一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白同源二聚體的定量裝置的制造方法
【專利摘要】一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白(HNL)同源二聚體的定量裝置,屬于免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。由5倍樣品稀釋液、25倍洗液、HNL同源二聚體標(biāo)準(zhǔn)品母液、抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)抗HNL抗體、U型底96孔板、封板膜、酶底物溶液及終止液組成。本發(fā)明酶標(biāo)板包被抗HNL抗體和酶標(biāo)抗HNL抗體為同一抗體,從而簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)了HNL同源二聚體濃度的定量。此外,本裝置使用過(guò)程中孵育只需兩步和清洗只需一步,從而顯著縮短了檢測(cè)時(shí)間。因此,本發(fā)明具有制備簡(jiǎn)單、使用方便及測(cè)試時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明可用于以HNL同源二聚體為標(biāo)志物的疾病(如急性細(xì)菌感染)的檢測(cè)和監(jiān)控,因此具有巨大的實(shí)驗(yàn)室研究和臨床應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白同源二聚體的定量裝置
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白(HNL)同 源二聚體的快速定量裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 人中性粒細(xì)胞脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(human neutrophil lipocalin,HNL)也稱中性粒細(xì) 胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase associated lipocalin,NGAL),又 稱脂質(zhì)運(yùn)載蛋白-2(Lipocalin-2),是一種脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(了上1〇1.〇16111.1993,268:10425-10432;Scand J.Clin丄ab· Invest · 1994,54:365-376) jNL以單體、同源二聚體及異源二聚 體(單體與MMP9分子形成)等多種分子形式存在,不同分子形式HNL與不同的病理過(guò)程有關(guān)。 如單體HNL可能與急性腎損傷有相對(duì)較高的相關(guān)性(Clin. Chim. Acta. 2009,403:121-125; Lancet 2005,365:1231-1238;Biomed.Res.Int.2015,2009,186:48-51; Am· J · Nephrol · 2004,24:307-315;中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥2015,24:46-47),異源二聚體HNL可能與腫 瘤侵襲性有關(guān)。蔡林君等人研究發(fā)現(xiàn)同源二聚體Η N L反映尿道感染情況 (Clin· J. Am. Soc .Nephrol · 2010);此外,Venge Per和Xu S.Y.等人研究發(fā)現(xiàn)同源二聚體HNL 對(duì)區(qū)分診斷急性細(xì)菌感染和病毒感染有很高的特異性和靈敏度(J. Immunol.Methods 2015,424:85-90 ;J. Clin .Lab .Invest .1995,55:125-131 )。相對(duì)其他分子形式 HNL,同源二 聚體對(duì)診斷急性細(xì)菌感染有較高的特異性和靈敏度,可能是因?yàn)閰⑴c急性細(xì)菌感染過(guò)程的 中性粒細(xì)胞分泌的HNL主要是同源二聚體(Clin. Chim. Acta. 2009,403:121-125)。
[0003] 目前已有多種HNL測(cè)定方法公開(kāi),如RIA(國(guó)際專利W0/1995/029404A1和中國(guó)ZL 200980155194等)、ELISA(歐洲專利EP 2225268和中國(guó)專利ZL200980155194等)、Western-blotting、膠乳免疫比濁法(中國(guó)專利ZL 201410431182)、化學(xué)發(fā)光免疫分析法(中國(guó)專利 申請(qǐng)?zhí)?01510184818)、免疫層析試紙條技術(shù)(中國(guó)專利ZL201220323587、ZL201420423962、 ZL201220392399、ZL201220497401、ZL201220323586 和 ZL201220497401)等。以上各種 HNL 定 量方法有各自優(yōu)缺點(diǎn)和相應(yīng)用途,但除Western-blotting能區(qū)分不同分子形式HNL外,上述 HNL定量方法均不能特異性定量同源二聚體HNL,從而影響該蛋白作為一些疾病如急性細(xì)菌 感染的診斷能力。雖然,Western-blotting能區(qū)分不同分子形式HNL,但是由于該技術(shù)本身 的缺陷限制了該方法的實(shí)際應(yīng)用。如操作復(fù)雜、測(cè)試周期長(zhǎng)、每次分析樣品數(shù)量有限以及準(zhǔn) 確定量困難等。
[0004] 綜上,目前實(shí)驗(yàn)室研究和將來(lái)可能的臨床應(yīng)用急需建立快速、特異性定量同源二 聚體HNL的裝置及相應(yīng)方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)人中性粒細(xì)胞載脂蛋白HNL同源二聚體分子的特異性定量,本發(fā)明設(shè)計(jì) 并開(kāi)發(fā)出了一種基于夾心ELISA技術(shù)的HNL同源二聚體的快速定量裝置。該裝置具有制備方 法簡(jiǎn)單(只需一種抗NHL抗體)、使用快捷(孵育過(guò)程只有兩步)、檢測(cè)限低(0.1ng/mL,能滿足 體液樣本中HNL的檢出)等優(yōu)異性能,在急性細(xì)菌感染等疾病早期診斷實(shí)驗(yàn)室研究和臨床檢 驗(yàn)領(lǐng)域有極大應(yīng)用潛力。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo),本發(fā)明采取如下技術(shù)方案:
[0007] 一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白(HNL)同源二聚體的定量裝置,其特征在于:由5倍樣 品稀釋液、25倍洗液、同源二聚體HNL標(biāo)準(zhǔn)品母液、抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)抗HNL 抗體溶液、U型底96孔板、封板膜、酶底物溶液及終止液組成,所述抗HNL抗體包被的96孔酶 標(biāo)板和酶標(biāo)抗HNL抗體所使用的抗HNL抗體完全相同;所述抗HNL抗體為單克隆抗體,所述抗 HNL單克隆抗體為商品化的抗HNL單克隆抗體(如Abeam公司的ab63929或P&M Venge Diagnostics Development公司的HNL mab 697等)或通過(guò)常規(guī)方法以HNL單體或HNL同源二 聚體免疫動(dòng)物制備的抗HNL單克隆抗體或基因工程方法制備的抗HNL單克隆抗體,所述抗 HNL單克隆抗體所識(shí)別的抗原表位在單體HNL上只有一個(gè);所述酶標(biāo)抗HNL抗體所標(biāo)記的酶 可以為辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等。
[0008] 所述定量裝置經(jīng)兩步法實(shí)現(xiàn)HNL同源二聚體的快速定量,所述兩步法是指裝置整 個(gè)使用過(guò)程中孵育過(guò)程只需兩次,所述兩次孵育過(guò)程第一次是指將酶標(biāo)抗HNL抗體加入到 抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板后快速加入預(yù)先準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液和經(jīng)稀釋后的樣 品液孵育20~60min,所述兩次孵育過(guò)程第二次是指第一次孵育后將抗HNL抗體包被的96孔 酶標(biāo)板經(jīng)洗液工作液清洗后再加入酶底物溶液孵育10~20min后加入終止液;所述預(yù)先準(zhǔn) 備的標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液是指HNL同源二聚體標(biāo)準(zhǔn)品母液經(jīng)2倍法稀釋后制成,所述經(jīng)稀釋 后的樣品液是指經(jīng)樣品稀釋液工作液稀釋后的體液樣本,所述體液樣本包括尿液、血清、血 漿、腦脊液、唾液等。
[0009] 將5倍樣品稀釋液用去離子水稀釋5倍獲得樣品稀釋液工作液;將25倍洗液用去離 子水稀釋25倍制成洗液工作液。
[0010] 本發(fā)明裝置組成、制備及使用方法如下:
[0011] 1)本發(fā)明裝置組成 [0012]表1:為本發(fā)明裝置組成 [0013]
[0014] 2)制備方法
[0015] a)抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板的制備 [0016] (1)抗HNL抗體包被96孔酶標(biāo)板
[0017] 將抗HNL抗體用50mmol/L Na2C〇3-NaHC〇3,pH 9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋到1~5yg/ mL制成抗體包被液;向96孔酶標(biāo)板每孔加入lOOyL抗體包被液,37°C孵育2h或室溫孵育4h或 4°C過(guò)夜。
[0018] (2)封閉酶標(biāo)板
[0019]棄抗體包被液,然后向上述96孔酶標(biāo)板每孔中加入200~300yL封閉液(封閉液為 含2%BSA(wt/vol)的50mmol/L Na2C〇3-NaHC〇3,pH 9.6的碳酸鈉緩沖液);37°C孵育2h或室 溫孵育4h或4°C過(guò)夜。
[0020] (3)固定酶標(biāo)板
[0021] 棄封閉液,然后向96孔酶標(biāo)板每孔中加入200~300yL固定液(固定液為含50 % (界1:/¥〇1)鹿糖、50%(¥1:/¥〇1)海藻糖或25%(¥1:/¥〇1)鹿糖和25%(¥1:/¥〇1)海藻糖的 50mmol/L Na2C03-NaHC03,pH 9.6的碳酸鈉緩沖液,室溫固定3〇11^11~211。
[0022] (4)密封酶標(biāo)板
[0023]棄固定液,室溫晾干或25~30 °C真空干燥;將酶標(biāo)板和袋裝干燥劑放入錫箱紙袋 內(nèi)然后抽真空,4 C保存;
[0024]通過(guò)以上方法制備的抗HNL抗體包被酶標(biāo)板經(jīng)過(guò)37 °C加速試驗(yàn),可以保存32天。根 據(jù)阿羅尼烏斯公式(Arrhenius equation),本方法制備的酶標(biāo)板在4°C條件下可以保存天 數(shù)= 32X48天= 1536天。
[0025] b)5倍樣品稀釋液的制備
[0026]為含有1 %BSA(wt/vol)、0 · 5 % Tween-20 (vol/vol)、0 · 25 % 十六烷基三甲基溴化 銨(CTAB) (wt/vol)和0.1 %NaN3(wt/vol)的磷酸根摩爾濃度為50mmol/L、pH 7.4的PBS緩沖 液。
[0027] c)標(biāo)準(zhǔn)品母液的制備
[0028]為含有0 · 1 %BSA(wt/vol)、0 · 1 %Tween_20(vol/vol)、0 · 05%十六烷基三甲基溴 化銨((7^8)(¥"¥〇1)、0.02%似犯(¥七八〇1)和12.8以8/1同源二聚體!11的磷酸根摩爾濃度 為 10mmol/L、pH 7.4的PBS緩沖液。
[0029] d)酶標(biāo)抗HNL抗體溶液的制備
[0030] 酶標(biāo)抗HNL抗體是通過(guò)常規(guī)的方法(Abeam的abl02850、abl02890、abl02887等)將 辣根過(guò)氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(ALP)等酶分子共價(jià)標(biāo)記在抗HNL抗體上。
[0031 ]酶標(biāo)抗HNL抗體溶液為含有1 %BSA(wt/vol)、0 · 1 %NaN3(wt/vol)和0 · 2~2yg/mL 酶標(biāo)抗HNL抗體的磷酸根摩爾濃度為50mmol/L、pH7.4的PBS緩沖液。
[0032] e) 25倍洗液的制備
[0033]為含有2·5%Tween-20(vol/vol)的磷酸根摩爾濃度為250mmol/L、pH 7·4的PBS緩 沖液。
[0034] f)酶底物溶液和終止液的制備
[0035]對(duì)應(yīng)酶標(biāo)抗HNL抗體所標(biāo)記的酶采用不同的酶底物溶液和終止液。該體系是已經(jīng) 公開(kāi)的常規(guī)方法。如表2。
[0036]表2:不同體系酶標(biāo)抗體、酶底物溶液及對(duì)應(yīng)終止液的組成
[0037]
[0038」3)使用萬(wàn)法
[0039] 裝置的具體使用步驟如下:
[0040] (1)取出上述制備的溶液、抗體包被的96孔酶標(biāo)板等,放置于室溫環(huán)境;
[0041] (2)將5倍樣品稀釋液和25倍洗液用蒸餾水分別稀釋5倍和25倍,制成樣品稀釋液 工作液和洗液工作液;
[0042] (3)將生物樣品(血清、血漿、尿液、唾液或腦脊液等)用樣品稀釋液工作液稀釋(血 清和血漿通常稀釋50倍、尿液通常稀釋25倍、唾液和腦脊液通常5~10倍稀釋),得到稀釋后 的樣品液;
[0043] (4)將同源二聚體HNL標(biāo)準(zhǔn)品母液用樣品稀釋液工作液進(jìn)行2倍梯度稀釋,制成標(biāo) 準(zhǔn)品濃度梯度溶液;
[0044] (5)將上述1 OOyL標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液和稀釋后的樣品液加至U型底96孔板;
[0045] (6)將50yL酶標(biāo)抗HNL抗體溶液加至抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板;
[0046] (7)用多道移液器取50yL步驟(5)制備的U型底96孔板每孔中的標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶 液和稀釋后的樣品液加至步驟(6)中的96孔酶標(biāo)板上;
[0047] (8)用封板膜蓋住96孔酶標(biāo)板,將96孔酶標(biāo)板放置于酶標(biāo)板震蕩器上,150~ 180rpm,室溫孵育20~60min;
[0048] (9)傾倒96孔酶標(biāo)板中的物質(zhì),用洗液工作液對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行3~5次清洗;
[0049] (10)向96孔酶標(biāo)板每孔中加入酶底物溶液100yL,避光條件下孵育10~20min;
[0050] (11)向96孔酶標(biāo)板每孔中加入終止液100yL,輕輕混勻,30min內(nèi)利用常規(guī)的分光 光度計(jì)測(cè)定450nm處的吸光值。
[00511 (12)以標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液的濃度值為橫縱標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液450nm處 的吸光值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品液的450nm處的吸光值計(jì)算出樣品 中同源二聚體HNL的濃度。
[0052]本發(fā)明根據(jù)夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)技術(shù)具有高通量、特異性強(qiáng)及普及率 高等優(yōu)點(diǎn),制造了一種基于ELISA的人中性粒細(xì)胞載脂蛋白同源二聚體(HNL)的快速定量裝 置。由于采用了上述技術(shù)方案,本發(fā)明在以下兩方面與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特 點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
[0053]第一,本發(fā)明根據(jù)HNL同源二聚體是由兩個(gè)相同的單體HNL形成的特點(diǎn),與單體HNL 相比,HNL同源二聚體有兩套相同的抗原表位,每個(gè)HNL同源二聚體可以和兩個(gè)完全相同的 抗體結(jié)合,而一個(gè)單體HNL只能和一個(gè)同樣抗體結(jié)合;另外,HNL異二聚體是一個(gè)HNL分子與 MMP9分子共價(jià)結(jié)合,因此一個(gè)HNL異二聚體也只有一個(gè)相同的抗原表位只能與一個(gè)分子的 同樣抗體結(jié)合。所以本發(fā)明采用相同的固相包被抗體和酶標(biāo)抗體構(gòu)建HNL ELISA檢測(cè)裝置, 該裝置特異性檢測(cè)出HNL同源二聚體,而對(duì)于HNL單體和異二聚體則不檢出(圖1)。本發(fā)明可 用于以HNL同源二聚體為標(biāo)志物的疾?。ㄈ缂毙约?xì)菌感染)的檢測(cè)和監(jiān)控,因此具有巨大的 實(shí)驗(yàn)室研究和臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0054]第二,考慮到常規(guī)ELISA操作步驟繁多,測(cè)試周期較長(zhǎng),而臨床實(shí)際應(yīng)用時(shí)需要快 速獲得目標(biāo)分子的濃度信息,因此本發(fā)明通過(guò)對(duì)固相抗體包被濃度、反應(yīng)試劑配方、酶標(biāo)抗 體濃度、孵育時(shí)間等多種因素進(jìn)行優(yōu)化,從而建立了兩步法檢測(cè)HNL同源二聚體的夾心 ELISA方法,整個(gè)使用過(guò)程中孵育只需兩步和清洗只需一步。從而使用本裝置具有制備簡(jiǎn) 單、使用快捷等優(yōu)點(diǎn),本裝置使用只需常規(guī)ELISA測(cè)試時(shí)間的1/4至1/3。這是本發(fā)明的另一 個(gè)具創(chuàng)造性發(fā)明。
【附圖說(shuō)明】
[0055] 圖1為本發(fā)明一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白(HNL)同源二聚體的定量裝置能特異性 快速定量HNL的原理圖。其中24代表用于抗體包被的96孔酶標(biāo)板的一個(gè)孔,25代表用于包被 96孔酶標(biāo)板的抗HNL抗體,26代表酶標(biāo)抗HNL抗體,27代表HNL同源二聚體,28代表HNL單體, 29代表HNL與MMP-9形成的異源二聚體;25和26所述的抗HNL抗體為同一抗體,且在HNL單體 上只有一個(gè)對(duì)應(yīng)的表位;HNL單體28、HNL同源二聚體27和異源二聚體29都能與包被在24上 的抗HNL抗體25結(jié)合,但由于28和29只有一個(gè)可與25特異性結(jié)合的表位,因此不能與26結(jié) 合,而HNL同源二聚體27因?yàn)榫哂袃蓚€(gè)相同的表位,因此除了一個(gè)與25結(jié)合外,還可以與抗 HNL酶標(biāo)抗體26特異性結(jié)合,從而26利用其上所標(biāo)記的酶催化酶底物溶液產(chǎn)生有色產(chǎn)物,進(jìn) 而利用分光光度計(jì)獲取特定波長(zhǎng)下產(chǎn)物的吸光度值。
[0056] 圖2為本發(fā)明一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白(HNL)同源二聚體的定量裝置的標(biāo)準(zhǔn)曲 線。
【具體實(shí)施方式】
[0057] 下面將用實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例是用于本發(fā)明的進(jìn)一步解釋而 不是對(duì)本發(fā)明的限定。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思和實(shí)質(zhì)進(jìn)行的具體變動(dòng)和潤(rùn)飾均屬于本發(fā)明要求 保護(hù)的范圍。
[0058] 實(shí)施例1: 一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白同源二聚體的定量裝置的組成
[0059] 本實(shí)施例裝置包含如下試劑和材料(見(jiàn)表3)。
[0060] 表3:實(shí)施例1裝置的組成
[0061]
'[0062] 實(shí)施例2^ -種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白同源二聚體的定量裝置的組成 '
[0063]本實(shí)施例裝置包含如下試劑和材料(見(jiàn)表4)。
[0064] 表4:實(shí)施例2裝置的組成
[0065]
[0066] 實(shí)施例3-種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白同源二聚體的定量裝置的抗HNL抗體包被的 96孔酶標(biāo)板的制備
[0067] 以實(shí)施例1所包含的抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板為例來(lái)說(shuō)明抗HNL抗體包被的96 孔酶標(biāo)板的制備步驟。具體步驟如下:
[0068] (1)抗HNL抗體包被96孔酶標(biāo)板
[0069] 將抗HNL單克隆抗體(Abeam公司的ab23477)用50mmol/L Na2C〇3_NaHC〇3,pH 9.6的 碳酸鈉緩沖液稀釋到lyg/mL制成抗體包被液;向96孔酶標(biāo)板(NuncMaxiS<Dr_p?flat-bottom 96we 11 p lat e)每孔加100μ]^)?體包被液;4 °C過(guò)夜。
[0070] (2)封閉酶標(biāo)板
[0071]棄抗體包被液;向96孔酶標(biāo)板每孔加300yL封閉液(封閉液為含2%BSA(wt/v〇l)的 50mmol/L Na2C〇3-NaHC〇3,pH 9.6的碳酸鈉緩沖液);37°(:孵育211。
[0072] (3)固定酶標(biāo)板
[0073]棄固定液;向96孔酶標(biāo)板每孔加300yL固定液(固定液為含50 % (wt/vol)的蔗糖的 50mmol/L Na2C03-NaHC03,pH=9.6的碳酸鈉緩沖液;室溫固定lh;
[0074] (4)密封酶標(biāo)板
[0075]棄固定液液,25°C真空干燥;將酶標(biāo)板和袋裝干燥劑放入錫箱是袋內(nèi)然后抽真空, 4°C保存。
[0076]實(shí)施例4: 一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白同源二聚體的定量裝置的酶標(biāo)抗HNL抗體的 制備
[0077]本實(shí)施例以實(shí)施例1所包含的HRP-抗HNL抗體為例來(lái)說(shuō)明酶標(biāo)抗HNL抗體的制備步 驟。本實(shí)施例采用過(guò)碘酸鈉法將HRP與抗HNL單克隆抗體(Abeam公司的ab23477)共價(jià)連接制 成酶標(biāo)抗HNL抗體。具體步驟如下:
[0078] (1)配制各種緩沖液
[0079] a.0. lmol/L高鵬酸鈉(NalCU)溶液:稱取241mg NalCU溶于10mL蒸饋水中。
[0080] b. lmmol/L、pH = 4.4的醋酸鈉(NaAc)緩沖液:取0.2mol/L NaAc(1.361 克/50mL) 3 · 7mL、0 · 2mo 1 /L醋酸(HAc)溶液(0 · 60 lmL/50mL) 6 · 3mL,加蒸餾水至 2000mL。
[0081 ] c.0.2mol/L、pH9.5碳酸鹽緩沖液:Na2C03 0.32克、NaH⑶3 0.586克,加蒸餾水至 50mL〇
[0082] d. 0.01mol/L、pH9.5碳酸鹽緩沖液:0.2mol/L、pH9.5碳酸鹽緩沖液用蒸餾水作20 倍稀釋,即成〇 · 01mol/L、pH9 · 5碳酸鹽緩沖液。
[0083] e. 4mg/mL硼氫化鈉(NaBH4)溶液:使用時(shí)稱取NaBH4 4mg溶于lmL蒸餾水中。
[0084] f.0.1m〇l/L、pH7.4的PBS緩沖液:NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HP〇4.12H2〇 3.58g、KH2P〇4 0.24g、蒸餾水溶解定容至100毫升。
[0085] g.酶標(biāo)抗體保存緩沖液:將0. lmol/L、pH7.4的PBS緩沖液用蒸餾水稀釋10倍得到 0.01111〇1/1、?!17.4的?85緩沖液,加入0.2%85厶(¥七八〇1)、0.1%丁¥6611-20(¥〇1八〇1)及 0 · 02%NaN3(wt/vol)。
[0086] (2)酶標(biāo)抗體制備
[0087] a.稱取5mg HRP(Sigma公司,V900503)溶解于lmL蒸餾水中。
[0088] b.加入0.2mL新配的0· lmol/L NalCU溶液,室溫下避光攪拌20min。
[0089] c.將上述溶液裝入透析袋中,用lmmol/L、pH=4.4的醋酸鈉緩沖液透析,4°C過(guò)夜。
[0090] d ·加20μ1的0 · 2mol/L、pH= 9 · 5碳酸鹽緩沖液,使以上醛化HRP的pH升高到9 · 5,立 即加入lmL、5mg/mL抗HNL單克隆抗體(Abeam公司的ab23477)0.01M碳酸鹽緩沖液中,室溫避 光輕輕攪拌2h。
[0091] e.加 O.lmL新配的4mg/mL NaBH4液,混勻,再置4°C、2h。
[0092] f.將上述溶液液裝入透析袋中,用0. lmol/L的PBS溶液透析,4°C、過(guò)夜。
[0093] g.將透析袋里的抗體稀釋在含酶標(biāo)抗體保存緩沖液。
[0094] h·計(jì)算酶標(biāo)抗體濃度:HRP-抗HNL抗體量(mg/mL) = (0D280nm-0D403nmX 0 · 3) X 0.62〇
[0095] i .將HRP-抗HNL抗體配制成lmg/mL,分裝保存在-20~-80 °C環(huán)境;使用時(shí)將HRP-抗 HNL抗體用樣品稀釋液稀釋至0.5yg/mL。
[0096] 實(shí)施例5: -種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白同源二聚體的定量裝置的使用
[0097] 現(xiàn)以實(shí)施例1裝置的使用為例說(shuō)明本裝置的具體使用步驟。
[0098] (1)取出上述制備的溶液、抗體包被的96孔酶標(biāo)板等,放置于室溫環(huán)境平衡;
[0099] (2)將5倍樣品稀釋液和25倍洗液用蒸餾水分別稀釋5倍和25倍,制成樣品稀釋液 工作液和洗液工作液。
[0100] (3)將生物樣品如尿液用樣品稀釋液工作液稀釋25倍,得到稀釋后的樣品液。
[0101] (4)將同源二聚體HNL標(biāo)準(zhǔn)品母液用樣品稀釋液工作液進(jìn)行2倍法梯度稀釋,制成 標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液。
[0102] (5)將上述梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液和稀釋后的樣品液各100yL至U型底96孔 板。
[0103] (6)將50yL HRP-抗HNL抗體加至96孔酶標(biāo)板。
[0104] (7)用多道移液器取50yL步驟(5)制備的U型底96孔板中的標(biāo)準(zhǔn)品梯度、相應(yīng)對(duì)照 溶液及樣品至步驟(6)中的96孔酶標(biāo)板上。
[0105] (8)用封板膜蓋住96孔酶標(biāo)板,將酶標(biāo)板放置于酶標(biāo)板震蕩器上,180rpm,室溫孵 育30min。
[0106] (9)傾倒酶標(biāo)板中的物質(zhì),用洗液工作液對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行3次清洗,最后一次清洗后 將酶標(biāo)板倒扣在吸水濾紙上l〇s。
[0107] (10)在清洗結(jié)束前,將TMB底物溶液A和TMB底物溶液B分別通過(guò)顛倒試劑瓶混勻, 取等體積溶液A和溶液B混勻制成TMB底物工作液。
[0108] (11)加入100yL TMB底物工作液至96孔酶標(biāo)板,蓋上封板膜和錫箱紙,孵育15min;
[0109] (12)加入100yL、2mol/L H2S〇4的終止液,輕輕混勻30S,30min內(nèi)利用常規(guī)的分光光 度計(jì)以540nm波長(zhǎng)為參考、讀取450nm波長(zhǎng)下的吸光值。
[0110] (13)以濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線趨勢(shì)線公式 計(jì)算樣品中HNL濃度。
[0111] 表5為實(shí)施例5裝置測(cè)得的各濃度同源二聚體HNL標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的450nm波長(zhǎng)下的吸 光度值,根據(jù)表5繪制參考標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)
[0112] 表5:不同濃度同源二聚體HNL標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液對(duì)應(yīng)的450nm波長(zhǎng)處的吸光度 值
[0113]
[0114]
[0115] 由表5可以得出本裝置定量同源二聚體的濃度可低至0.1ng/mL,結(jié)合圖1可以得出 本裝置定量同源二聚體的線性范圍為〇. lng .mL~6.4ng/mL。
[0116] 本實(shí)施例裝置的批內(nèi)差異CV平均值為4.31% (范圍0.54%~7.40%,n = 12),批間 差異CV平均值為7.96% (范圍為1.69%~12.50%,n = 3)。
[0117] 通過(guò)向已知同源二聚體濃度(Co)的尿液中加入已知濃度(&)的同源二聚體HNL、單 體HNL及MMP9/HNL,利用本實(shí)施例獲得尿溶液中的同源二聚體HNL的測(cè)定值濃度(C 2);理論 值濃度為C3。根據(jù)公式(1)回收率1 ( % ) =C3 + C2 X 100%和公式(2)回收率2( % ) = (C2-C〇) + Cl X 100 %計(jì)算得到以上分子在尿樣中的回收率(表6)。
[0118] 表6: HNL同源二聚體、HNL單體及MMP9/HNL在尿液中的回收率
[0119]
[0120] 表6數(shù)據(jù)顯示本裝置能特異性定量尿液樣本中的HN同源二聚體L,而對(duì)HNL單體和 HNL異源二聚體則幾乎不檢出。由此可以得出本方法具有很高的特異性和靈敏度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白HNL同源二聚體的定量裝置,其特征在于:由5倍樣品稀 釋液、25倍洗液、HNL同源二聚體標(biāo)準(zhǔn)品母液、抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)抗HNL抗體 溶液、U型底96孔板、封板膜、酶底物溶液及終止液組成,所述抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板 和酶標(biāo)抗HNL抗體所使用的抗HNL抗體完全相同,為單克隆抗體;所述酶標(biāo)抗HNL抗體的酶為 辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶;所述定量裝置經(jīng)兩步法實(shí)現(xiàn)HNL同源二聚體的快速定量,所 述兩步法是指裝置整個(gè)使用過(guò)程中孵育過(guò)程只需兩次,所述兩次孵育過(guò)程第一次是指將酶 標(biāo)抗HNL抗體加入到抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板后快速加入預(yù)先準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度 溶液和經(jīng)稀釋后的樣品液孵育20~60min,所述兩次孵育過(guò)程第二次是指第一次孵育后將 抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板經(jīng)洗液工作液清洗后再加入酶底物溶液孵育10~20min后加 入終止液;所述預(yù)先準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液是指HNL同源二聚體標(biāo)準(zhǔn)品母液經(jīng)2倍法稀 釋后制成,所述經(jīng)稀釋后的樣品液是指經(jīng)樣品稀釋液工作液稀釋后的體液樣本,所述體液 樣本包括尿液、血清、血漿、腦脊液或唾液; 將5倍樣品稀釋液用去離子水稀釋5倍獲得樣品稀釋液工作液;將25倍洗液用去離子水 稀釋25倍制成洗液工作液。2. 如權(quán)利要求1所述的一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白HNL同源二聚體的定量裝置,其特征 在于:所述抗HNL單克隆抗體為商品化的抗HNL單克隆抗體或通過(guò)常規(guī)方法以HNL單體或HNL 同源二聚體免疫動(dòng)物制備的抗HNL單克隆抗體或基因工程方法制備的抗HNL單克隆抗體,所 述抗HNL單克隆抗體所識(shí)別的抗原表位在單體HNL上只有一個(gè)。3. 如權(quán)利要求1所述的一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白HNL同源二聚體的定量裝置,其特征 在于:抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板是由如下步驟制備得到, (1) 抗HNL抗體包被96孔酶標(biāo)板 將抗HNL抗體用50mmol/L Na2⑶3-NaHC03,pH 9.6的碳酸鈉緩沖液稀釋到1~5以8/!1^制 成抗體包被液;向96孔酶標(biāo)板每孔中加入100yL抗體包被液,37°C孵育2h、室溫孵育4h或4°C 過(guò)夜; (2) 封閉酶標(biāo)板 棄抗體包被液,然后向上述96孔酶標(biāo)板每孔中加入200~300yL封閉液,封閉液為含2 % BSA(wt/vol)的50mmol/L Na2C03-NaHC03,pH 9.6的碳酸鈉緩沖液;37°C孵育2h、室溫孵育4h 或4°C過(guò)夜; (3) 固定酶標(biāo)板 棄封閉液,然后向96孔酶標(biāo)板每孔中加入200~300yL固定液,固定液為含50 % (wt/ 乂〇1)鹿糖、50%(*1:八〇1)海藻糖或25%(¥1:八〇1)鹿糖和25%(¥1:八〇1)海藻糖的501]11]1〇1凡 Na2C03-NaHC03,pH 9.6的碳酸鈉緩沖液,室溫固定30min~2h; (4) 密封酶標(biāo)板 棄固定液,室溫晾干或25~30 °C真空干燥;將酶標(biāo)板和袋裝干燥劑放入錫箱紙袋內(nèi)然 后抽真空,4 C保存。4. 如權(quán)利要求1所述的一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白HNL同源二聚體的定量裝置,其特征 在于:5倍樣品稀釋液為含有1%834(¥丨八〇1)、0.5%了¥6611-20(¥〇1八〇1)、0.25%十六烷基 三甲基溴化銨(CTAB) (wt/vol)和0.1 %NaN3(wt/vol)的磷酸根摩爾濃度為50mmol/L、pH 7.4的PBS緩沖液。5. 如權(quán)利要求1所述的一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白HNL同源二聚體的定量裝置,其特征 在于:標(biāo)準(zhǔn)品母液為含有〇 · 1 % BSA(wt/vo 1)、0 · 1 % Tween-20 (vo 1 /vo 1)、0 · 05 %十六烷基三 甲基溴化銨((^13)(¥1:八〇1)、0.02%似此(¥1:八〇1)和12.8以8凡圓1^同源二聚體的磷酸根摩 爾濃度為10臟〇1/1^!17.4的?83緩沖液。6. 如權(quán)利要求1所述的一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白HNL同源二聚體的定量裝置,其特征 在于:酶標(biāo)抗HNL抗體是將辣根氧化物酶HRP或堿性磷酸酶ALP共價(jià)標(biāo)記在抗HNL抗體上,酶 標(biāo)抗HNL抗體溶液為含有1 %BSA(wt/vol)、0.1 %NaN3(wt/vol)和0.2~2yg/mL酶標(biāo)抗HNL抗 體的磷酸根摩爾濃度為50mmol/L、pH7.4的PBS緩沖液。7. 如權(quán)利要求1所述的一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白HNL同源二聚體的定量裝置,其特征 在于:25倍洗液為含有2.5%Tween_20(vol/vol)的磷酸根摩爾濃度為250mmol/L、pH 7.4的 PBS緩沖液。8. 如權(quán)利要求1~7任何一項(xiàng)所述的一種人中性粒細(xì)胞載脂蛋白HNL同源二聚體的定量 裝置,其特征在于:具體使用步驟如下, (1) 取出各個(gè)溶液以及抗體包被的96孔酶標(biāo)板,放置于室溫環(huán)境; (2) 將5倍樣品稀釋液和25倍洗液用蒸餾水分別稀釋5倍和25倍,制成樣品稀釋液工作 液和洗液工作液; (3) 將生物樣品用樣品稀釋液工作液稀釋,得到稀釋后的樣品液; (4) 將同源二聚體HNL標(biāo)準(zhǔn)品母液用樣品稀釋液工作液進(jìn)行2倍梯度稀釋,制成標(biāo)準(zhǔn)品 濃度梯度溶液; (5) 將上述100yL標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液和稀釋后的樣品液加至U型底96孔板; (6) 將50yL酶標(biāo)抗HNL抗體溶液加至抗HNL抗體包被的96孔酶標(biāo)板; (7) 用多道移液器取50yL步驟(5)制備的U型底96孔板每孔中的標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液和 稀釋后的樣品液加至步驟(6)中的96孔酶標(biāo)板上; (8) 用封板膜蓋住96孔酶標(biāo)板,將96孔酶標(biāo)板放置于酶標(biāo)板震蕩器上,150~180rpm,室 溫孵育20~60min; (9) 傾倒96孔酶標(biāo)板中的物質(zhì),用洗液工作液對(duì)酶標(biāo)板進(jìn)行3~5次清洗;(10)向96孔酶 標(biāo)板每孔中加入酶底物溶液l〇〇yL,避光條件下孵育10~20min; (11) 向96孔酶標(biāo)板每孔中加入終止液100yL,輕輕混勻,30min內(nèi)利用常規(guī)的分光光度 計(jì)測(cè)定450nm處的吸光值; (12) 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液的濃度值為橫縱標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品濃度梯度溶液450nm處的吸 光值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品液的450nm處的吸光值計(jì)算出樣品中同 源二聚體HNL的濃度。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105974128SQ201610404148
【公開(kāi)日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月12日
【發(fā)明人】蔡林君, 姜春來(lái), 孔維
【申請(qǐng)人】吉林大學(xué)