guān)疾病”指與CTGF異?；虿贿m當(dāng)表達(dá)或活性相關(guān)的情況和疾病。CTGF異常表達(dá)與細(xì)胞增殖疾病相連，如由內(nèi)皮細(xì)胞增殖或移動(dòng)引起的疾病、腫瘤類(lèi)似生長(zhǎng)、總組織創(chuàng)傷以及以胞外基質(zhì)不適當(dāng)沉積為特征的不同疾病。
CTGF相關(guān)疾病包括但不限于含血管發(fā)生和其它增殖過(guò)程的疾病，這些增殖過(guò)程在例如動(dòng)脈硬化癥、青光眼等情況中發(fā)揮關(guān)鍵作用；癌癥，包括急性成淋巴細(xì)胞白血病、皮膚纖維瘤、乳腺癌、乳腺癌結(jié)締組織生成、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、結(jié)締組織癌以及前列腺、卵巢、結(jié)腸直腸、胰腺、胃腸和肝癌及其它腫瘤和轉(zhuǎn)移。
此外，CTGF相關(guān)疾病包括但不限于來(lái)自局部或全身纖維化的過(guò)多創(chuàng)傷，包括慢性或急性器官纖維化如腎、肺、肝、眼、心臟、皮膚等。這種CTGF疾病包括多種纖維化疾病，例如心臟纖維化，包含心肌梗塞或心臟充血衰竭后的心臟反應(yīng)纖維化或心臟改造；肺病，包括間質(zhì)性肺纖維化等；透析相關(guān)纖維化，包括腹膜透析如連續(xù)移動(dòng)腹膜透析(CAPD)；硬膜外纖維化；腎纖維化；肺纖維化；間質(zhì)纖維化；皮膚纖維化；急性或重復(fù)損傷導(dǎo)致的纖維化，包括手術(shù)、化療、放療、同種異體移植排斥、慢性和急性移植排斥(如腎、肝或其它器官)；閉塞性細(xì)支氣管炎，如肺移植后；炎癥和感染，如由于疾病或損傷引起。
另外，CTGF相關(guān)疾病包括但不限于硬化情況，包含全身硬化癥、硬皮病、瘢痕瘤、肥大性創(chuàng)傷、其它皮膚病和情況；動(dòng)脈硬化癥，如含動(dòng)脈粥樣硬化斑的情況和糖尿病相關(guān)的動(dòng)脈硬化癥，包括腹膜透析相關(guān)的動(dòng)脈硬化癥；動(dòng)脈硬化；關(guān)節(jié)炎，包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和其它關(guān)節(jié)發(fā)炎情況等；間質(zhì)疾病，包括間質(zhì)纖維化；克羅恩氏?。荒c發(fā)炎?。灰暰W(wǎng)膜病，包括例如增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病、非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病、增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病和斑狀降解(包括年齡相關(guān)和青少年疾病(斯塔加特病)和豬上皮細(xì)胞分離)；腎病，包括糖尿病腎病、IgA-相關(guān)腎病、毒性引起的腎病等；化學(xué)毒性小管破壞相關(guān)的情況。
本文所指“增殖性”過(guò)程和疾病包括以細(xì)胞連續(xù)增殖為特征的病理狀態(tài)，導(dǎo)致組織中細(xì)胞群過(guò)度生長(zhǎng)。細(xì)胞群不必須是轉(zhuǎn)化、腫瘤或惡性細(xì)胞，但也可包括正常細(xì)胞。例如，CTGF可參與病態(tài)，通過(guò)誘導(dǎo)動(dòng)脈壁內(nèi)膜層中的增殖性損傷或通過(guò)刺激新血管形成來(lái)導(dǎo)致動(dòng)脈硬化癥。
“癌”指任何組織的自發(fā)生長(zhǎng)，包括不受控制、異常的細(xì)胞生長(zhǎng)，或指任何不限制生長(zhǎng)的惡性腫瘤，通過(guò)侵入局部擴(kuò)增且通過(guò)轉(zhuǎn)移全身擴(kuò)增。癌也指癌引起的任何異常狀態(tài)。
術(shù)語(yǔ)“纖維化”指纖維狀組織的異常加工、或纖維瘤或纖維狀降解。纖維化可來(lái)自不同損傷和疾病，?？蓙?lái)自涉及不同器官移植的慢性移植排斥。纖維化一般包括胞外基質(zhì)成分的異常產(chǎn)生、積聚或沉積，含例如膠原和纖連蛋白的過(guò)度產(chǎn)生和沉積增加。本文所用最廣泛意義的“纖維化”指任何胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的過(guò)度產(chǎn)生或沉積。有許多纖維化例子，包括心臟病發(fā)作后形成創(chuàng)傷組織，損害心臟泵的能力。糖尿病常引起腎中的損傷/創(chuàng)傷，導(dǎo)致腎功能逐漸損失。甚至手術(shù)后，創(chuàng)傷組織可形成內(nèi)部器官，引起攣縮、疼痛和一些情況中的不育。主要器官如心臟、腎、肝、眼和皮膚易受慢性創(chuàng)傷，通常與其它疾病相關(guān)。肥大性創(chuàng)傷(非惡性組織塊)是燒傷和其它損傷引起的普通纖維化形式。此外，一些其它纖維增殖疾病包括硬皮病、瘢痕瘤和動(dòng)脈粥樣硬化癥，分別與總組織創(chuàng)傷、皮膚中腫瘤類(lèi)似生長(zhǎng)或持續(xù)的血管創(chuàng)傷相關(guān)，血管創(chuàng)傷損害血液攜帶能力。
本文所用術(shù)語(yǔ)“樣品”具最廣泛的意義。樣品可獲自任何來(lái)源，來(lái)自體液、分泌、組織、細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞包括但不限于唾液、血、尿、血清、血漿、玻璃體、滑液、腦脊液、羊水和器官組織(如活組織切片檢查的組織)；來(lái)自染色體、細(xì)胞器官或其它分離自細(xì)胞的膜；來(lái)自基因組DNA、cDNA、RNA、mRNA等；來(lái)自清除的細(xì)胞或組織，或來(lái)自這種細(xì)胞或組織的印跡或特征。樣品可獲自任何來(lái)源，例如人類(lèi)受試者、非人的哺乳動(dòng)物試驗(yàn)品等。同樣考慮獲自任何動(dòng)物疾病模型的樣品。樣品可指任意適于測(cè)試CTGF或CTGF片段存在的方法，或適于篩選結(jié)合CTGF或其片段的分子的方法。獲得這些樣品的方法在本領(lǐng)域技術(shù)水平內(nèi)。
術(shù)語(yǔ)“雜交”指核酸序列通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合互補(bǔ)序列的過(guò)程。確定雜交條件可通過(guò)例如預(yù)雜交和雜交溶液中鹽或甲酰胺濃度或通過(guò)雜交溫度，這些條件在本領(lǐng)域熟知。雜交可在不同嚴(yán)格條件下發(fā)生。
具體的是，降低鹽濃度、增加甲酰胺濃度或提高雜交溫度可增強(qiáng)嚴(yán)格性。例如為了本發(fā)明目的，高嚴(yán)格條件下的雜交可在約50％甲酰胺中在約37℃到42℃發(fā)生，和在嚴(yán)格性降低條件下在約35％到25％甲酰胺中約30℃(2到35℃發(fā)生。具體是，雜交一般在最高嚴(yán)格性條件中42℃發(fā)生，在50％甲酰胺、5X SSPE、0.3％SDS和200μg/ml剪切和變性鮭精DNA中。
對(duì)應(yīng)于具體嚴(yán)格性水平的溫度范圍可進(jìn)一步由本領(lǐng)域一直方法限制，例如通過(guò)計(jì)算感興趣核酸的嘌呤和嘧啶比例和相應(yīng)調(diào)節(jié)溫度。為除去非特異信號(hào)，可連續(xù)洗印跡，例如在室溫或至60℃，包括60℃，在嚴(yán)格性增加條件下至0.1 X SSPE和0.5％SDS。上述范圍和條件上的變化在本領(lǐng)域熟知。
發(fā)明本文發(fā)現(xiàn)可檢測(cè)和進(jìn)一步測(cè)量CTGF具體片段，不取決于CTGF或其它CTGF片段。本發(fā)明提供方法可靠檢測(cè)和測(cè)量生物樣品中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的水平。此外，診斷、預(yù)測(cè)和確定不同疾病和情況的進(jìn)展，例如糖尿??；纖維化包括肝、腎和肺纖維化；心肌梗塞；炎性關(guān)節(jié)疾病；癌癥；全身硬化癥；血管發(fā)生；動(dòng)脈硬化、動(dòng)脈粥樣硬化；移植排斥；不同眼病，包括糖尿病視網(wǎng)膜??；限制和擴(kuò)散的硬皮??；腎高血壓；和腹膜透析相關(guān)情況等，也可用本文所述組合物和方法完成。
結(jié)締組織生長(zhǎng)因子先前報(bào)導(dǎo)和描述結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)。(參見(jiàn)例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,408,040；Bradham等，(1991)J Cell Biol 1141285-1294)。CTGF是單體多肽，分子量約為36到38kDa。CTGF是最近描述的半胱氨酸-豐富分泌蛋白質(zhì)家族成員，此家族稱(chēng)為CCN生長(zhǎng)因子家族(CTGF，Cyr-61，nov)，特征是不同模塊結(jié)構(gòu)域中存在高度保守的半胱氨酸殘基。這些結(jié)構(gòu)域各自由單獨(dú)外顯子編碼，表現(xiàn)出與多種胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)中所發(fā)現(xiàn)保守區(qū)域的同源性。具體是，這些CTGF中的模塊結(jié)構(gòu)類(lèi)似胰島素類(lèi)似生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白N-末端半胱氨酸-豐富區(qū)域(CTGF結(jié)構(gòu)域1，外顯子2編碼)；寡聚化中包含的Von Willebrand C型結(jié)構(gòu)域(CTGF結(jié)構(gòu)域2，外顯子3編碼)；1型血小板反應(yīng)蛋白基序，可包含細(xì)胞附著區(qū)域且認(rèn)為參與結(jié)合胞外基質(zhì)和硫酸化糖綴合物(CTGF結(jié)構(gòu)域3，外顯子4編碼)；C-末端半胱氨酸節(jié)基序，類(lèi)似參與受體結(jié)合的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和血小板獲得生長(zhǎng)因子(PDGF)(CTGF結(jié)構(gòu)域4，外顯子5編碼)。(Bork(1993)FEBS Lett 327125-130)CTGF不同片段顯示表現(xiàn)出生物活性。(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,876,730；Brigstock等，(1997)J Biol Chem 27220275-20282；Ball等，(1998)Biol Reprod59828-835；Steffen等，(1998)Growth Factors 15199-213；國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朩O00/35939和國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朩O 00/35936)CTGF片段也在人生物液體以及培養(yǎng)牛內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中被檢測(cè)到，人生物液體例如獲自懷孕血清、羊水和腹膜液。(Yang等，(1998)J Clin Endocrinol Metab 832593-2596；Boes等，(1999)Endocrinology 1401575-1580)。
CTGF作用于促進(jìn)成纖維細(xì)胞和其它結(jié)締組織細(xì)胞增殖、趨化現(xiàn)象、移動(dòng)、粘附和胞外基質(zhì)形成。證據(jù)表明CTGF的異常表達(dá)或過(guò)度生成在導(dǎo)致纖維化疾病途徑中發(fā)揮主要作用，包括主要器官纖維化、纖維增殖疾病和創(chuàng)傷。CTGF在多種細(xì)胞類(lèi)型中產(chǎn)生效果，包括例如結(jié)締組織細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞等)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和更特化的結(jié)締組織細(xì)胞，如骨、軟骨和其它支持骨骼組織。(參見(jiàn)例如Moussad和Brigstock(2000)MolGenet Metab 71276-292)本說(shuō)明涉及發(fā)現(xiàn)一些CTGF片段水平在某些情況中增加。在一個(gè)具體方面，本發(fā)明證明在某些情況中CTGF N-末端片段比CTGF或CTGF C-末端片段更容易檢測(cè)，如在生物液體中等。盡管發(fā)明不限于任何具體CTGF片段積聚的機(jī)制，N-末端片段也許更穩(wěn)定，因?yàn)樗鼈兏灰妆坏鞍姿狻⒏灰浊宄虺?、?或更不傾于非特異性結(jié)合或吸收。因此，檢測(cè)CTGF N-末端片段可提供更好的特異性和重復(fù)性用于闡明此多肽的作用機(jī)制和位點(diǎn)。此外，本說(shuō)明確定CTGF的異常水平，具體是CTGFN-末端片段，可與疾病存在和疾病嚴(yán)重性相關(guān)。
因此，一方面，本發(fā)明涉及使用CTGF多肽N-末端片段以檢測(cè)(定性或定量)CTGF和預(yù)測(cè)、診斷及治療監(jiān)控CTGF相關(guān)疾病。另一方面，本發(fā)明涉及使用CTGF多肽C-末端片段以檢測(cè)(定性或測(cè)量)CTGF和預(yù)測(cè)、診斷及治療監(jiān)控CTGF相關(guān)疾病。CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段可以本發(fā)明提供的一些方式檢測(cè)、鑒定和測(cè)量。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明考慮CTGF C-末端片段和N-末端片段是具體CTGF C-末端和N-末端片段的變體，它們可通過(guò)突變編碼感興趣片段的多核苷酸序列來(lái)構(gòu)建以產(chǎn)生自然中不出現(xiàn)的氨基酸序列。氨基酸改變可在不同種類(lèi)(可變位置)亞基或高度保守區(qū)域(恒定區(qū))中不同位點(diǎn)進(jìn)行。這些位置的位點(diǎn)通常被連續(xù)修飾，如首先通過(guò)保守取代(如疏水性氨基酸到不同的疏水性氨基酸)且隨后用更遠(yuǎn)的取代(如疏水性氨基酸到帶電氨基酸)，接著可在靶位點(diǎn)進(jìn)行缺失或插入。
本文所述多肽，例如用于產(chǎn)生CTGF N-末端或CTGF C-末端特異抗體的多太，可用任何本領(lǐng)域已知的許多方法來(lái)合成至少部分所需CTGF氨基酸序列N-末端或C-末端片段。例如肽可通過(guò)固相技術(shù)合成、從樹(shù)脂裂開(kāi)并通過(guò)制備的高效液相色譜來(lái)純化。合成肽的組成可通過(guò)例如氨基酸分析、質(zhì)譜或測(cè)序來(lái)確定。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)也可用于產(chǎn)生CTGF和其片段的氨基酸序列變體。當(dāng)少量模板DNA用作起始物質(zhì)時(shí)，與模板DNA相應(yīng)區(qū)域序列稍微不同的一種或幾種引物可生成所需氨基酸變體。PCR擴(kuò)增產(chǎn)生DNA片段產(chǎn)物群，在引物特異位置與編碼CTGF或其片段的多核苷酸模板不同。DNA片段產(chǎn)物取代質(zhì)粒中相應(yīng)區(qū)域且產(chǎn)生所需氨基酸變體。產(chǎn)生氨基酸變體的進(jìn)一步技術(shù)包括Well等，(1985，Gene 34315)描述的盒突變技術(shù)和其它本領(lǐng)域熟知的突變技術(shù)，例如Maniatis，T等，同上和Ausubel，F(xiàn).M等，同上所述技術(shù)。
在發(fā)明的另外實(shí)施方案中，本發(fā)明的CTGF多肽的編碼序列可用本領(lǐng)域熟知化學(xué)方法全部或部分合成。(參見(jiàn)例如Caruthers等，(1980)Nucleic Acids Symp Ser7215-223；Crea和Horn(1980)Nucleic Acids Res 92331；Matteucci和Caruthers(1980)Tetrahedron Letters 21719；Chow和Kempe(1981)NucleicAcids Res 92807-2817)CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的檢測(cè)本發(fā)明提供檢測(cè)和/或測(cè)量樣品中CTGF多肽水平(如CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段)的方法。提供的方法不限于檢測(cè)和測(cè)量人CTGF多肽，但可用于檢測(cè)其它種類(lèi)的CTGF，例如檢測(cè)和測(cè)量非人的哺乳動(dòng)物CTGF。(見(jiàn)圖16)例如，檢測(cè)和測(cè)量CTGF，包括來(lái)自相同和不同種類(lèi)的內(nèi)源CTGF和外源CTGF，可用于CTGF相關(guān)疾病和其它不同疾病的動(dòng)物模型。一方面，提供檢測(cè)生物樣品中CTGF的方法，所述方法包括獲得樣品和檢測(cè)樣品中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段。另一方面，提供測(cè)量生物樣品中CTGF水平的方法，所述方法包括獲得樣品和測(cè)量樣品中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的水平(參見(jiàn)例如圖1C)。
一方面，試驗(yàn)是在檢測(cè)CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的基礎(chǔ)上，使用抗這些多肽的抗體。(參見(jiàn)例如圖1A)試驗(yàn)也包括以核酸為基礎(chǔ)的試驗(yàn)(通常在雜交基礎(chǔ)上)，或任何其它本領(lǐng)域已知的多種分析技術(shù)。在一個(gè)較佳實(shí)施方案中，本方法特征是本發(fā)明多肽(CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段)被多肽特異抗體結(jié)合的能力和產(chǎn)生抗本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合CTGF多肽的能力。本文考慮領(lǐng)域中檢測(cè)CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的其它標(biāo)準(zhǔn)方法。例如，可使用任何與CTGF或CTGF片段結(jié)合或相互作用的試劑，如肝素、CTGF或CTGF片段的受體、或任何其它CTGF結(jié)合劑。
根據(jù)本發(fā)明，多種免疫測(cè)定技術(shù)可用于檢測(cè)和測(cè)量樣品中CTGF和CTGF片段的水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，ELISA測(cè)定用于鑒定和區(qū)分CTGF和不同CTGF片段的水平并比較具體樣品中CTGF和不同CTGF片段的量。在一些實(shí)施方案中，ELISA測(cè)定可用于檢測(cè)、測(cè)量和比較CTGF和CTGF片段的水平，CTGF和CTGF片段發(fā)現(xiàn)于培養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中以及血、血清、血漿、腹膜流出物、尿、玻璃體、滑液、腦脊液、唾液和其它需要檢測(cè)和測(cè)量CTGF和CTGF片段的生物樣品。
在一些方面，改進(jìn)和更敏感的檢測(cè)和測(cè)量CTGF通過(guò)與CTGF C-末端片段或CTGF檢測(cè)相比的CTGF N-末端片段檢測(cè)來(lái)獲得。使用CTGF N-末端片段可檢測(cè)疾病嚴(yán)重性，可更精確的診斷、預(yù)測(cè)和監(jiān)控CTGF相關(guān)疾病的療效。
本發(fā)明提供的方法也用于檢測(cè)和測(cè)量任何CCN多肽家族成員(例如CTGF、CYR61、Nov、Elm1/WISP-1、HICP/rCOP-1、CTGF-3/WISP-2和WISP-3)和其片段，檢測(cè)、診斷、預(yù)測(cè)和監(jiān)控CCN多肽家族成員相關(guān)多種疾病和紊亂的療效。(參見(jiàn)例如Brigstock(1999)Endocrine Reviews 20189-206；Perbal(2001)Mol.Pathol.5457-79)。
抗體在本發(fā)明較佳實(shí)施方案中，檢測(cè)、測(cè)量、診斷、預(yù)測(cè)、監(jiān)控和評(píng)估疾病和紊亂的方法和其與CTGF或其片段表達(dá)或活性增加或減少相關(guān)的治療處理包括使用與CTGF抗原表位或抗原表位特異反應(yīng)的抗體。
用于產(chǎn)生適當(dāng)抗體的多肽可以多種方式生成，例如通過(guò)生成合成肽、酶裂解CTGF(如用胰凝乳蛋白酶處理)、化學(xué)裂解CTGF、重組表達(dá)CTGF或其片段、或從人或其它哺乳動(dòng)物來(lái)源分離。因此，表達(dá)CTGF的細(xì)胞(如MG-63細(xì)胞)、用CTGF編碼序列轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞、純化CTGF、CTGF C-末端片段、CTGF N-末端片段或其抗原表位可用作免疫原引起動(dòng)物宿主中的免疫應(yīng)答已產(chǎn)生所需CTGF區(qū)域的特異抗體。對(duì)于重組生成的多肽，適當(dāng)表達(dá)載體和系統(tǒng)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的且包括真核和原核表達(dá)系統(tǒng)，例如Maniatis等，同上和Ausubel等，同上所述。
可評(píng)估靶多肽例如CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段以確定高免疫原性區(qū)域。分析和抗原表位選擇的方法在本領(lǐng)域熟知。(參見(jiàn)例如Ausubel等，同上)分析和選擇也可通過(guò)例如多種軟件包完成，如LASERGENE NAVIGATOR軟件。(DNASTAR；Madison，WI)用于誘導(dǎo)抗體生成的肽或片段應(yīng)該是抗原性，但不必須是生物活性。優(yōu)選的是，抗原片段或肽至少五個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，更優(yōu)選至少十個(gè)氨基酸長(zhǎng)度，最優(yōu)選至少十五個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。優(yōu)選的是，抗體-誘導(dǎo)片段或肽與至少部分靶多肽的氨基酸序列相同，如CTGF N-末端區(qū)域或結(jié)構(gòu)域或CTGF C-末端區(qū)域或結(jié)構(gòu)域。模擬至少部分天然產(chǎn)生靶多肽序列的肽或片段也可融合其它蛋白質(zhì)，如匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，且可產(chǎn)生抗嵌合分子的抗體。
生成抗體的方法在本領(lǐng)域熟知。例如多種宿主包括山羊、兔、大鼠、小鼠、雞、火雞、人和其它，可通過(guò)注射靶多肽或任何免疫原性片段或其肽來(lái)免疫。取決于宿主種類(lèi)，多種佐劑可用于提高免疫應(yīng)答。這種佐劑包括但不限于弗氏佐劑、無(wú)機(jī)物膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、多聚醇、聚陰離子、肽、油乳膠和KLH。在用于人的佐劑中，尤其優(yōu)選鋁水凝膠、BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Corynebacterium parvum)。
單克隆抗體可用任何通過(guò)連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的技術(shù)來(lái)制備。體內(nèi)和體外生成單克隆或多克隆抗體的技術(shù)在本領(lǐng)域熟知。(參見(jiàn)例如Pound(1998)免疫化學(xué)操作(Immunochemical Protocols)，Human Press，Totowa NJ；Harlow和Lane(1998)抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(AntibodiesA Laboratory Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory，New York；Goding(1986)單克隆抗體原理和實(shí)踐(MonoclonalAntibodiesPrinciples and Practice)，第2版，Academic Press；Schook(1987)單克隆抗體生成技術(shù)和應(yīng)用(Monoclonal Antibodies Production Techniques andApplications)，Marcel Dekker有限公司)如單鏈抗體的生成，嵌合抗體的生成也在本領(lǐng)域熟知。(參見(jiàn)例如，Morrison等，(1984)Proc Natl Acad Sci816851-6855；Neuberger等，(1984)Nature 312604-608；Takeda等，(1985)Nature 314452-454)可產(chǎn)生具相關(guān)特異性但不同個(gè)體基因型組成的抗體，例如通過(guò)隨機(jī)組合免疫球蛋白庫(kù)的鏈改組。(參見(jiàn)例如，Burton(1991)Proc Natl Acad Sci8811120-11123)產(chǎn)生抗體也可通過(guò)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞群中的體內(nèi)生成或通過(guò)篩選高特異性結(jié)合試劑的免疫球蛋白庫(kù)或組。(參見(jiàn)例如，Orlandi等，(1989)Proc Natl Acad Sci863833-3837；Winter和Milstein(1991)Nature 349293-299)也可產(chǎn)生含靶多肽特異性結(jié)合位點(diǎn)的抗體片段。這種抗體片段包括但不限于可通過(guò)胃蛋白酶消化抗體分子產(chǎn)生的F(ab’)2片段、可通過(guò)還原F(ab’)2片段二硫橋產(chǎn)生的Fab片段。另外，可構(gòu)建Fab表達(dá)庫(kù)以迅速和容易鑒定具所需特異性的單克隆Fab片段。(參見(jiàn)例如，Huse等，(1989)Science 2541275-1281)另外，能產(chǎn)生抗體的人體細(xì)胞適于和骨髓瘤細(xì)胞系融合，具體是B淋巴細(xì)胞?？墒褂玫腂淋巴細(xì)胞來(lái)自外周血或來(lái)自活組織切片檢查的脾、扁桃腺、或個(gè)體淋巴結(jié)。此外，人B細(xì)胞可直接用埃-巴二氏病毒無(wú)限增殖化。(Cole等，(1995)單克隆抗體和癌癥治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss有限公司，77-96頁(yè))適用于產(chǎn)生雜交瘤融合過(guò)程的骨髓瘤細(xì)胞系優(yōu)選是不生成抗體，具有高融合效率且酶缺陷使它們不能在支持所需雜交瘤生長(zhǎng)的特定選擇性培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。可用于生成本發(fā)明融合細(xì)胞系的骨髓瘤細(xì)胞系例子包括獲自小鼠的P3X63Ag8、P3X63Ag8-653、NS1/1.Ag 4.1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7、S194/5XXO Bul；獲自人的U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2、UC729-6(參見(jiàn)例如，Goding同上，65-66頁(yè)；Campbell(1984)單克隆抗體技術(shù)實(shí)驗(yàn)室生化和分子生物技術(shù)(Monoc lonal Antibodies TechnologyLaboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology)，第13卷(Bruden和Von Knippenberg編)，Elsevier，Amsterdam，75-83頁(yè))在本發(fā)明中，也可使用針對(duì)CTGF或其片段的“人”或“人源化”抗體。人源化抗體是有與親代抗體相同或類(lèi)似結(jié)合特異性(如小鼠來(lái)源)和增加人特征的抗體或抗體片段。人源化抗體可以通過(guò)例如鏈改組或用噬菌體展示技術(shù)來(lái)獲得。例如，抗體包括CTGF或其片段特異非人抗體的重或輕鏈可變區(qū)，此抗體結(jié)合人互補(bǔ)(輕或重)鏈可變區(qū)所有組成。選擇感興趣抗原特異的雜合配對(duì)。隨后來(lái)自選擇配對(duì)的人鏈可結(jié)合人互補(bǔ)可變區(qū)(重或輕)且可選擇人抗體多肽二聚體用于抗原的結(jié)合特異性。所述用于產(chǎn)生本發(fā)明方法中所用人源化抗體的技術(shù)揭示于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,565,332；5,585,089；5,649,761和5,693,762。此外，所述用于生成轉(zhuǎn)基因小鼠中人抗體的技術(shù)描述于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,545,806和5,569,825。
如本文所述生成的抗體可用于鑒定CTGF或其片段，如在血液、血漿、尿、玻璃體、滑液、腦脊液、唾液、來(lái)自具體組織的活組織切片檢查等，或其它生物樣品、細(xì)胞培養(yǎng)樣品或試驗(yàn)樣品中。存在的特定多肽的量可通過(guò)如測(cè)量顯象分析確定。另外，可確定靶多肽的mRNA，如通過(guò)使用生物樣品的反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。具體是，在此方法中mRNA可反轉(zhuǎn)錄成DNA并隨后用特異引物序列通過(guò)PCR擴(kuò)增，mRNA來(lái)自如總組織樣品或編碼靶多肽或其片段的樣品?？蓽y(cè)量確定mRNA，例如通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，使用等體積患者樣品和一系列如模擬或突變cDNA片段的已知減少濃度。
CTGF試驗(yàn)檢測(cè)CTGF多肽的優(yōu)選試驗(yàn)用單克隆或多克隆抗體進(jìn)行，CTGF多肽具體是CTGF、CTGF多肽N-末端片段或CTGF多肽C-末端片段?？墒褂枚喾N試驗(yàn)以檢測(cè)特異性結(jié)合來(lái)自樣品的所需蛋白質(zhì)的抗體或檢測(cè)結(jié)合一種或更多來(lái)自樣品抗體的所需蛋白質(zhì)。示范試驗(yàn)詳述于Harlow和Lane同上；Burtis和Ashwood(1999)Tietz臨床化學(xué)教程(Tietz Textbook of Clinical Chemistry)，第3版，W.B.Saunders，Phiadelphia；Kaplan，Pesce和Kazmierczak(1996)臨床化學(xué)理論、分析、相關(guān)(Clinical ChemistryTheory，Analysis，Correlation)，第3版，Mosby，St.Louis。這種試驗(yàn)的代表例子包括逆氣流免疫電泳(CLEP)試驗(yàn)、放射性免疫測(cè)定、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、斑點(diǎn)印跡試驗(yàn)、抑制或競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)、夾層試驗(yàn)、免疫粘附(量油計(jì))測(cè)定、同時(shí)測(cè)定、免疫層析測(cè)定、免疫過(guò)濾測(cè)定、乳珠粘附測(cè)定、免疫熒光測(cè)定、生物傳感器測(cè)定和低光檢測(cè)試驗(yàn)(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,376,110、4,486,530；也參見(jiàn)Goding同上)熒光抗體試驗(yàn)(FA-試驗(yàn))使用能結(jié)合一種蛋白質(zhì)的熒光標(biāo)記抗體(如針對(duì)CTGFN-末端區(qū)域的抗體)。檢測(cè)可用熒光顯微鏡和目測(cè)完成，產(chǎn)生定性結(jié)果。在一個(gè)實(shí)施方案中，此試驗(yàn)用于檢測(cè)組織樣品或組織分泌。
在乳珠粘附測(cè)定中，抗體結(jié)合乳珠。隨后結(jié)合乳珠的抗體在允許抗體結(jié)合樣品中所需蛋白質(zhì)的條件下與樣品接觸?？纱_定定性或測(cè)量結(jié)果。
酶免疫吸附測(cè)定(EIA)包括一些能使用抗體和檢測(cè)CTGF的不同測(cè)定。例如，異源間接EIA使用的固相偶聯(lián)CTGF抗體和親和純化的抗IgG免疫球蛋白制備。固相優(yōu)選是聚苯乙烯微量滴定板。抗體和免疫球蛋白制備隨后在允許抗體結(jié)合的條件下接觸樣品，此條件在本領(lǐng)域熟知。這種測(cè)定的結(jié)果可目測(cè)，但優(yōu)選用分光光度計(jì)確定以產(chǎn)生測(cè)量結(jié)果，如ELISA板讀數(shù)器。另外的固相EIA模式包括塑料包被的黑色金屬珠，在測(cè)定過(guò)程中能用磁鐵移動(dòng)。而另一種是低光檢測(cè)免疫測(cè)定模式。在此高敏感模式中，自動(dòng)測(cè)量合適標(biāo)記的結(jié)合抗體產(chǎn)生的光發(fā)射。優(yōu)選的是，反應(yīng)用微量滴定板進(jìn)行。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，放射性追蹤物代替EIA中酶調(diào)節(jié)的檢測(cè)以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生免疫測(cè)定(RIA)。
也可進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，ELISA包括下列步驟(1)在固相上包被本發(fā)明的CTGF多肽(如CTGF N-末端片段、CTGF C-末端片段)；(2)用固相上包被的多肽在可形成抗原-抗體復(fù)合物的條件下培養(yǎng)預(yù)計(jì)含CTGF抗體的樣品；(3)加入結(jié)合標(biāo)記的抗抗體(如抗IgG)以被所得結(jié)合固相的抗原-抗體復(fù)合物捕獲；(4)測(cè)量捕獲的標(biāo)記并由此確定樣品是否有CTGF抗體。
在捕獲-抗體夾層酶試驗(yàn)中，所需蛋白質(zhì)在附于固相的抗體和標(biāo)記抗體間結(jié)合，固相優(yōu)選聚苯乙烯微量滴定板。優(yōu)選的是，結(jié)果用分光光度計(jì)測(cè)量，如ELISA板讀數(shù)器。在連續(xù)試驗(yàn)?zāi)Ｊ街?，試劑可以分步方式用捕獲抗體培養(yǎng)。測(cè)試樣品首先用捕獲抗體培養(yǎng)。洗脫步驟后，用標(biāo)記抗體培養(yǎng)。在同步試驗(yàn)中，結(jié)合連續(xù)試驗(yàn)中所述的兩個(gè)培養(yǎng)段。這除去了一個(gè)培養(yǎng)期和一個(gè)洗脫步驟。
量油計(jì)/免疫粘附模式本質(zhì)上是免疫測(cè)定，除了固相是聚苯乙烯槳或量油計(jì)而不是聚苯乙烯微量滴定板。試劑相同且模式可以是同時(shí)或連續(xù)。
在層析帶試驗(yàn)?zāi)Ｊ街?，捕獲抗體和標(biāo)記抗體在層析帶上干燥，層析帶通常是結(jié)合醋酸纖維素的多孔性硝化纖維或尼龍。捕獲抗體常噴射干燥為帶一個(gè)末端的線(xiàn)。在此末端，有接觸帶的吸收物質(zhì)。在帶的另一個(gè)末端，標(biāo)記抗體以防止其被吸收入膜的方式沉積。通常，附于抗體的標(biāo)記是乳珠或膠態(tài)金。試驗(yàn)可開(kāi)始于直接在標(biāo)記抗體前應(yīng)用樣品。
免疫過(guò)濾/免疫濃縮模式結(jié)合大固相表面和樣品/試劑的定向流，集中和加速抗原結(jié)合抗體。在優(yōu)選模式中，測(cè)試樣品用標(biāo)記抗體預(yù)培養(yǎng)，隨后應(yīng)用于固相如纖維過(guò)濾器或硝化纖維膜等。固相也可用包被捕獲抗體的乳或玻璃珠預(yù)包被。分析物檢測(cè)與標(biāo)準(zhǔn)免疫測(cè)定相同。樣品/試劑流可通過(guò)真空或下面吸收物質(zhì)的毛細(xì)作用來(lái)調(diào)節(jié)。
開(kāi)始的生物傳感器測(cè)定是敏感的測(cè)量試驗(yàn)，能以低成本篩選大量樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，這種測(cè)定包括使用光可及的電勢(shì)傳感器，其中反應(yīng)包括檢測(cè)pH變化，pH變化由所需蛋白質(zhì)被捕獲抗體結(jié)合、跨抗體和尿素酶-結(jié)合的抗體引起。結(jié)合時(shí)，pH變化通過(guò)轉(zhuǎn)化成電位來(lái)測(cè)量。測(cè)定通常在很小的反應(yīng)體積中發(fā)生，且很敏感。此外，報(bào)導(dǎo)的測(cè)試檢測(cè)限制可以是1000個(gè)尿素酶分子每分鐘。
診斷、預(yù)測(cè)、預(yù)防和治療的方法本發(fā)明提供了診斷、預(yù)測(cè)和監(jiān)控治療處理和功效的方法，這是在檢測(cè)和/或測(cè)量CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的水平基礎(chǔ)上。在一些情況中，CTGFN-末端片段比CTGF或CTGF C-末端片段更穩(wěn)定，在一些情況中可用于更敏感和精確的檢測(cè)和測(cè)量樣品中CTGF和CTGF片段水平。
一方面，本發(fā)明提供了診斷CTGF相關(guān)疾病的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，診斷CTGF相關(guān)疾病的方法包括獲得樣品及檢測(cè)和測(cè)量樣品中CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平；比較樣品中CTGF或任何CTGF片段的水平和標(biāo)準(zhǔn)量CTGF或CTGF片段的水平，其中樣品中CTGF或任何CTGF片段量增加或減少指示CTGF相關(guān)疾病的存在。與CTGF或CTGF片段水平異常(如增加或減少)相關(guān)疾病包括但不限于增殖性疾病和與胞外基質(zhì)相聯(lián)蛋白質(zhì)表達(dá)改變和沉積相關(guān)疾病。這種疾病包括例如，癌癥如乳腺、前列腺、卵巢、結(jié)腸直腸、胰腺和胃腸癌；動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、視網(wǎng)膜病如糖尿病視網(wǎng)膜?。荒I病如糖尿病腎??；心臟、肺、肝和腎纖維化以及慢性炎癥和/或感染相關(guān)疾病。CTGF相關(guān)疾病也與一些情況相聯(lián)，如心肌梗塞、糖尿病、腹膜透析、慢性和急性移植排斥、化療、放療和手術(shù)。其它CTGF相關(guān)疾病描述同上。
還提供了鑒定個(gè)體是否傾向于發(fā)展CTGF相關(guān)疾病的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定CTGF相關(guān)疾病傾向性的方法包括獲得樣品及檢測(cè)和測(cè)量樣品中CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平；比較樣品中CTGF或任何CTGF片段的水平和標(biāo)準(zhǔn)量CTGF或CTGF片段的水平，其中樣品中CTGF或任何CTGF片段量增加或減少指示CTGF相關(guān)疾病的存在。
另一方面，本發(fā)明提供了監(jiān)控CTGF相關(guān)疾病進(jìn)展的方法，所述方法包括獲得樣品；檢測(cè)和測(cè)量樣品中CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平；比較樣品中CTGF或CTGF片段的水平和CTGF或CTGF片段的標(biāo)準(zhǔn)量，或者與獲自相同個(gè)體或來(lái)源樣品中CTGF或CTGF片段在較早或前面時(shí)間或疾病發(fā)展較早期的第一個(gè)水平相比，其中樣品中CTGF或CTGF片段的水平和標(biāo)準(zhǔn)或第一個(gè)水平間的差異指示CTGF相關(guān)疾病的進(jìn)展。
又一方面，本發(fā)明提供了確定CTGF相關(guān)疾病進(jìn)程的預(yù)測(cè)，所述方法包括獲得樣品；檢測(cè)和測(cè)量樣品中CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平；比較樣品中CTGF或CTGF片段的水平和前面時(shí)間或疾病發(fā)展較早期從個(gè)體獲得樣品的測(cè)量值，其中樣品在一個(gè)時(shí)間中CTGF或CTGF片段水平和另一個(gè)時(shí)間取的CTGF或CTGF片段水平間的差異指示CTGF相關(guān)疾病的預(yù)測(cè)。
另外一方面，本發(fā)明提供了監(jiān)控CTGF相關(guān)疾病治療療效的方法，所述方法包括從患CTGF相關(guān)疾病和接受此病治療的受試者中獲得樣品；檢測(cè)和測(cè)量樣品中CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平；比較樣品中CTGF或CTGF片段的水平和CTGF或CTGF片段的標(biāo)準(zhǔn)水平，其中樣品中CTGF或CTGF片段的水平和標(biāo)準(zhǔn)水平間的差異指示CTGF相關(guān)疾病療法的療效。
另一方面，本發(fā)明提供了監(jiān)控CTGF相關(guān)疾病治療療效的方法，所述方法包括獲得樣品；檢測(cè)和測(cè)量樣品中CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的水平；比較樣品中CTGF或CTGF片段的水平和前面時(shí)間取自個(gè)體的樣品或連續(xù)時(shí)間獲得的一個(gè)或幾個(gè)樣品或疾病發(fā)展較早期的水平，樣品在一個(gè)時(shí)間中CTGF或CTGF片段水平和另一個(gè)時(shí)間取的CTGF或CTGF片段水平間的差異指示CTGF相關(guān)疾病療法的療效。
又一方面，提供了鑒定與CTGF或CTGF片段水平增加相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括從患具體疾病的受試者中獲得第一個(gè)樣品；從沒(méi)有具體疾病的受試者中獲得第二個(gè)樣品；檢測(cè)和測(cè)量第一個(gè)樣品中CTGF或CTGF片段的水平；檢測(cè)和測(cè)量第二個(gè)樣品中CTGF或CTGF片段的水平；比較第一個(gè)樣品中CTGF或CTGF片段的水平和第二個(gè)樣品中CTGF或CTGF片段的水平，其中第一個(gè)樣品中CTGF或CTGF片段水平增加指示與CTGF水平和活性增加相關(guān)疾病。
另一方面，提供了鑒定與CTGF或CTGF片段水平增減少相關(guān)的疾病的方法，所述方法包括從患具體疾病的受試者中獲得第一個(gè)樣品；從沒(méi)有具體疾病的受試者中獲得第二個(gè)樣品；檢測(cè)和測(cè)量第二個(gè)樣品中CTGF或CTGF片段的水平；比較第一個(gè)樣品中CTGF或CTGF片段的水平和第二個(gè)樣品中CTGF或CTGF片段的水平，其中第一個(gè)樣品中CTGF或CTGF片段水平減少指示與CTGF水平和活性降低相關(guān)疾病。
化合物篩選和鑒定本發(fā)明進(jìn)一步提供了篩選和鑒定可減少或增加CTGF或CTGF片段的表達(dá)、水平或活性(如CTGF N-末端片段等)的化合物的方法。
一方面，提供了篩選可增加CTGF片段的表達(dá)、水平或活性(如CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段等)的化合物的方法，所述方法包括獲得樣品；使樣品接觸化合物；檢測(cè)和測(cè)量樣品中CTGF或CTGF片段的表達(dá)、水平或活性，其中CTGF片段表達(dá)、水平或活性增加指示的化合物具有提高CTGF片段表達(dá)、水平或活性的性質(zhì)。
另一方面，提供了篩選可減少CTGF片段的表達(dá)、水平或活性(如CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段)的化合物的方法，所述方法包括獲得樣品；使樣品接觸化合物；檢測(cè)和測(cè)量樣品中CTGF或CTGF片段的表達(dá)、水平或活性，其中CTGF片段表達(dá)、水平或活性減少指示的化合物具有降低CTGF片段表達(dá)、水平或活性的性質(zhì)。
可用多種本領(lǐng)域已知的篩選技術(shù)之一來(lái)鑒定化合物。這些篩選方法可使CTGF多肽或化合物在溶液中游離、附于固體支持物、攜帶在細(xì)胞表面上、與胞外基質(zhì)相聯(lián)或位于胞內(nèi)。例如，攜帶測(cè)試化合物的微陣列可用本領(lǐng)域有用方法制備、使用和分析。(參見(jiàn)例如，Shalon等，(1995)PCT申請(qǐng)?zhí)朩O95/35505；Baldeschweiler等，(1995)PCT申請(qǐng)?zhí)朩O95/251116；Brennan等，(1995)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,474,796；Heller等，(1997)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,605,662)多種測(cè)定和篩選技術(shù)可用于鑒定小分子，小分子調(diào)節(jié)(如增加或減少)CTGF或CTGF片段(如CTGF N-末端片段、CTGF C-末端片段等)的表達(dá)、水平或活性。這些方法也可用于鑒定與CTGF或CTGF片段表達(dá)、水平或活性相互作用或影響的抗體和其它化合物，因此可用作本方法中的藥物和治療(參見(jiàn)例如Enna等，(1998)藥理學(xué)現(xiàn)狀(Current Protocols in Pharmacology)，John Wiley和Sons)測(cè)定通常提供可檢測(cè)信號(hào)，信號(hào)與化合物結(jié)合蛋白質(zhì)或細(xì)胞靶相關(guān)。結(jié)合可通過(guò)例如熒光團(tuán)、酶綴合物和其它本領(lǐng)域熟知的可檢測(cè)標(biāo)記來(lái)檢測(cè)。結(jié)果可以是定性或測(cè)量。
在本文所述任何方法中，樣品可獲自培養(yǎng)細(xì)胞，或來(lái)自哺乳動(dòng)物，優(yōu)選來(lái)自人。樣品可獲自例如培養(yǎng)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基，或來(lái)自血、尿、血清、血漿、玻璃體、滑液、腦脊液、唾液、羊水，或獲自組織活組織切片檢查。任何一種本領(lǐng)域已知多種方法可用于檢測(cè)和測(cè)量CTGF或片段的水平。這種方法包括但不限于例如使用針對(duì)CTGF N-末端或C-末端片段的抗體；分離CTGF N-末端或C-末端片段(如用質(zhì)譜、液相質(zhì)譜、聚丙烯酰胺膠電泳、蛋白質(zhì)印跡分析或其它常規(guī)化學(xué)分析等)；或任何其它本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和過(guò)程。在一些方面，所述方法包括檢測(cè)CTGF內(nèi)的CTGF N-末端區(qū)域/結(jié)構(gòu)域或CTGF C-末端區(qū)域/結(jié)構(gòu)域。另一方面，所述方法包括測(cè)量CTGF N-末端片段水平，此片段被分離(如裂開(kāi))且不同于CTGF C-末端區(qū)域或CTGF，或者測(cè)量CTGF C-末端片段水平，此片段被分離(如裂開(kāi))且不同于CTGFN-末端區(qū)域或CTGF。
這些和其它本發(fā)明實(shí)施方案通過(guò)本文說(shuō)明為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員掌握。
實(shí)施例可通過(guò)下列實(shí)施例進(jìn)一步理解本發(fā)明，這些實(shí)施例僅僅是為了例證本發(fā)明。提供這些實(shí)施例僅用于闡述權(quán)利要求的發(fā)明。本發(fā)明范圍不受示范實(shí)施方案限制，實(shí)施方案僅用于闡述發(fā)明的單方面。任何功能相當(dāng)?shù)姆椒ㄔ诎l(fā)明范圍內(nèi)。除了本文所述的多種發(fā)明修改根據(jù)前述和附圖對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然的。這些修改在附加權(quán)利要求范圍內(nèi)。
實(shí)施例1重組人CTGF的制備重組人CTGF(rhCTGF)制備如下。全長(zhǎng)的人CTGF cDNA(DB60R32)獲自GaryGrotendorst博士(邁阿密醫(yī)學(xué)院(University of Miami Medical School))。(Bradham等，(1991)J Cell Biol 1141285-1294)僅包括可讀框的CTGF cDNA通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用DB60R32 DNA作為模板和下列引物(5’-gctccgcccgcagtgggatccatgaccgccgcc-3’(SEQ ID NO3)和5’-ggatccggatcc.tcatgccatgtctccgta-3’(SEQ ID NO4)來(lái)產(chǎn)生，在擴(kuò)增產(chǎn)物任一末端加入BamHI限制性酶切位點(diǎn)(下劃線(xiàn))。所得擴(kuò)增DNA片段用BamHI消化，在瓊脂糖膠上純化，直接亞克隆到桿狀病毒(供體)表達(dá)質(zhì)粒pFastBac1(Invitrogen，Carlsbad CA)的BamHI位點(diǎn)。pFastBac1/CTGF cDNA載體構(gòu)建轉(zhuǎn)位到桿粒DNA且重組桿狀病毒由下列概括在BAC-TO-BA桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)手冊(cè)(Invitrogen)中的廠(chǎng)商操作產(chǎn)生。Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞中重組桿狀病毒滴度擴(kuò)增用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程進(jìn)行。(Murphy和Piwnica-Worms，(1984)分子生物現(xiàn)狀(Current Protocols inMolecular Biology)，第2卷(Ausubel等編)John Wiley&Sons有限公司)rhCTGF的表達(dá)和制備如下進(jìn)行。適于懸浮生長(zhǎng)的HIGH FIVE昆蟲(chóng)細(xì)胞在SF900II培養(yǎng)基(Invitrogen)中生長(zhǎng)到1.0×106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。細(xì)胞隨后用含CTGF的桿狀病毒以感染復(fù)數(shù)10∶1感染。感染后，細(xì)胞27℃培養(yǎng)40小時(shí)。細(xì)胞隨后用離心沉淀，收集含CTGF的條件培養(yǎng)基并通過(guò)0.22μm濾器過(guò)濾。然后條件培養(yǎng)基直接應(yīng)用于5ml Hi-Trap肝素柱(Amersham Biosciences公司，Piscataway NJ)，柱用50mM Tris，pH7.2預(yù)平衡。接著肝素柱用100ml 350mMNaCl/50mM Tris，pH7.2洗，結(jié)合的CTGF用350mM NaCl到1200mM NaCl的線(xiàn)性梯度超過(guò)15個(gè)柱體積洗脫。各部分通過(guò)SDS-PAGE分析CTGF的存在。
收集含CTGF的部分并用50mM Tris，pH7.5 1∶4稀釋。CTGF收集物加入羧甲基(CM)離子交換柱(POROS CM柱，PerSeptive生物系統(tǒng)，F(xiàn)ramingham，MA)，柱用10個(gè)柱體積的50mM Tris，pH7.5預(yù)平衡。CM柱用350mM NaCl/50mM Tris，pH7.5洗，結(jié)合的CTGF用350mM NaCl到1200mM NaCl的線(xiàn)性梯度超過(guò)15個(gè)柱體積洗脫。各部分通過(guò)SDS-PAGE分析CTGF的存在。收集含CTGF的部分并用作CTGF材料。
實(shí)施例2CTGF N-末端和C-末端片段的制備CTGF N-末端和C-末端片段如下制備。重組人CTGF如上所述制備和純化，用胰凝乳蛋白酶珠(Sigma Chemical Co.，St.Louis MO)處理消化，每單位胰凝乳蛋白酶用1.5mg CTGF。胰凝乳蛋白酶處理rhCTGF可室溫進(jìn)行6小時(shí)。離心消化產(chǎn)物和胰凝乳蛋白酶珠，棄去胰凝乳蛋白酶珠，含酶裂解rhCTGF的上清用50mM Tris，pH7.5 1∶5稀釋。稀釋的上清應(yīng)用于Hi-Trap肝素柱。收集通過(guò)流且包含CTGF N-末端片段。肝素柱用350mM NaCl洗，結(jié)合的CTGF C-末端片段和未消化CTGF如上所述用350mM到1200mM NaCl的線(xiàn)性梯度洗脫。各部分通過(guò)SDS-PAGE分析CTGF C-末端片段的存在。含CTGF C-末端片段的部分根據(jù)觀(guān)測(cè)CTGF C-末端純度來(lái)收集。
含CTGF N-末端片段的肝素柱通過(guò)流調(diào)節(jié)至含0.5M硫酸銨/50mM Tris，pH7.5。含CTGF N-末端片段的樣品隨后加到15ml苯基瓊脂糖HP柱(Amersham PharmaciaBiotech)，柱用0.5M硫酸銨/50mM Tris，pH7.5預(yù)平衡。然后苯基瓊脂糖HP柱用15個(gè)柱體積的0.5M硫酸銨/50mM Tris，pH7.5洗。結(jié)合的CTGF N-末端片段用0.5M到OM硫酸銨/50mM Tris，pH7.5的線(xiàn)性梯度超過(guò)約15個(gè)柱體積洗脫。各部分通過(guò)SDS-PAGE分析CTGF N-末端片段的存在。收集含CTGF N-末端片段的部分。使用Amicon超濾YM10膜濃縮此含CTGF N-末端片段的收集物，緩沖液與50mM Tris、400mM NaCl，pH7.2交換。
實(shí)施例3抗CTGF和CTGF片段抗體的制備制備抗純化rhCTGF的單克隆和多克隆抗體。重組人CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段如上所述制備和純化。特異于人CTGF或CTGF片段的單克隆和多克隆抗體用標(biāo)準(zhǔn)方法制成。(參見(jiàn)例如Goding同上；Schook同上)人CTGF的單克隆抗體一般如下制備。健康成年小鼠用50到100μg CTGF、CTGFN-末端片段或CTGF C-末端片段皮下免疫。6到10周后，小鼠用不完全弗氏佐劑中制成的另外抗原強(qiáng)化。各強(qiáng)化注射后一周，通過(guò)ELISA分析確定來(lái)評(píng)估免疫小鼠血清中CTGF抗體的存在。選擇產(chǎn)生最強(qiáng)CTGF或其片段抗體反應(yīng)(即最高滴度)的小鼠用于制備雜交瘤。來(lái)自這些小鼠的分離脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，例如P3X63Ag8-653，使用下列本領(lǐng)域熟知的過(guò)程。產(chǎn)生與CTGF反應(yīng)的抗體的雜交瘤由ELISA鑒定并隨后通過(guò)限制稀釋至少兩次來(lái)克隆。
另外，人CTGF的人單克隆抗體用下列方法制成。HUMAB小鼠同齡組(Medarex有限公司，Princeton NJ)用不同CTGF免疫原免疫，包括a)桿狀病毒制備的純化rhCTGF，b)CTGF N-和C-末端半片段通過(guò)胰凝乳蛋白酶裂解全rhCTGF產(chǎn)生和c)多種合成CTGF肽。HUMAB小鼠(Medarex)是遺傳工程轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)產(chǎn)生全人抗體響應(yīng)免疫原。篩選產(chǎn)生自25個(gè)脾融合的雜交瘤并確定約140個(gè)克隆選擇的單克隆抗體-制備細(xì)胞系。各抗體群的親和性用RIA測(cè)量，其中全rhCTGF被放射性碘標(biāo)記并加入孔，孔含固定的單克隆抗體和不同量的未標(biāo)記CTGF。
實(shí)施例4抗體特征如實(shí)施例3所述制備生成人CTGF的雜交瘤。克隆的雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)于Dulbecco’s Modified Eagle培養(yǎng)基-高葡萄糖/RPMI 1640(50∶50)與8mM L-谷氨酸、1/2x非必須氨基酸和10％胎牛血清。擴(kuò)增用于抗體制備的細(xì)胞在有1.5％低IgG胎牛血清的相同培養(yǎng)基中37℃6％CO2生長(zhǎng)4-9天。所得條件培養(yǎng)基清除細(xì)胞并用切向流過(guò)濾/濃縮系統(tǒng)濃縮。濃縮物通過(guò)蛋白質(zhì)-A柱且結(jié)合的單克隆抗體用100mM甘氨酸，pH3洗脫。洗脫液用1M Tris，pH8.0中和，相對(duì)PBS透析。
各所得單克隆抗體用標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合和阻斷實(shí)驗(yàn)作圖并分配到其結(jié)合的特異CTGF區(qū)域。(Harlow和Lane同上；Burtis和Ashwood同上；Kaplan、Pesce和Kazmierczak同上，第10章(免疫化學(xué)技術(shù))和11章(競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn))例如，相同結(jié)構(gòu)域的抗體或抗原表位特異性會(huì)阻斷任何其它相同結(jié)構(gòu)域抗體結(jié)合或抗原表位特異性，具體是以連續(xù)方式加入。結(jié)合單克隆抗體的CTGF上抗原表位的更精確作圖用重組表達(dá)CTGF的具體片段通過(guò)ELISA分析進(jìn)行。例如，識(shí)別CTGF N-末端結(jié)構(gòu)域或區(qū)域的單克隆抗體用ELISA分析鑒定，ELISA分析抗固定的重組表達(dá)CTGF外顯子2。單克隆抗體作圖成重組表達(dá)的CTGF結(jié)構(gòu)域，如CTGF多核苷酸序列外顯子2、外顯子3、外顯子4或外顯子5編碼的結(jié)構(gòu)域。
以此方式選擇和確定抗體，抗體特異識(shí)別CTGF N-末端結(jié)構(gòu)域或N-末端片段(如N1，對(duì)第一個(gè)N-末端片段抗原表位或幾個(gè)抗原表位有特異性；N2，對(duì)第二個(gè)N-末端片段抗原表位或幾個(gè)抗原表位有特異性)或CTGF C-末端結(jié)構(gòu)域或C-末端片段(如C-末端片段抗原表位C1、C2、C4、C5或CK)。(參見(jiàn)例如圖1A和1B)實(shí)施例5CTGF和CTGF片段測(cè)定發(fā)展免疫測(cè)定以檢測(cè)和精確測(cè)量CTGF多肽。具體發(fā)展方法以檢測(cè)和測(cè)量CTGF(稱(chēng)為N-C試驗(yàn))、CTGF N-末端片段(稱(chēng)為N-N試驗(yàn))和CTGF C-末端片段(稱(chēng)為C-C試驗(yàn))。圖1C闡述了不同的夾層試驗(yàn)?zāi)Ｊ健?br> CTGF用一個(gè)識(shí)別CTGF N-末端結(jié)構(gòu)域(如上述N1和N2并示于圖1A)的抗體和第二個(gè)識(shí)別CTGF C-末端結(jié)構(gòu)域(如上述C1-C5并示于圖1A)的抗體檢測(cè)和測(cè)量完整CTGF。此試驗(yàn)稱(chēng)為N-C試驗(yàn)(圖1C)。N-末端結(jié)構(gòu)域特異抗體(結(jié)合N2的單克隆抗體(mAb)19)用于捕獲CTGF，而C-末端結(jié)構(gòu)域特異抗體(結(jié)合C4的mAb25)用于檢測(cè)捕獲的CTGF多肽。另外，識(shí)別CTGF C-末端結(jié)構(gòu)域的抗體或任選連接載體的肝素如BSA可用于捕獲CTGF，識(shí)別CTGF N-末端結(jié)構(gòu)域的抗體可用于檢測(cè)捕獲的CTGF多肽。以任一方法使用兩種試劑可檢測(cè)CTGF但不能檢測(cè)CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段，兩種試劑是識(shí)別CTGF N-末端結(jié)構(gòu)域的試劑和另一個(gè)識(shí)別CTGF C-末端結(jié)構(gòu)域的試劑(圖2)。
CTGF N-末端片段用兩個(gè)識(shí)別CTGF N-末端結(jié)構(gòu)域的抗體來(lái)檢測(cè)和測(cè)量CTGF N-末端片段(如上述N1和N2并示于圖1A)。此試驗(yàn)稱(chēng)為N-N試驗(yàn)(圖1C)。N-末端結(jié)構(gòu)域特異抗體之一作為捕獲抗體(如結(jié)合N2的mAb19)，另一個(gè)作為檢測(cè)抗體(如結(jié)合N1的mAb6)。由于CTGF含抗體識(shí)別的CTGF N-末端結(jié)構(gòu)域，CTGF也用N-N試驗(yàn)檢測(cè)。
為確定樣品中CTGF N-末端片段量，確定樣品中CTGF水平(用N-C試驗(yàn)，同上)，確定樣品中CTGF N-末端片段水平(用N-N試驗(yàn))。隨后確定的CTGF量減去確定的N-末端片段量，產(chǎn)生樣品中存在的CTGF N-末端片段水平。除非另有說(shuō)明，用N-N試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)檢測(cè)和測(cè)量CTGF和CTGF N-末端片段水平(圖3)，調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)顯示各樣品中CTGF N-末端片段的具體水平(即樣品中CTGF水平減去此樣品用N-N試驗(yàn)獲得的值)。另外，樣品可在進(jìn)行N-N試驗(yàn)前用肝素親和柱清除CTGF。
CTGF C-末端片段用兩個(gè)識(shí)別CTGF C-末端結(jié)構(gòu)域的抗體來(lái)檢測(cè)和測(cè)量CTGF C-末端片段(如上述C1和C4并示于圖1A)。此試驗(yàn)稱(chēng)為C-C試驗(yàn)(圖1C)。C-末端結(jié)構(gòu)域特異抗體之一作為捕獲抗體(如結(jié)合C4的mAb51)，另一個(gè)作為檢測(cè)抗體(如結(jié)合C1的mAb51)。另外，連接載體的肝素如BSA可用于捕獲CTGF C-末端結(jié)構(gòu)域。由于CTGF含CTGFC-末端結(jié)構(gòu)域，CTGF也用此試驗(yàn)檢測(cè)。
為確定樣品中CTGF C-末端片段量，因此確定樣品中CTGF水平(用N-C試驗(yàn)，同上)，確定樣品中CTGF C-末端片段水平(用C-C試驗(yàn))。隨后確定的CTGF量減去確定的C-末端片段量，產(chǎn)生樣品中存在的C-末端片段水平。除非另有說(shuō)明，用C-C試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)檢測(cè)和測(cè)量CTGF和CTGF C-末端片段水平(圖4)，調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)顯示各樣品中CTGF C-末端片段的具體水平(即樣品中CTGF水平減去此樣品用C-C試驗(yàn)獲得的值)。另外，樣品可在進(jìn)行C-C試驗(yàn)前用N-末端片段特異試劑N清除CTGF。
確定樣品中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段水平的量是通過(guò)將各所述ELISA測(cè)定(即檢測(cè)CTGF的N-C試驗(yàn)；檢測(cè)CTGF加CTGF N-末端片段的N-N試驗(yàn)；檢測(cè)CTGF加CTGF C-末端片段的C-C試驗(yàn))獲得的吸光度值外推到已知濃度CTGF標(biāo)準(zhǔn)獲得的值。數(shù)據(jù)用二次非線(xiàn)性回歸(SOFTMAX PRO軟件，MolecularDevices，Sunnyvale，CA)分析，提供最優(yōu)方程式描述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和在摩爾基礎(chǔ)上使吸光度涉及CTGF濃度。
實(shí)施例6CTGF和CTGF片段的檢測(cè)和測(cè)量低蛋白質(zhì)含量的樣品進(jìn)行CTGF測(cè)定的過(guò)程描述于上面的實(shí)施例5?？蓪?duì)這些方法進(jìn)行修改用于檢測(cè)和測(cè)量不同樣品或樣品種類(lèi)中CTGF和CTGF片段。例如，為檢測(cè)和測(cè)量人低蛋白質(zhì)含量樣品中CTGF和CTGF片段(如尿、滑液、腹膜透析液、CSF液、唾液、細(xì)胞培養(yǎng)基)，發(fā)展了用抗人CTGF單克隆抗體的夾層ELISA。CTGF測(cè)定建立如下。微量滴定板的孔首先用識(shí)別CTGF區(qū)域或結(jié)構(gòu)域的捕獲抗體包被。為用于ELISA，捕獲抗體在50mM碳酸氫鈉，pH8.5中稀釋到10μg/ml的終濃度，50微滴的稀釋捕獲抗體溶液加入96孔MAXISORB微量滴定板(Nalge Nunc International，Rochester NY)各孔。板隨后被覆蓋并在2到8℃保存過(guò)夜以使抗體結(jié)合板。捕獲抗體溶液從板中除去，然后各孔的未結(jié)合位點(diǎn)用150μl封閉緩沖液封閉，緩沖液含1％無(wú)鈣無(wú)鎂PBS中的BSA，有0.05％疊氮化鈉。板隨后被覆蓋并在2到8℃保存1到14天。用于CTGF檢測(cè)和測(cè)量測(cè)定前，封閉緩沖液從孔中除去，各板的孔用洗滌緩沖液(無(wú)鈣無(wú)鎂的PBS，含0.1％Tween 20)洗一次。
用于ELISA測(cè)定的CTGF標(biāo)準(zhǔn)溶液如下制備。如上所述的冷凍rhCTGF等分樣品被溶解并在肝素試驗(yàn)緩沖液(0.45μm過(guò)濾)中稀釋到1.1μg/ml的終濃度，緩沖液含無(wú)鈣無(wú)鎂的PBS、50mM Tris(pH7.8)、1mg/ml BSA、4mM MgCl2、0.2mM Zn Cl2、0.05％疊氮化鈉、50μg/ml肝素鈉和1％TRITON X-100去垢劑。rhCTGF標(biāo)準(zhǔn)貯存液等分保存于-70℃。隨后制備rhCTGF貯存液稀釋以獲得從0ng/ml到15ng/ml的rhCTGF標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍，稀釋是在肝素試驗(yàn)緩沖液中。在所有描述的ELISA測(cè)定中，CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段在與CTGF標(biāo)準(zhǔn)相比基礎(chǔ)上確定。
生物樣品在肝素試驗(yàn)緩沖液中稀釋(通常稀釋是在1∶2和1∶20間，取決于具體樣品種類(lèi))，50μl稀釋樣品應(yīng)用于包被和封閉的微量滴定孔，做兩組或三組。
為確定CTGF或CTGF片段的檢測(cè)，可使用來(lái)自包被的不同CTGF抗原表位特異性的生物素酰化單克隆抗體或CTGF捕獲抗體。生物素酰化抗體加入微量滴定板孔中的上述樣品和CTGF標(biāo)準(zhǔn)，含CTGF的樣品和CTGF標(biāo)準(zhǔn)與生物素?；笴TGF抗體在捕獲抗體包被的微量滴定板中同時(shí)培養(yǎng)。用于檢測(cè)的單克隆抗體用生物素DNP試劑生物素酰化，遵循廠(chǎng)商(Molecular Probes，Eugene，OR)所述操作。通?？山邮?∶1到12∶1的生物素mAb比例。50微滴的生物素?；瘑慰寺】贵w(1000ng/ml)加入已含上述樣品的各孔。板隨后被覆蓋并在板旋轉(zhuǎn)器上以100到130rpm在2到8℃培養(yǎng)90分鐘。
然后，板用洗滌緩沖液洗三次。接著孔用50μl鏈霉抗生物素-堿性磷酸酶綴合物(Jackson ImmunoResearch Labs，West Grove PA)培養(yǎng)，綴合物在試驗(yàn)緩沖液中稀釋(通常1∶10,000)到根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定的各綴合物組濃度，這是在CTGF標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)所需信號(hào)水平發(fā)展基礎(chǔ)上。板被覆蓋并在板旋轉(zhuǎn)器上以100到130rpm在2到8℃培養(yǎng)90分鐘。之后，板如上所述洗三次，加入100μl堿性磷酸酶底物(SigmaChemical Co.)到各孔。用視覺(jué)和微量滴定板讀數(shù)器監(jiān)控顏色發(fā)展。一旦標(biāo)準(zhǔn)和樣品顏色發(fā)展達(dá)到最佳信號(hào)水平，通過(guò)加入50μl 4N氫氧化鈉到各孔來(lái)終止顏色進(jìn)一步發(fā)展。隨后微量滴定板置于微量滴定板讀數(shù)器中，在405nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度單位來(lái)確定顏色發(fā)展。
高蛋白質(zhì)含量的樣品當(dāng)測(cè)量高蛋白質(zhì)含量的樣品(如血、血清、血漿等)中CTGF水平時(shí)，對(duì)上面和實(shí)施例5中所述CTGF測(cè)定進(jìn)行修改。為提供標(biāo)準(zhǔn)和此測(cè)定中所用樣品內(nèi)蛋白質(zhì)濃度或水平的一致性，肝素試驗(yàn)緩沖液添加10％除去CTGF的大鼠血清，此試驗(yàn)檢測(cè)高蛋白質(zhì)含量樣品中的CTGF和CTGF片段。
CTGF如下從大鼠血清中除去以用于此試驗(yàn)。大鼠血清用2％(v/v)肝素-瓊脂糖珠過(guò)夜培養(yǎng)，從大鼠血清中除去CTGF和CTGF C-末端片段。CTGF N-末端片段不通過(guò)此方法從大鼠血清中除去，因?yàn)镃TGF N-末端片段不結(jié)合肝素。仍存在于肝素-瓊脂糖處理大鼠血清中的N-末端片段不干擾隨后的CTGF測(cè)定，因?yàn)橛糜跈z測(cè)人CTGF的測(cè)定不檢測(cè)大鼠CTGF N-末端片段。另外，抗體親和層析柱可用于從哺乳動(dòng)物血清中除去CTGF和CTGF片段以產(chǎn)生除去CTGF和CTGF片段的血清。
如上所述制備的CTGF標(biāo)準(zhǔn)溶液摻加10％(v/v)大鼠血清，大鼠血清如上所述用肝素-瓊脂糖珠處理。稀釋在肝素試驗(yàn)緩沖液中的生物素?；笴TGF抗體(用于檢測(cè))也摻加10％肝素-瓊脂糖珠處理的大鼠血清。高蛋白質(zhì)含量的樣品用肝素試驗(yàn)緩沖液1∶10稀釋?zhuān)灰虼怂杏糜跍y(cè)定的溶液(即CTGF標(biāo)準(zhǔn)，生物樣品等)包含10％(v/v)終濃度的血清。隨后上述夾層ELISA測(cè)定用于檢測(cè)和測(cè)量稀釋的高蛋白質(zhì)含量樣品中CTGF和CTGF片段的水平。
實(shí)施例7CTGF測(cè)定特異性檢測(cè)上述實(shí)施例5和實(shí)施例6中CTGF ELISA測(cè)定的特異性和可靠性。表1顯示用rhCTGF標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的ELISA測(cè)定結(jié)果，使用上述測(cè)定以檢測(cè)和測(cè)量CTGF(N-C試驗(yàn))、CTGF N-末端片段(N-N試驗(yàn))和CTGF C-末端片段(C-C試驗(yàn))。
示于表1的測(cè)定結(jié)果是405nm的吸光度，由ELISA板測(cè)量。不同rhCTGF濃度(0到11ng/ml)用于建立各CTGF ELISA測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。測(cè)定在各CTGF濃度進(jìn)行三次，用于ELISA測(cè)定的吸光度的統(tǒng)計(jì)平均值和變異系數(shù)(％CV)包括在表1中。
表1CTGF ELISA測(cè)定的代表性標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
測(cè)定根據(jù)實(shí)施例5和實(shí)施例6所述操作進(jìn)行。測(cè)定特異性通過(guò)選擇用于各測(cè)定的捕獲和標(biāo)記(檢測(cè))抗體來(lái)控制。結(jié)果顯示此例子中進(jìn)行的用于CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的CTGF ELISA測(cè)定有檢測(cè)低于1ng/ml濃度CTGF多肽的敏感性。因此，發(fā)現(xiàn)特測(cè)量CTGF測(cè)定的變異系數(shù)(CV)正常是在約0到6％范圍中。
進(jìn)一步檢測(cè)各CTGF ELISA測(cè)定的特異性。獲自桿狀病毒的rhCTGF如上所述生成和純化。CTGF N-末端片段和C-末端片段如實(shí)施例2所述通過(guò)胰凝乳蛋白酶裂解rhCTGF產(chǎn)生和純化。檢測(cè)和測(cè)量CTGF(N-C試驗(yàn))、CTGF N-末端片段(N-N試驗(yàn))和CTGF C-末端片段(C-C試驗(yàn))的CTGF ELLSA測(cè)定用這些CTGF多肽進(jìn)行。結(jié)果示于圖2(N-C試驗(yàn))、圖3(N-N試驗(yàn))和圖4(C-C試驗(yàn))。
如上述和圖2、3和4所示，所有三種CTGF測(cè)定描述CTGF(圖2、3和4中的實(shí)心正方形)。CTGF測(cè)定僅檢測(cè)CTGF(即含CTGF N-末端結(jié)構(gòu)域和CTGF C-末端結(jié)構(gòu)域)。CTGF測(cè)定不檢測(cè)CTGF N-末端片段(圖2、3和4中的實(shí)心三角形)或CTGF C-末端片段(圖2、3和4中的實(shí)心圓)。N-末端結(jié)構(gòu)域測(cè)定檢測(cè)CTGF(圖3中的實(shí)心正方形)和CTGF N-末端片段(圖3中的實(shí)心三角形)。C-末端結(jié)構(gòu)域測(cè)定檢測(cè)CTGF(圖4中的實(shí)心正方形)和CTGF C-末端片段(圖4中的實(shí)心圓)，但不檢測(cè)CTGFN-末端片段(圖4中的實(shí)心三角形)。
本發(fā)明的CTGF和CTGF片段測(cè)定特異于CTGF多肽。結(jié)構(gòu)相關(guān)的CCN家族成員NOV和CYR61(用高至0.5mg/ml的濃度)不用所述CTGF測(cè)定檢測(cè)(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。
實(shí)施例8缺乏或存在肝素時(shí)的CTGF檢測(cè)CTGF是肝素-結(jié)合生長(zhǎng)因子，取決于位于CTGF C-末端區(qū)域的肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。CTGF穩(wěn)定性、檢測(cè)和回收在不同保存溫度存在和缺乏肝素時(shí)測(cè)量和評(píng)估。重組人CTGF(10ng/ml)在存在和缺乏肝素(來(lái)自Porcine，Sigma Chemical Co.；加至10μg/ml的濃度)時(shí)加入試驗(yàn)緩沖液。含CTGF的樣品隨后在下列溫度培養(yǎng)10天-80℃、-20℃、4℃或25℃。
隨后如實(shí)施例5所述用ELISA測(cè)定來(lái)確定樣品中保留的CTGF量。缺乏或存在肝素時(shí)的CTGF檢測(cè)結(jié)果示于表2。
表2肝素對(duì)CTGF檢測(cè)的效果
如表2所示，缺乏肝素時(shí)檢測(cè)到少量CTGF，甚至當(dāng)樣品保存在-80℃時(shí)也如此。在4℃或25℃缺乏肝素后10天，檢測(cè)到的樣品加入約1ng/ml原始10ng/ml CTGF。這表明CTGF多肽不穩(wěn)定或者也許是粘性，特別是在冷凍溫度之上培養(yǎng)時(shí)。當(dāng)CTGF在肝素存在時(shí)培養(yǎng)，4℃或25℃后10天可檢測(cè)CTGF水平約為5ng/ml，對(duì)應(yīng)于約一半加入試驗(yàn)緩沖液的原始CTGF量，是缺乏肝素時(shí)獲得水平的5倍。加入肝素促進(jìn)在所有檢測(cè)溫度時(shí)的CTGF回收。這表明肝素提供穩(wěn)定CTGF效果，維持水溶液中CTGF溶解度，或保護(hù)CTGF不被蛋白質(zhì)水解、吸收于塑料，或結(jié)合溶液中其它大分子。
實(shí)施例9細(xì)胞培養(yǎng)條件培養(yǎng)基中CTGF和CTGF片段的檢測(cè)和穩(wěn)定性已知人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63細(xì)胞生成和分泌CTGF。此外，TGFβ刺激這些細(xì)胞中的CTGF表達(dá)。MG-63細(xì)胞從ATCC(CRL-1427)中獲得。細(xì)胞在極限必需培養(yǎng)基(MEM)中平板培養(yǎng)于12孔組織培養(yǎng)板(27,000個(gè)細(xì)胞每孔)，MEM含10％胎牛血清、谷氨酸、青霉素和非必須氨基酸。48小時(shí)后，除去培養(yǎng)基并用新鮮培養(yǎng)基(無(wú)胎牛血清且含磷酸抗壞血酸(30μg/ml)和牛血清白蛋白(1mg/ml)的MEM)替換，含肝素(10μg/ml)，有活沒(méi)有TGFβ(5ng/ml)。隨后在0、24、92和120小時(shí)后從細(xì)胞中收集條件培養(yǎng)基并分析CTGF和CTGF片段水平。MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)基中CTGF、CTGFN-末端片段和C-末端片段水平的結(jié)果示于下表3。
表3細(xì)胞條件培養(yǎng)基中CTGF和CTGF片段的水平
如表3所示，TGFβ處理24小時(shí)后，MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)基中檢測(cè)到的CTGF水平從40ng/ml增加到150ng/ml。然而TGFβ處理92或120小時(shí)后，細(xì)胞條件培養(yǎng)基中檢測(cè)到的CTGF水平比處理24小時(shí)后所觀(guān)察到的大幅減少。
CTGF C-末端片段水平觀(guān)察到類(lèi)似的結(jié)果。TGFβ存在24小時(shí)后，細(xì)胞條件培養(yǎng)基中CTGF C-末端片段水平從7ng/ml減少到不能檢測(cè)的水平。TGFβ處理92或120小時(shí)后，條件培養(yǎng)基中CTGF C-末端片段水平保持較低或不能檢測(cè)。因此，盡管用TGFβ刺激CTGF表達(dá)，MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)基中CTGF和CTGF C-末端片段可檢測(cè)的水平隨著時(shí)間降低或不能檢測(cè)。
相反，CTGF N-末端片段的檢測(cè)和測(cè)量顯示CTGF N-末端片段隨著時(shí)間積聚在MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)基中。存在或缺乏TGFβ刺激CTGF表達(dá)時(shí)都發(fā)現(xiàn)N-末端片段積聚在條件培養(yǎng)基中。盡管觀(guān)察到TGFβ處理24小時(shí)后CTGF水平增加約4倍(相較未處理細(xì)胞)，在TGFβ處理細(xì)胞中觀(guān)察到CTGF N-末端片段水平比未刺激細(xì)胞僅少量增加(沒(méi)有TGFβ處理時(shí)的157ng/ml相較TGFβ處理時(shí)的1581ng/ml)。在此具體情況中，單獨(dú)測(cè)量CTGF N-末端片段水平不指示TGFβ處理24小時(shí)后任何CTGF水平增加。因此檢測(cè)和區(qū)分CTGF、CTGF N-末端片段和C-末端片段水平的能力是一種敏感和可靠的方法，用于確定CTGF和其片段的存在和水平以及不同條件下CTGF和CTGF片段表達(dá)的任何變化。
這些結(jié)果表明在一些情況中，CTGF N-末端片段可隨著時(shí)間積聚。CTGF N-末端片段積聚與CTGF可檢測(cè)水平降低相一致，表明CTGF N-末端片段在生物液體中穩(wěn)定(即更少受影響或抗蛋白質(zhì)水、清除、除去或吸收)，如細(xì)胞條件培養(yǎng)基、血和尿；因此可提供CTGF表達(dá)的可檢測(cè)和穩(wěn)定指示。
另外，此數(shù)據(jù)表明在一些情況中，CTGF和CTGF C-末端片段可通過(guò)降解、分泌或組織除去而失去。此數(shù)據(jù)也顯示檢測(cè)和區(qū)分細(xì)胞培養(yǎng)基中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段在確定CTGF表達(dá)水平和CTGF裂解、加工、除去、清除等程度或范圍中的價(jià)值和好處。
實(shí)施例10CTGF和CTGF片段的蛋白質(zhì)印跡分析MG-63細(xì)胞在Dulbecco’s Eagle修飾培養(yǎng)基中培養(yǎng)(CELLGRO培養(yǎng)基；Mediatech，Herndon VA)，培養(yǎng)基含50μg/ml肝素鈉(Sigma Chemical Co.)、50μg/ml牛血清白蛋白(Sigma Chemical Co.)且沒(méi)有血清。在第1、2、3和6天，從細(xì)胞中收集條件培養(yǎng)基，1200rpm離心5分鐘以沉淀碎片，上清冷凍保存。
CTGF水平的分析如下完成。CTGF N-末端片段通過(guò)單克隆抗體免疫沉淀從條件培養(yǎng)基中分離，單克隆抗體定向抗CTGF N-末端結(jié)構(gòu)域。免疫沉淀通過(guò)10μg/ml濃度單克隆抗體培養(yǎng)MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)基1小時(shí)來(lái)進(jìn)行，單克隆抗體特異于CTGFN-末端區(qū)域。加入2％(w/w)蛋白質(zhì)-A(Sigma Chemical Co.)懸浮液且樣品再培養(yǎng)1小時(shí)。非特異性結(jié)合對(duì)照可用蛋白質(zhì)-A單獨(dú)沉淀，不包括任何CTGF特異抗體。免疫沉淀/蛋白質(zhì)-A復(fù)合物用緩沖液洗兩次，緩沖液含150mM NaCl、1％TRITON X-100去垢劑、1％脫氧膽酸、1％SDS、50mM Tris(pH7.5)和2mM EDTA。樣品隨后用Tris-甘氨酸SDS樣品緩沖液(2X)(Invitrogen)溶解制備用于電泳分離沉淀的蛋白質(zhì)。CTGF和CTGF C-末端片段通過(guò)肝素-瓊脂糖沉淀從條件培養(yǎng)基分離。完成肝素-瓊脂糖(Amersham Pharmacia Biotech)沉淀是通過(guò)4℃混合細(xì)胞條件培養(yǎng)基和2％肝素-瓊脂糖懸浮液(用PBS 1∶1(w/w))2小時(shí))。沉淀復(fù)合物用PBS洗兩次，隨后如上所述溶解。
電泳(4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE膠(Invitrogen))后，樣品轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜(Invitrogen)上用于蛋白質(zhì)印跡分析。膜隨后用5％牛奶在緩沖液中封閉，緩沖液含24.8mM TRIS堿、2.7mM氯化鉀、137mM氯化鈉、0.05％Tween 20，pH7.4。
通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析檢測(cè)MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)基中CTGF和CTGF片段，結(jié)果示于圖5A、5B和5C。含CTGF(圖5A)和CTGF C-末端片段(圖5C)的膜用肝素-瓊脂糖珠沉淀，用識(shí)別CTGF C-末端片段的單克隆抗體探測(cè)，接著用結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶的抗人IgG(Jackson ImmunoResearch)檢測(cè)。含CTGF N-末端片段(圖5B)的膜用抗CTGF抗體免疫沉淀，用抗CTGF雞多克隆抗體探測(cè)，接著用結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶的兔抗雞IgY(Zymed，South San Francisco CA)檢測(cè)。蛋白質(zhì)印跡發(fā)展用SUPERSIGNAL化學(xué)發(fā)光試劑(Pierce Chemical Co.，Rockford IL)顯現(xiàn)。
測(cè)量MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)基中CTGF和CTGF片段水平的相對(duì)變化通過(guò)光密度測(cè)量上述蛋白質(zhì)印跡來(lái)進(jìn)行。CTGF和CTGF片段蛋白質(zhì)印跡的光密度測(cè)量結(jié)果示于下表4。
表4細(xì)胞條件培養(yǎng)基中CTGF和CTGF片段水平的變化
CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的檢測(cè)和測(cè)量通過(guò)蛋白質(zhì)印跡證明。如圖5A所示，積聚在MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的CTGF在約第3天達(dá)到最大水平。在培養(yǎng)第6天，MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的CTGF水平低于培養(yǎng)第1天后確定的一半，僅約第3天確定水平的20％，第3天有CTGF測(cè)量的最高水平。這表明CTGF在MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)基中不穩(wěn)定。觀(guān)察到CTGF N-末端片段水平隨著時(shí)間在MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)基中積聚(圖5B)。CTGF C-末端片段水平不在MG-63細(xì)胞條件培養(yǎng)基中積聚；而在條件培養(yǎng)基中第6天，蛋白質(zhì)印跡分析不能檢測(cè)CTGF C-末端片段(圖5C)。
如上面實(shí)施例9所示，這些觀(guān)察與ELISA測(cè)定獲得結(jié)果一致。CTGF和CTGF C-末端片段可檢測(cè)水平的減少表明CTGF和CTGF C-末端片段比CTGF N-末端片段更不穩(wěn)定，因此也許不提供在具體時(shí)間樣品中CTGF表達(dá)或水平的可靠指示。CTGF N-末端片段積聚表明CTGF N-末端片段在生物液體中比CTGF或CTGF C-末端片段更穩(wěn)定(即更少受影響或抗蛋白質(zhì)水、清除、除去或吸收)，例如細(xì)胞條件培養(yǎng)基。因此，如蛋白質(zhì)印跡分析所測(cè)量，CTGF N-末端片段提供CTGF表達(dá)的可檢測(cè)和穩(wěn)定指示。數(shù)據(jù)也顯示檢測(cè)和區(qū)分細(xì)胞培養(yǎng)基中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段在確定CTGF表達(dá)水平和CTGF裂解、加工、除去、清除等程度或范圍中的價(jià)值和好處。
實(shí)施例11加入尿的CTGF和CTGF片段的穩(wěn)定性使用與上述實(shí)施例8類(lèi)似的方法，在健康個(gè)體的人尿樣品加入10ng/mlrhCTGF，通過(guò)檢測(cè)和測(cè)量CTGF和CTGF片段水平來(lái)分析人尿樣品。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，CTGF檢測(cè)和測(cè)量用實(shí)施例5和實(shí)施例6所述CTGF ELISA測(cè)定進(jìn)行。人尿中CTGF N-末端片段的正常濃度先前確定為約1到2ng/ml。
圖6顯示CTGF加入尿樣品后在4℃保存0、1、2、3、4和5天時(shí)尿中CTGF和CTGF N-末端片段的水平。如圖6所示，添加CTGF的尿在4℃保存3天后僅檢測(cè)到CTGF N-末端片段。3天后，在這些保存條件下尿中不能檢測(cè)到CTGF。因此，檢測(cè)和測(cè)量CTGF N-末端片段改進(jìn)和更可靠檢測(cè)和測(cè)量加入尿的CTGF原始量。這些結(jié)果表明CTGF在尿中比N-末端片段更不穩(wěn)定。
實(shí)施例12尿中CTGF的蛋白質(zhì)水解尿中CTGF的較低穩(wěn)定性(相較CTGF N-末端片段)或缺乏檢測(cè)和測(cè)量尿中CTGF的能力可能是由于CTGF在人尿中的不穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)水解。為檢測(cè)此方面，對(duì)人尿樣品進(jìn)行與實(shí)施例11所述類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)，人尿樣品加入rhCTGF和多種蛋白酶抑制劑。在此研究中，10ng/ml rhCTGF加入正常人尿，人尿隨后在存在或沒(méi)有蛋白酶抑制劑情況下4℃保存1到7天。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，CTGF檢測(cè)和測(cè)量用上述CTGFELISA測(cè)定進(jìn)行。所用蛋白酶抑制劑是蛋白酶抑制劑混合物(Sigma Chemical Co.批號(hào)P-8340)、N-羥基-2[N’-(4-甲氧基-苯磺酰)-N’(4-氯苯甲基)氨基]-乙酰胺(金屬蛋白酶抑制劑)或乙二胺四乙酸(EDTA)。尿中CTGF蛋白質(zhì)水解的結(jié)果示于下表5。
表5尿中CTGF的蛋白質(zhì)水解
上表5顯示保存1天或7天后，在沒(méi)有加入任何蛋白酶抑制劑時(shí)不能檢測(cè)到大部分加入尿的CTGF。與缺乏蛋白酶抑制劑相比，包含蛋白酶抑制劑導(dǎo)致保存1天后可檢測(cè)的CTGF水平更高。用蛋白酶抑制劑混合物、金屬蛋白酶抑制劑以及金屬離子螯合劑EDTA發(fā)生類(lèi)似程度的可檢測(cè)CTGF損失。這些數(shù)據(jù)表明蛋白酶至少部分造成4℃保存的正常人尿中可檢測(cè)CTGF的降解、除去或損失。這些數(shù)據(jù)也表明樣品中可檢測(cè)CTGF的水平通過(guò)加入蛋白酶抑制劑來(lái)維持。
相反，存在或沒(méi)有加入蛋白酶抑制劑時(shí)可檢測(cè)和測(cè)量這些樣品中的CTGF N-末端片段。此外，CTGF N-末端片段水平與外源加入尿的rhCTGF量(10ng/ml)一致。表5顯示用N-N試驗(yàn)確定的數(shù)據(jù)，N-N試驗(yàn)檢測(cè)CTGF和CTGF N-末端片段。由于正常尿中約為1到2ng/ml的外源CTGF水平(即CTGF N-末端片段)，CTGF N-末端片段水平高于外源加入的10ng/ml rhCTGF。在正常尿中，CTGF和CTGF C-末端片段不能檢測(cè)，而1到2ng/ml CTGF N-末端片段可檢測(cè)(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。這些結(jié)果表明CTGF對(duì)蛋白酶活性敏感，至少部分導(dǎo)致不能檢測(cè)和測(cè)量尿中的CTGF，如檢測(cè)和測(cè)量尿中CTGF N-末端片段的能力所測(cè)，CTGF N-末端片段似乎抗蛋白酶降解。
實(shí)施例13腹膜透析患者中的CTGF腹膜透析患者中的CTGF和CTGF片段水平在透析液中測(cè)量，透析液從進(jìn)行腎功能缺陷腹膜透析的患者的腹膜腔回收。透析液從進(jìn)行2個(gè)月腹膜透析或更短的患者腹膜中獲得和取出(圖7A中的樣品號(hào)1、2、3、6和7)，或來(lái)自進(jìn)行50到100個(gè)月腹膜透析的患者(圖7A中的樣品號(hào)4、5、8、9和10)。五個(gè)患者診斷為1型糖尿病，四個(gè)患者患腎小球腎炎且一個(gè)患者由于多囊腎疾病做透析。在一些情況中，腹膜透析液獲自患者，患者在接受腹膜透析時(shí)發(fā)展出短瞬腹膜炎。樣品號(hào)4、8和10來(lái)自以前曾患細(xì)菌腹膜炎的患者，樣品號(hào)9是以前四次患細(xì)菌腹膜炎的患者。
在所有檢測(cè)的透析液中發(fā)現(xiàn)CTGF N-末端片段的可檢測(cè)水平(圖7A和7B)。檢測(cè)、測(cè)量和比較腹膜透析患者透析液中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段顯示CTGF N-末端片段的最高水平(沒(méi)有顯示CTGF和CTGF C-末端片段的數(shù)據(jù))。
實(shí)施例14腎纖維化受試者血清中的CTGF前面檢查了腎透析患者尿中CTGF的存在(Riser等，(2000)J Am Soc Nephrol1125-38國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)WO 00/13706)。為檢測(cè)CTGF，這些前面的研究使用肝素-瓊脂糖吸收CTGF(由于CTGF N-末端片段不吸收到肝素-瓊脂糖珠上，因此導(dǎo)致沒(méi)有N-末端片段檢測(cè))，使用不區(qū)分全CTGF、N-末端片段或C-末端片段的CTGF ELISA，也許沒(méi)有檢測(cè)各CTGF種類(lèi)(即CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段)的相同敏感性。
在本研究中，確定腎纖維化患者血清中CTGF和CTGF片段的水平。來(lái)自正常供體和腎纖維化患者的血清獲自Intergen公司(Purchase，NY)。患者有異常腎功能和腎纖維化，這些來(lái)自腎移植、化學(xué)毒性或IgA-相關(guān)腎病的臨床顯示。
如圖8所示，腎纖維化患者血清中CTGF和CTGF C-末端片段的水平與正常個(gè)體血清中發(fā)現(xiàn)的水平相同或稍低。這些對(duì)應(yīng)于正常個(gè)體或腎纖維化患者血清中CTGF或CTGF C-末端片段水平的值約為0-20ng/ml。然而，在腎纖維化患者血清中可檢測(cè)到CTGF N-末端片段。此外，CTGF N-末端片段水平高于這些患者血清中的CTGF和CTGF C-末端片段水平。因此，檢測(cè)、測(cè)量和比較這些患者血清中的CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段顯示診斷為腎纖維化的患者中CTGF N-末端片段顯著增加。
實(shí)施例15器官移植受試者血清中的CTGF檢測(cè)器官移植患者血清中的CTGF和CTGF片段水平。來(lái)自功能器官移植(肝或腎)患者的血清以及來(lái)自慢性器官移植排斥患者的血清從Intergen公司獲得。在臨床檢測(cè)患者加上測(cè)量肌氨酸酐清除的基礎(chǔ)上區(qū)分功能器官移植的患者和經(jīng)歷慢性排斥的患者。慢性器官移植排斥估定在移植后一年以上。
如圖9所示，正常器官移植患者或器官移植后慢性排斥患者的血清中CTGF和CTGF C-末端片段水平與正常個(gè)體(沒(méi)有經(jīng)歷器官移植的個(gè)體)血清中發(fā)現(xiàn)的水平相同。對(duì)應(yīng)于正常個(gè)體或器官移植患者血清中CTGF或CTGF C-末端片段水平的值被確定，CTGF和CTGF C-末端片段約為0-20ng/ml。
相反，如圖9所示，器官移植患者血清中可檢測(cè)到CTGF N-末端片段。此外，與健康非移植個(gè)體血清中所檢測(cè)的相比，正常器官移植和慢性移植排斥患者血清中的CTGF N-末端片段水平大幅提高。肝移植或腎移植個(gè)體血清中檢測(cè)到CTGF N-末端片段水平提高。這些結(jié)果表明檢測(cè)、測(cè)量和比較器官移植患者血清中的CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的水平顯示經(jīng)歷器官移植患者的CTGF N-末端片段水平高于非移植個(gè)體。此外，結(jié)果顯示相較正常器官移植中觀(guān)察到的水平，與慢性器官移植排斥相關(guān)的CTGF N-末端片段水平進(jìn)一步提高。
實(shí)施例16心肌梗塞受試者血清中的CTGF檢測(cè)心肌梗塞患者血清中的CTGF和CTGF片段水平。來(lái)自正常供體和心肌梗塞患者的血清獲自Intergen公司?；颊叩男募」ＨM(jìn)行癥狀診斷并進(jìn)一步通過(guò)評(píng)估患者血清中肌鈣蛋白I的水平來(lái)確定。在10個(gè)檢測(cè)的患者中，肌鈣蛋白I水平的范圍從14.1到103ng/ml。所用肌鈣蛋白I試驗(yàn)方法是AXSYM免疫測(cè)定系統(tǒng)(AbbottLaboratories，Abbott Park IL)，相應(yīng)參考范圍是0.0到0.5ng/ml。
如圖10所示，心肌梗塞患者血清中的CTGF水平僅稍高于正常個(gè)體血清中確定的水平。心肌梗塞受試者血清中CTGF C-末端片段水平與正常個(gè)體血清中發(fā)現(xiàn)的水平相同或稍低。然而，在心肌梗塞患者血清中可檢測(cè)到CTGF N-末端片段。此外，CTGF N-末端片段水平高于這些患者血清中的CTGF和CTGF C-末端片段水平。因此，檢測(cè)、測(cè)量和比較這些患者血清中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的水平顯示最近證明為心肌梗塞的患者中CTGF N-末端片段顯著增加。
實(shí)施例17肝纖維化受試者血清中的CTGF檢測(cè)診斷為進(jìn)行性肝纖維化患者血清中的CTGF和CTGF片段水平。來(lái)自正常供體和肝纖維化患者的血清獲自Intergen公司。如圖10所示，在獲自正常個(gè)體的血清中檢測(cè)到低水平CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段。這些結(jié)果表明在正常血清中，CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段范圍為約0到20ng/ml。肝纖維化患者血清中的CTGF C-末端片段水平與正常個(gè)體血清中發(fā)現(xiàn)的水平相同。
然而，進(jìn)行性肝纖維化患者血清中CTGF和CTGF N-末端片段的水平高于正常個(gè)體血清中的水平。檢測(cè)、測(cè)量和比較這些患者血清中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的水平揭示肝纖維化患者中存在CTGF N-末端片段水平提高。
實(shí)施例18關(guān)節(jié)炎滑液中的CTGF確定關(guān)節(jié)炎滑液中CTGF和CTGF片段的水平。來(lái)自正常供體的血清獲自Intergen公司。來(lái)自炎性關(guān)節(jié)疾病患者滑液的樣品取自患者膝蓋，獲自VitalProducts(Delray Beach FL)。如圖11所示，在關(guān)節(jié)炎滑液中不能檢測(cè)到CTGF和CTGF C-末端片段水平。相反，在關(guān)節(jié)炎滑液中檢測(cè)到CTGF N-末端片段且N-末端片段水平提高(相較CTGF和CTGF C-末端片段)。檢測(cè)、測(cè)量和比較這些患者關(guān)節(jié)炎滑液中CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段的水平揭示診斷為炎性關(guān)節(jié)疾病患者中存在CTGF N-末端片段水平提高。
實(shí)施例19玻璃狀液中的CTGF檢測(cè)診斷為眼病患者死后玻璃狀液中CTGF和CTGF片段的水平。玻璃狀液購(gòu)買(mǎi)自L(fǎng)ions Eye Bank of Oregon(Portland OR)。圖12A顯示對(duì)取自受試者的玻璃狀液進(jìn)行CTGF測(cè)定的結(jié)果，受試者有或沒(méi)有臨床診斷的眼病。眼病包括1型糖尿病視網(wǎng)膜病誘導(dǎo)的失明、白內(nèi)障和輕微斑點(diǎn)降解的2型糖尿病和非糖尿病雙側(cè)白內(nèi)障。如圖12A所示，臨床診斷為眼病患者玻璃狀液中CTGF N-末端片段水平高于沒(méi)有臨床診斷為眼病患者玻璃狀液中的水平。
CTGF片段表達(dá)水平獲得的數(shù)據(jù)可表示為樣品中CTGF N-末端片段水平和相同樣品中CTGF水平的比例，或表示為樣品中CTGF C-末端片段水平和相同樣品中CTGF水平的比例。數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換用玻璃狀液中CTGF和CTGF N-末端片段水平獲得的數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行(圖12A)。用上述數(shù)據(jù)(樣品來(lái)自玻璃狀液)檢測(cè)CTGF C-末端片段和CTGF水平的比例，結(jié)果示于圖12B(N-末端片段/CTGF)。CTGF N-末端片段和CTGF水平的比例顯示進(jìn)一步的證據(jù)確定CTGF N-末端片段水平提供生物樣品中CTGF表達(dá)的更敏感和更可靠評(píng)估。
進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)以確定樣品間CTGF和其片段水平獲得值的統(tǒng)計(jì)顯著性，樣品來(lái)自正常和患病受試者。對(duì)圖12所示數(shù)據(jù)進(jìn)行T-試驗(yàn)分析。使用CTGF測(cè)定(N-C試驗(yàn))，如T-試驗(yàn)所確定(P＝0.150)，與疾病玻璃狀液相比獲自正常樣品的CTGF水平差異統(tǒng)計(jì)不顯著。
此外，同樣用CTGF兔多克隆抗體對(duì)CTGF進(jìn)行ELISA測(cè)定。此抗體制備在CTGF免疫兔中生成(用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)過(guò)程)，因此包含多種識(shí)別CTGF多肽內(nèi)多種抗原表位的抗體。用此兔多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)量CTGF的ELISA測(cè)定，使用本領(lǐng)域已知過(guò)程。CTGF的兔多克隆抗體實(shí)驗(yàn)不能區(qū)分CTGF、CTGF N-末端片段或CTGFC-末端片段。用兔多克隆抗體的ELISA測(cè)定結(jié)果示于圖12A(兔多克隆)。分析用CTGF兔多克隆抗體獲得的CTGF水平數(shù)據(jù)表明如T-試驗(yàn)所確定(P＝0.317)，與疾病玻璃狀液相比獲自正常樣品的CTGF水平統(tǒng)計(jì)不顯著。這表明此區(qū)分CTGF、CTGF N-末端片段或CTGF C-末端片段的方法不能可靠比較正常和疾病狀態(tài)的CTGF水平。
相反，T-試驗(yàn)分析測(cè)定獲得值顯示與疾病個(gè)體相比來(lái)自正常樣品玻璃狀液的CTGF N-末端片段量有統(tǒng)計(jì)顯著的差異(P＝0.007)，測(cè)定測(cè)量CTGF N-末端片段水平。對(duì)CTGF N-末端片段和CTGF水平的比例進(jìn)行的T-試驗(yàn)表明與疾病個(gè)體相比來(lái)自正常樣品玻璃狀液的CTGF N-末端片段量有顯著差異(P＝0.003)。因此，單獨(dú)檢測(cè)和測(cè)量CTGF水平不提供區(qū)分正常和疾病狀態(tài)CTGF水平的統(tǒng)計(jì)顯著數(shù)據(jù)。然而如本發(fā)明所述，檢測(cè)和測(cè)量CTGF N-末端片段水平不提供區(qū)分正常和疾病狀態(tài)CTGF N-末端片段水平的統(tǒng)計(jì)顯著數(shù)據(jù)。
實(shí)施例20癌癥患者血清中的CTGF檢測(cè)癌癥患者血清中的CTGF和CTGF片段水平。來(lái)自正常供體和癌癥患者的血清獲自Intergen公司。下列癌癥標(biāo)記的檢測(cè)和測(cè)量由Intergen公司進(jìn)行。
CA 15-3是腫瘤細(xì)胞流入血流的粘液素-類(lèi)似的膜糖蛋白。CA 15-3是用于調(diào)控乳腺癌患者的血清癌癥抗原。CA 15-3水平用來(lái)自Bayer Diagnostics(TarrytownNY)的異源夾層磁性分離試劑盒和試劑確定。如果血清中獲得的值大于30U/ml，認(rèn)為患者CA 15-3陽(yáng)性。試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)參考范圍是0到30U/ml。所有CA 15-3患者是女性。年齡范圍從45到88歲，CA 15-3水平范圍從32到1,292 U/ml。這些樣品定義為“乳和卵巢”癌樣品(圖13中的樣品組CA 15-3)。所有測(cè)試的CA 15-3陽(yáng)性患者有三分之一CA 15-3水平比30U/ml的標(biāo)準(zhǔn)臨床參考水平高10倍。
發(fā)現(xiàn)屬于細(xì)胞表面糖蛋白家族的癌胚抗原(CEA)在多種惡性腫瘤中表達(dá)增加。CEA是用于監(jiān)控胃腸道和乳腺癌的癌抗原。CEA水平用自Bayer Diagnostics的異源夾層磁性分離試劑盒和試劑確定。如果血清中獲得的值大于5ng/ml，認(rèn)為患者CEA陽(yáng)性。試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)參考范圍是從0.1到4.9ng/ml。CEA陽(yáng)性患者包括男性和女性，從30到79歲，CEA水平在5.5和2,950ng/ml間。這些患者樣品定義為“結(jié)腸直腸、GI和乳”癌樣品(圖13中的樣品組CEA)。所有測(cè)試的CEA陽(yáng)性患者有三分之一CEA水平比標(biāo)準(zhǔn)臨床參考范圍高10倍。
前列腺特異抗原(PSA)是主要由上皮細(xì)胞生成的糖蛋白，上皮細(xì)胞鄰接腺泡和前列腺管。血清PSA水平提高是前列腺病理的重要標(biāo)記，且用做早期檢測(cè)前列腺癌的腫瘤標(biāo)記。PSA水平用自Bayer Diagnostics的異源夾層磁性分離試劑盒和試劑確定。如果血清中獲得的值大于8.0ng/ml，認(rèn)為患者PSA陽(yáng)性。試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)參考范圍是從0到4ng/ml。所有PSA陽(yáng)性患者是男性。年齡范圍從55到96歲，PSA水平范圍從8.3到1,919.0ng/ml。這些樣品定義為“前列腺”癌樣品(圖13中的樣品組PSA)。所有測(cè)試的PSA陽(yáng)性患者有三分之一PSA水平比標(biāo)準(zhǔn)臨床參考范圍高10倍。
CA 19-9是腫瘤相關(guān)的粘液素，包含唾液酸化的路易斯-A五糖抗原表位、乳酸-N-巖藻戊糖(fucopentaose)II。CA 19-9由胰腺、胃、膽囊、結(jié)腸、卵巢和肺的腺癌生成并流入循環(huán)。CA 19-9水平由Bayer Diagnostics確定。這些樣品定義為“胰腺、GI和肝”癌樣品(圖13中的樣品組CA 19-9)。
如圖13所示，如一些癌標(biāo)記水平提高所確定(如上面圖13所述和顯示)，不同癌癥種類(lèi)的癌癥患者血清中CTGF N-末端片段水平高于正常個(gè)體血清中的CTGF N-末端片段水平。檢測(cè)、測(cè)量和比較這些患者血清中的CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段水平顯示診斷為多種癌癥形式的患者中存在CTGF N-末端片段水平增加。
實(shí)施例21I型糖尿病受試者尿中的CTGF N-末端片段診斷為I型糖尿病受試者尿中的CTGF N-末端片段水平用上述CTCF ELISA測(cè)定檢測(cè)和測(cè)量。I型糖尿病患者的腎管損壞程度通過(guò)測(cè)量他們尿中白蛋白的量(蛋白尿)來(lái)評(píng)估，白蛋白通常用于指示高級(jí)腎病如糖尿病腎病。尿蛋白(白蛋白)分泌水平為20到200μg/分鐘，則認(rèn)為患者少量蛋白尿試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。大量蛋白尿定義為超過(guò)200μg/分鐘的尿蛋白(白蛋白)分泌水平。尿蛋白(白蛋白)分泌水平小于20μg/分鐘則認(rèn)為患者正常。因此在進(jìn)行蛋白尿試驗(yàn)的結(jié)果基礎(chǔ)上，I型糖尿病患者歸類(lèi)為正常、少量蛋白尿或大量蛋白尿。
測(cè)量I型糖尿病患者尿中的CTGF N-末端片段水平，并與測(cè)量的尿肌氨酸酐水平相比。如圖14A所示，這些個(gè)體中CTGF N-末端片段水平獲得的值轉(zhuǎn)換(數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換)成對(duì)數(shù)標(biāo)度。結(jié)果表示為納克CTGF N-末端片段每毫克肌氨酸酐。如圖14A所示，有少量蛋白尿和大量蛋白尿的I型糖尿病患者尿中CTGF N-末端片段水平高于無(wú)蛋白尿的I型糖尿病患者。在這些樣品中沒(méi)有檢測(cè)到CTGF或CTGF C-末端片段(數(shù)據(jù)沒(méi)有顯示)。每毫克尿肌氨酸酐的CTGF N-末端片段水平(納克)在有大量蛋白尿的患者尿中最高。
數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)后對(duì)數(shù)標(biāo)度圖表結(jié)果揭示尿中測(cè)量的CTGF N-末端片段水平與測(cè)量組(即有正常蛋白尿、少量蛋白尿或大量蛋白尿的患者)中腎管損壞程度(通過(guò)蛋白尿/肌氨酸酐水平測(cè)量)相關(guān)。(見(jiàn)圖14A)I型糖尿病患者尿中CTGF N-末端片段水平也與分泌到這些個(gè)體尿中的白蛋白比例相比。測(cè)量分泌到尿中的白蛋白比例(表示為微克白蛋白每分鐘)常用于指示腎損壞程度或腎病嚴(yán)重性。隨著腎損壞增加，腎的適當(dāng)或正常功能進(jìn)一步被削弱，觀(guān)察到分泌入尿中的白蛋白比例高于正常腎。如圖14B所示，CTGF N-末端片段水平增加(表示為納克CTGF N-末端片段每毫克肌氨酸酐)與I型糖尿病患者尿中白蛋白分泌比例增加非常相關(guān)。圖14B中的箭頭指示正常個(gè)體中白蛋白分泌比例的最上限。
實(shí)施例22硬皮病患者血漿中的CTGF硬皮病是結(jié)締組織疾病，特征為皮膚、血管、骨骼肌和內(nèi)臟的纖維化、變性和炎癥變化。鄰接小動(dòng)脈壁細(xì)胞的損傷和皮膚中硬創(chuàng)傷類(lèi)似纖維組織的異常累積是此疾病的特點(diǎn)。硬皮病患者可能發(fā)展出局部或全身形式的疾病。在局部硬皮病中，通常手和臉皮膚區(qū)域最受影響。在全身性硬皮病中，身體器官、皮膚的普遍區(qū)域或兩者都參與。全身性硬皮病也稱(chēng)為全身性硬化癥，它有兩個(gè)主要變體，稱(chēng)為限制性和擴(kuò)散性硬皮病，兩種形式都是累積型。限制性硬皮病的效果可以是普遍的，但通常不影響內(nèi)臟。擴(kuò)散性硬皮病可影響皮膚、結(jié)締組織和其它器官的廣泛區(qū)域。受影響個(gè)體的死亡可能來(lái)自胃腸、心臟或肺的包含。
用上述方法測(cè)量患擴(kuò)散性或限制性硬皮病個(gè)體血漿中的CTGF和CTGF片段水平，并與正常個(gè)體血漿中所見(jiàn)的水平相比。在正常個(gè)體和患擴(kuò)散性或限制性硬皮病個(gè)體間沒(méi)有觀(guān)察到CTGF或CTGF C-末端片段水平的顯著差異。然而，與正常個(gè)體相比，在患擴(kuò)散性或限制性硬皮病個(gè)體血漿中發(fā)現(xiàn)不同的CTGF N-末端片段水平。因此，檢測(cè)、測(cè)量和比較這些個(gè)體血漿中的CTGF、CTGF N-末端片段和CTGF C-末端片段顯示患擴(kuò)散性或限制性硬皮病個(gè)體血漿中CTGF N-末端片段水平提高，而通過(guò)確定CTGF或CTGF C-末端片段水平?jīng)]有觀(guān)察到此增加的水平。
實(shí)施例23肺纖維化中的CTGF肺損傷是抗癌治療中常觀(guān)察到的副作用。認(rèn)為應(yīng)用高劑量電離輻射引起有害的肺炎和肺纖維化。輻射性肺炎最終導(dǎo)致肺纖維化，被認(rèn)為由輻射誘導(dǎo)的限于輻射區(qū)域的局部細(xì)胞因子生成引起。當(dāng)輻射結(jié)合放射敏化細(xì)胞毒性藥物時(shí)，隨即的纖維化似乎比單獨(dú)輻射治療所觀(guān)察到的更明顯且開(kāi)始更迅速。沒(méi)有充分確定與從肺炎發(fā)展到纖維化相關(guān)的具體病理變化。目前這些患者中肺功能損失的測(cè)量和確定用于測(cè)定纖維化的程度和進(jìn)展。
實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明肺損傷后CTGF表達(dá)提高。例如，小鼠中顯示CTGF水平在博來(lái)霉素-誘導(dǎo)的肺纖維化中提高。(Lasky等，(1998)Am J Physiol 275365-371)此外，與來(lái)自健康、不吸煙對(duì)照無(wú)肺纖維化患者的BAL液中存在的相比，CTGF mRNA水平在間質(zhì)性肺炎纖維化(IPF)患者的氣管泡灌洗(BAL)液中增加超過(guò)10倍，在結(jié)節(jié)病患者階段I/II中增加超過(guò)40倍，在結(jié)節(jié)病患者階段III/IV中增加超過(guò)90倍。(Allen等，(1999)Am J Respair Cell Mol Biol 21693-700)因此，預(yù)期有或沒(méi)有結(jié)合含放射敏化細(xì)胞毒性藥物治療時(shí)，CTGF和CTGF片段在接受輻射暴露的患者血漿和BAL液中增加。因此血漿、唾液或肺灌洗中CTGF或CTGF片段水平的變化作為接受放療患者中肺病理變化的診斷測(cè)量。因而，用本發(fā)明方法監(jiān)控這些治療處理后的CTGF和CTGF片段水平提供具體治療發(fā)生后纖維化反應(yīng)的診斷預(yù)測(cè)。
實(shí)施例24血吸蟲(chóng)病中的CTGF血吸蟲(chóng)病高級(jí)病例的特征是肝中存在血吸蟲(chóng)卵。在未治療患者中，卵的肉芽腫反應(yīng)后發(fā)展廣泛的肝纖維化和肝腫大。門(mén)管周纖維化伴隨著脾腫大、門(mén)靜脈膨脹和發(fā)展間接門(mén)體靜脈。(Kardorff等，(1999)Acta Tropica 73153-164)這些變化與纖維化標(biāo)記血清水平增加正相關(guān)，如羧基末端原膠原IV肽(NC1)和類(lèi)透明質(zhì)酸。(Kardorff等，(1999)同上和Richard-Blum等，(1999)Am J Trop Med Hyg60658-663)血漿、尿或組織活組織切片檢查中的CTGF或CTGF片段水平變化用作患血吸蟲(chóng)病個(gè)體中產(chǎn)生的肝病理變化的診斷測(cè)量。因此，用本發(fā)明方法監(jiān)控這些個(gè)體中CTGF和CTGF片段水平提供感染和發(fā)展血吸蟲(chóng)病后肝中纖維化反應(yīng)的診斷預(yù)測(cè)。
實(shí)施例25炎癥和感染疾病中的CTGF狹窄性細(xì)支氣管炎也在肺移植患者中稱(chēng)為閉塞性細(xì)支氣管炎，包括主要在膜壁和相鄰組織和腔變窄所得呼吸細(xì)支氣管中發(fā)生的炎癥和纖維化。縮窄性細(xì)支氣管炎通常是肺和心-肺移植并發(fā)癥，但也與骨髓移植相關(guān)?？s窄性細(xì)支氣管炎也與風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、吸入毒性劑后、消化一些藥物后相關(guān)，并作為兒童中腺病毒、A型流感、囊尾蚴和支原體肺炎感染的罕見(jiàn)并發(fā)癥。目前，由于損傷的斑點(diǎn)分布、獲得廣泛性纖維化晚期損傷組織的技術(shù)困難和不能識(shí)別損傷，難以作出肺移植和其他患者中縮窄性細(xì)支氣管炎的組織病理診斷。在疾病的早期階段，縮窄性細(xì)支氣管炎可能在常規(guī)蘇木精-曙紅-染色標(biāo)本中稀薄且易錯(cuò)過(guò)，而在高級(jí)階段，如果肺中斑點(diǎn)創(chuàng)傷確定為非特異性，疾病可能同樣難診斷。
炎癥和感染疾病的其它例子與纖維化反應(yīng)相關(guān)，其中CTGF和CTGF片段水平的檢測(cè)和測(cè)量在這些疾病的診斷和預(yù)測(cè)中有用，包括下列初級(jí)膽硬化、主要影響女性的自身免疫疾病，特征是具炎癥和最終纖維化入口的小肝內(nèi)膽汁管發(fā)生慢性破壞；先天性肺纖維化，最近確定特征為有腺病毒參與先天性肺纖維化或膠原維管疾病相關(guān)間質(zhì)性肺炎的發(fā)病；腎肝細(xì)胞感染，如腎盂腎炎(即腎實(shí)質(zhì)和腎盂內(nèi)層發(fā)炎，通常由于細(xì)菌感染導(dǎo)致)，認(rèn)為是獲得性(出生后)腎創(chuàng)傷的先決條件。
血漿、尿或組織活組織切片檢查中的CTGF或CTGF片段水平變化用作感染和炎癥后組織纖維化反應(yīng)起始和發(fā)展的診斷測(cè)量。因此，用本發(fā)明方法監(jiān)控這些個(gè)體中CTGF和CTGF片段水平提供感染多種疾病相關(guān)炎癥后的診斷預(yù)測(cè)和監(jiān)控纖維化反應(yīng)的方法。
除了本文所示和所述的，通過(guò)上面的描述，本發(fā)明的多種修改對(duì)于精通本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然的。這些修改在附加權(quán)力要求范圍內(nèi)。
所有本文所引用的參考文獻(xiàn)全部納入供參考。
序列表<110>S.L.維茨(eitz，Stephen L)W.R.尤辛格(Usinger，William R)<120>測(cè)定結(jié)締組織生長(zhǎng)因子的方法<130>FP0812 US<150>US 60/323,305<151>2001-09-18<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1050<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atgaccgccg ccagtatggg ccccgtccgc gtcgccttcg tggtcctcct cgccctctgc 60agccggccgg ccgtcggcca gaactgcagc gggccgtgcc ggtgcccgga cgagccggcg 120ccgcgctgcc cggcgggcgt gagcctcgtg ctggacggct gcggctgctg ccgcgtctgc 180gccaagcagc tgggcgagct gtgcaccgag cgcgacccct gcgacccgca caagggcctc 240ttctgtgact tcggctcccc ggccaaccgc aagatcggcg tgtgcaccgc caaagatggt 300gctccctgca tcttcggtgg tacggtgtac cgcagcggag agtccttcca gagcagctgc 360aagtaccagt gcacgtgcct ggacggggcg gtgggctgca tgcccctgtg cagcatggac 420gttcgtctgc ccagccctga ctgccccttc ccgaggaggg tcaagctgcc cgggaaatgc 480tgcgaggagt gggtgtgtga cgagcccaag gaccaaaccg tggttgggcc tgccctcgcg 540gcttaccgac tggaagacac gtttggccca gacccaacta tgattagagc caactgcctg 600gtccagacca cagagtggag cgcctgttcc aagacctgtg ggatgggcat ctccacccgg 660gttaccaatg acaacgcctc ctgcaggcta gagaagcaga gccgcctgtg catggtcagg 720ccttgcgaag ctgacctgga agagaacatt aagaagggca aaaagtgcat ccgtactccc 780aaaatctcca agcctatcaa gtttgagctt tctggctgca ccagcatgaa gacataccga 840gctaaattct gtggagtatg taccgacggc cgatgctgca ccccccacag aaccaccacc 900ctgccggtgg agttcaagtg ccctgacggc gaggtcatga agaagaacat gatgttcatc 960aagacctgtg cctgccatta caactgtccc ggagacaatg acatctttga atcgctgtac 1020tacaggaaga tgtacggaga catggcatga 1050
<210>2<211>349<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Val Arg Val Ala Phe Val Val Leu1 5 10 15Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Val Gly Gln Asn Cys Ser Gly Pro20 25 30Cys Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser35 40 45Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu50 55 60Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu65 70 75 80Phe Cys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val Cys Thr85 90 95Ala Lys Asp Gly Ala Pro Cys Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr Arg Ser100 105 110Gly Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp115 120 125Gly Ala Val Gly Cys Met Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro130 135 140Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys145 150 155 160Cys Glu Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gln Thr Val Val Gly165 170 175Pro Ala Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro180 185 190Thr Met Ile Arg Ala Asn Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala195 200 205
Cys Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp210 215 220Asn Ala Ser Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg225 230 235 240Pro Cys Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Cys245 250 255Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu Ser Gly260 265 270Cys Thr Ser Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys Thr275 280 285Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu290 295 300Phe Lys Cys Pro Asp Gly Glu Val Met Lys Lys Asm Met Met Phe Ile305 310 315 320Lys Thr Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe325 330 335Glu Ser Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala340 345<210>3<211>33<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3gctccgcccg cagtgggatc catgaccgcc gcc 33<210>4<211>30<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>4ggatccggat cctcatgcca tgtctccgta 30<210>5<211>349<212>PRT<213>Bos taurus
<400>5Met Ser Ala Thr Gly Leu Gly Pro Val Arg Cys Ala Phe Val Leu Leu1 5 10 15Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Ser Ser Gln Asp Cys Ser Ala Pro20 25 30Cys Gln Cys Pro Ala Gly Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser35 40 45Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu50 55 60Ser Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu65 70 75 80Phe Cys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val Cys Thr85 90 95Ala Lys Asp Gly Ala Pro Cys Val Phe Gly Gly Thr Val Tyr Gln Ser100 105 110Gly Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp115 120 125Gly Ser Val Gly Cys Val Pro Leu Cys Ser Val Asp Val Arg Leu Pro130 135 140Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys145 150 155 160Cys Glu Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Glu His Thr Val Val Gly165 170 175Pro Ala Leu Ala Ala Tyr Arg Pro Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro180 185 190Thr Met Ile Arg Ala Asn Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala195 200 205Cys Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp210 215 220Asn Ala Phe Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg
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Gln Cys Ala Ala Glu Ala Ala Pro His Cys Pro Ala Gly Val Ser Leu35 40 45Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu Gly50 55 60Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu Phe65 70 75 80Cys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val Cys Thr Ala85 90 95Lys Asp Gly Ala Pro Cys Val Phe Gly Gly Ser Val Tyr Arg Ser Gly100 105 110Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp Gly115 120 125Ala Val Gly Cys Val Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro Ser130 135 140Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys Cys145 150 155 160Lys Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Arg Thr Ala Val Gly Pro165 170175Ala Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro Thr180 185 190Met Met Arg Ala Asn Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala Cys195 200 205Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn210 215 220Thr Phe Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg Pro225 230 235 240Cys Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Cys Ile245 250 255Arg Thr Pro Lys Ile Ala Lys Pro Val Lys Phe Glu Leu Ser Gly Cys260 265 270
Thr Ser Val Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys Thr Asp275 280 285Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu Phe290 295 300Lys Cys Pro Asp Gly Glu Ile Met Lys Lys Asn Met Met Phe Ile Lys305 310 315 320Thr Cys Ala Cys His Tyr Asn Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe Glu325 330 335Ser Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala340 34權(quán)利要求
1.一種測(cè)量樣品中含CTGF N-末端片段的多肽水平的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在適于結(jié)合的條件下使樣品接觸特異性結(jié)合CTGF N-末端片段區(qū)域的第一試劑；(b)分離第一試劑；和(c)測(cè)量結(jié)合第一試劑的多肽水平。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一試劑與底物結(jié)合。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一試劑是抗體或其功能片段。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括(a)在適于結(jié)合的條件下加入第二試劑，第二試劑選自特異性結(jié)合第一試劑的試劑和特異性結(jié)合與第一試劑結(jié)合區(qū)域不同的CTGF區(qū)域的試劑；(b)除去未結(jié)合的第二試劑；(c)測(cè)量結(jié)合的第二試劑的量，其中結(jié)合的第二試劑的量對(duì)應(yīng)于樣品中含CTGFN-末端片段的多肽的水平。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二試劑附于可檢測(cè)標(biāo)記。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述可檢測(cè)標(biāo)記選自熒光團(tuán)、放射性同位素和酶綴合物。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二試劑特異性結(jié)合與第一試劑結(jié)合區(qū)域不同的CTGF區(qū)域，且其中所述第二試劑進(jìn)一步特異性結(jié)合CTGF N-末端片段區(qū)域。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二試劑特異性結(jié)合第一試劑，且其中所述第二試劑進(jìn)一步與含CTGF N-末端片段的多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合第一試劑。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二試劑特異性結(jié)合與第一試劑結(jié)合區(qū)域不同的CTGF區(qū)域，且其中所述第二試劑進(jìn)一步特異性結(jié)合CTGF C-末端片段區(qū)域。
10.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述第二試劑是抗體或其功能片段。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述第二試劑是任選連接載體的肝素。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述樣品獲自哺乳動(dòng)物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是人。
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，樣品選自尿或血漿。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括比較樣品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和CTGF N-末端片段的標(biāo)準(zhǔn)水平，其中，樣品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和CTGF N-末端片段標(biāo)準(zhǔn)水平間的差異指示CTGF相關(guān)疾病的存在。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述CTGF相關(guān)疾病選自腎纖維化、肝纖維化、心臟纖維化、炎性關(guān)節(jié)疾病、癌癥、糖尿病、硬皮病、器官移植、腹膜透析或心肌梗塞。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括比較第二個(gè)樣品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和第一個(gè)樣品中含CTGF N-末端片段的多肽水平，其中，第一個(gè)和第二個(gè)樣品在不同時(shí)間段獲自相同來(lái)源，第二個(gè)樣品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和第一個(gè)樣品中含CTGF N-末端片段的多肽水平間的差異指示含CTGF N-末端片段的多肽水平隨著時(shí)間的變化。
18.一種診斷CTGF相關(guān)疾病的方法，其特征在于，所述方法包括(a)測(cè)量受試者樣品中含CTGF N-末端片段的多肽水平；(b)比較樣品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和標(biāo)準(zhǔn)水平，其中，樣品中含CTGF N-末端片段的多肽量增加或減少指示CTGF相關(guān)疾病的存在。
19.一種預(yù)測(cè)CTGF相關(guān)疾病的方法，其特征在于，所述方法包括(a)測(cè)量受試者樣品中含CTGF N-末端片段的多肽水平；(b)比較樣品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和標(biāo)準(zhǔn)水平，其中，樣品中含CTGF N-末端片段的多肽量增加或減少指示CTGF相關(guān)疾病的存在。
20.一種監(jiān)控受試者中CTGF相關(guān)疾病進(jìn)展的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在第一個(gè)時(shí)間點(diǎn)從受試者中獲得第一個(gè)樣品；(b)在第二個(gè)時(shí)間點(diǎn)從受試者中獲得第二個(gè)樣品；(c)測(cè)量第一個(gè)和第二個(gè)樣品中含CTGF N-末端片段的多肽水平；(d)比較第一個(gè)樣品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和第二個(gè)樣品中含CTGFN-末端片段的多肽水平，其中，第一個(gè)樣品中含CTGF N-末端片段的多肽水平和第二個(gè)樣品中含CTGF N-末端片段的多肽水平間的差異指示CTGF相關(guān)疾病的進(jìn)展。
21.一種測(cè)量樣品中含CTGF C-末端片段的多肽水平的方法，其特征在于，所述方法包括(a)在適于結(jié)合的條件下使樣品接觸特異性結(jié)合CTGF C-末端片段區(qū)域的第一試劑；(b)分離第一試劑；(c)加入特異性結(jié)合與第一試劑結(jié)合區(qū)域不同的CTGF C-末端片段區(qū)域的第二試劑；(d)除去未結(jié)合的第二試劑；(e)測(cè)量結(jié)合的第二試劑的量。
22.一種檢測(cè)和測(cè)量樣品中CTGF的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含(a)特異性結(jié)合CTGF區(qū)域的第一試劑；(b)特異性結(jié)合與第一試劑結(jié)合區(qū)域不同的CTGF區(qū)域的第二試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測(cè)和測(cè)量結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的方法以及診斷和檢測(cè)多種CTGF相關(guān)疾病和紊亂。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1589403SQ02822853
公開(kāi)日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2002年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月18日
發(fā)明者S·L·維茨, W·R·尤辛格 申請(qǐng)人:法布羅根股份有限公司