專利名稱：利用內皮細胞特異性的、細胞周期依賴性的活性化合物對腫瘤進行基因治療的制作方法
技術領域：
本發(fā)明描述了用于腫瘤基因治療的DNA序列。所述DNA序列的基本組成元件包括激活物序列、啟動子組件和編碼活性物質的基因。
激活物序列在增生的內皮細胞或與所述內皮細胞毗連的細胞中以細胞特異性方式被激活。
該激活過程以細胞周期特異性方式受到啟動子組件的調節(jié)。
所述活性物質是血管生成的抑制劑，或是細胞生長抑制分子或細胞毒性分子。將所述DNA序列插入病毒或非病毒載體中，所述載體已被增加了一個與激活的內皮細胞有親和力的配體。1.腫瘤生長與血管生成許多抗腫瘤活性化合物抗腫瘤的活性不足至少在某種程度上可以從下列事實得到解釋腫瘤塊中的腫瘤細胞不能與抗腫瘤活性化合物，尤其是高分子量的活性物質接近(Burrows等人，藥物治療64，155(1994)，Baxter等人，微血管研究41，5(1991))。這類活性化合物為了能接觸到每個腫瘤細胞，它們必須通過血管內皮和基底膜及通過腫瘤基質和腫瘤實質進行擴散。這一擴散程度基本上取決于活性化合物的濃度或濃度梯度及其理化特性。然而，由腫瘤內部高壓所導致的向外對流作用(Burrows等人，微血管研究41，5(1991))正好與上述擴散作用方向相反。
因為即使是對于高分子量活性化合物而言腫瘤血管也是可以接近的，所以早期就有人提出利用腫瘤誘導的血管生成進行腫瘤治療(Denekamp，應用微循環(huán)進展4，28，1984，Denekamp，癌癥主題6，6 1986，Denekamp，癌轉移評論9，267，1990，Denekamp，英國放射學雜志，66，181，1993)。
因此，人們試圖利用抑制血管生成的物質抑制腫瘤生長(Bicknell癌癥生物學研討會，3，399(1992))。動物研究實驗表明，全身性施用抑制血管生成的物質也能夠抑制腫瘤增生。這可以應用于例如蘇拉明(Gagliardi等人，癌癥研究52，5073(1992))、肝素/甾族化合物共軛物(Thorpe等人，癌癥研究53，3000(1993))、O-(氯乙酰甲氨?；?煙曲霉醇(fumigillol)(Yamaoka等人，癌癥研究53，4262(1993))、抗血管生成素的單克隆抗體(Olson等人，癌癥研究54，4576(1994))和血管抑制素(angiostatin)(O’Reilly等人，細胞79，315(1994))。
然而，上述方法具有血管生成抑制劑全身性、非腫瘤特異性作用的缺陷，一旦出現(xiàn)副作用和新的腫瘤生長的危險，治療就得中止。
作為另一種選擇，設想通過損害內皮細胞來阻止對腫瘤的血流供應，使得腫瘤壞死(Denekamp，英國放射學雜志，66，181(1993))。根據(jù)上述設想提出施用與抗體偶聯(lián)的毒素、細胞生長抑制劑或同位素。這些抗體對與腫瘤相關性的血管內皮是有特異性的。其目的在于所述抗體共軛物可以內皮細胞特異性方式損害腫瘤相關性血管，并因此誘導腫瘤壞死(Burrows等人，藥物治療64，155(1994))。
所提出的更進一步的建議是通過特異性抗體方式將血栓形成物質、細胞因子或化學因子與腫瘤相關性內皮細胞結合，并通過籍此引發(fā)的血凝作用、炎癥或免疫調節(jié)作用對腫瘤生長施加影響。類似的效果在通過帶有轉導內皮細胞之DNA的內皮細胞特異性抗體的方式將DNA導入內皮細胞，以分泌炎性物質或免疫調節(jié)物質或影響腫瘤生長的物質的方案中也觀察得到(Burrows等人，藥物治療64，155(1994))。
內皮細胞表面上的膜抗原被提議作為制備具有所述特性之抗體的抗原。這些抗原包括例如endoglin、內皮唾酸蛋白、p96二體、VEGF受體、PDGF受體、尿激酶(uPA)受體及多種粘著分子(Burrows等人，藥物治療64，155(1994))。
然而，所有這些膜抗原所具有的一個特性是其至少以相對低的濃度還存在于非增生性內皮細胞上。由于即使在患腫瘤的生物體中非增生性內皮細胞的數(shù)量遠遠超過增生性內皮細胞，因此這并不足以保證通過施用抗體共軛物所尋求的腫瘤特異性效果的要求。2.活性化合物的描述本發(fā)明涉及一種活性化合物(即一種藥物)，它可以經局部和全身施用于腫瘤患者，并在腫瘤生長部位即使不是完全地也是主要地引起內皮細胞的增生，并在相對長的一段時期內使血管生成受抑，誘導炎癥形成，或直接或間接地產生細胞生長抑制物，籍此抑制腫瘤生長。
所述活性化合物的中心成分是一個由下列元件組成的DNA構建體

(在本申請全文中，DNA是包括互補DNA(cDNA)和基因組DNA序列的通用術語)。2.1激活物序列的選擇激活物序列應理解為與轉錄因子發(fā)生相互作用的一段核苷酸序列(啟動子序列或增強子序列)，所述作用在內皮細胞中或者另外在與增生的內皮細胞緊鄰的細胞中產生或激活。a)在內皮細胞中激活的激活物序列CMV增強子、CMV啟動子(EP0173177B1)、SV40啟動子或本領域技術人員已知的任何其它啟動子序列或增強子序列都可以用作激活物序列。
然而，在本發(fā)明所包括的含義范圍內，優(yōu)選的激活物序列包括那些來自基因的基因調節(jié)序列或元件，所述基因編碼尤其是在內皮細胞中可以檢測的(或者另外也在與增生的內皮細胞緊鄰的細胞中也可以檢測到的)蛋白質。
Burrows等人(藥物治療64，155(1994))和Plate等人(腦病理4，207(1994))已描述過上述的一些蛋白質，這些內皮細胞特異性蛋白質的具體例子有-腦特異性內皮細胞葡萄糖-1轉運因子腦的內皮細胞因能很強地表達所述轉運因子以將D-葡萄糖有效地經內皮細胞轉入腦中而引人注意(Gerhart等人，神經科學研究雜志22，464(1989))，該啟動子序列已由Murakami等人描述過(生物化學雜志267，9300(1992))。-endoglinendoglin似乎是TGFβ的非信號傳遞受體(Gougos等人，生物化學雜志265，8361(1990)，Cheifetz，生物化學雜志267，19027(1992)，Moren等人，BBRC 189，356(1992))。其少量地存在于正常內皮細胞上，而在增生的內皮細胞上表現(xiàn)為一定增強程度(Westphal等人，皮膚研究雜志100，27(1993)，Burrows等人，藥物治療65，155(1994))。Bellon等人(歐洲免疫學雜志23，2340(1993))和Ge等人(基因138，201(1994))已描述了該啟動子序列。-VEGF受體有兩種不同的受體(Plate等人，國際癌癥雜志，59，520(1994))*VEGF受體1(flt-1)(de Vries等人，科學255，989(1992)(在胞質部分含有fms樣酪氨酸激酶)*VEGF受體2(flk-1，KDR)(Terman等人，BBRC 187，1579(1992))(在胞質部分含有酪氨酸激酶)兩種受體幾乎無一例外地存在于內皮細胞上(Senger等人，癌轉移評述12，303(1993))。-其它的內皮細胞特異性受體酪氨酸激酶
*til-1或til-2(Partanen等人，分子細胞生物學12，1698(1992)，Schniirch和Risau，開發(fā)119，957(1993)，Dumont等人，致癌基因7，1471(1992))*B61受體(Eck受體)(Bartley等人，自然368，558(1994)，Pandey等人，科學268，567(1995)，van der Geer等人，細胞生物學年鑒10，251(1994))-B61B61分子表示B61受體的配體。(Holzman等人，美國Nephrol學會雜志4，466(1993)，Bartley等人，自然368，558(1994))-內皮縮血管肽，尤其是*內皮縮血管肽B(Oreilly等人，心血管藥物，22，18(1993)，Benatti等人，臨床研究雜志91，1149(1993)，O’Reilly等人，BBRC193，834(1993))。
該啟動子序列已由Benatti等人描述過(J.Clin.Invest.91，1149(1993))。
*內皮縮血管肽1(Yanasigawa等人，自然332，411(1988)。
該啟動子序列已由Wilson等人描述(分子細胞生物學10，4654(1990))。-內皮縮血管肽受體，尤其是內皮縮血管肽B受體。
(Webb等人，分子藥物學47，730(1995)，Haendler等人，心血管藥物20，1(1992))。-甘露糖-6-磷酸受體(Perales等人，歐洲生物化學雜志226，225(1994)。
該啟動子序列已被描述過(Ludwig等人，基因142，311(1994)，Oshima等人，生物化學雜志263，2553(1988)和Pohlmann等人，PNAS美國84，5575(1987))。-von Willebrand因子該啟動子序列已被描述過(Jahroudi and Lynch分子細胞生物學，14，999(1994)，F(xiàn)erreira等人，生物化學雜志293，641(1993)和Aird等人，PNAS美國92，4567(1995))。-IL-1α和IL-1βIL-1由激活的內皮細胞產生(Warner等人，免疫學雜志139，1911(1987))。
該啟動子序列已被描述過(Hangen等人，分子心臟學2，68(1986)，Turner等人，免疫學雜志143，3556(1989)，F(xiàn)enton等人，免疫學雜志138，3972(1987)，Bensi等人，細胞生長系統(tǒng)，1，491(1990)，Hiscott等人，分子細胞生物學13，6231(1993)和Mori等人，血液84，1688(1994))。-IL-1受體該啟動子序列已被描述過(Ye等人，PNAS美國90，2295(1993))。-血管細胞粘著分子(VCAM-1)VCAM-1在內皮細胞中的表達受下列因子激活脂多糖，TNF-α(Neish等人，分子細胞生物學15，2558(1995))，IL-4(lademarco等人，臨床研究雜志95，264(1995))，IL-1(Marni等人，臨床研究雜志92，1866(1993))。
VCAM-1的啟動子序列已被描述過(Neish等人，分子細胞生物學15，2558(1995)，Ahmad等人，生物化學雜志270，8976(1995)，Neish等人，實驗醫(yī)學雜志176，1583(1992)，lademarco等人，生物化學雜志267，16323(1992)和Cybulsky等人，PNAS美國88，7859(1991))。-合成的激活物序列作為天然內皮細胞特異性啟動子的另一種選擇，還可以使用合成的激活物序列，其由用于結合轉錄因子的寡聚體化結合位點組成，在內皮細胞中具有優(yōu)先的或選擇活性。這類轉錄因子的一個例子是轉錄因子GATA-2，其在內皮縮血管肽1基因中的結合位點是5’-TTATCT-3’(Lee等人，生物化學266，16188(1991)，Dorfmann等人，生物化學雜志267，1279(1992)和Wilson等人，分子細胞生物學10，4854(1990))。b)在與激活的內皮細胞緊鄰的細胞中激活的激活物序列在內皮細胞增生的情況下，鄰接細胞可以通過處于開放狀態(tài)的緊密連接而接近血液大分子。由于功能和結構上的關系，激活的內皮細胞之鄰接細胞也是本發(fā)明意義上的靶細胞。-VEGFVEGF由與增生的內皮細胞緊鄰的各種細胞(如平滑肌細胞和腫瘤細胞)產生，尤其是在低氧條件下(Ferrara等人，內分泌評論13，18(1992)，Berse等人，細胞分子生物學3，211(1992)，F(xiàn)inkenzeller等人，BBRC 208，432(1995)，Tischer等人，BBRC 165，1198(1989)，Leung等人，科學246，1306(1989))。VEGF基因的基因調節(jié)序列是*VEGF基因的啟動子序列(5’側翼區(qū))(Michenko等人，細胞分子生物學研究40，35(1994)，Tischer等人，生物化學雜志266，11947(1991))或*VEGF基因的增強子序列(3’側翼區(qū))(Michenko等人，細胞分子生物學研究40，35(1994))或*c-Src基因(Mukhopadhyay等人，自然375，577(1995)，Bonham等人，致癌基因8，1973)，Parker等人，分子細胞生物學5，831(1985)，Anderson等人，分子細胞生物學5，1122(1985))或
*V-Src基因(Mukhodpadhyay等人，自然375，577(1995)，Anderson等人，分子細胞生物學5，1122(1985)，Gibbs等人，病毒學53，19(1985))-類固醇激素愛體及其啟動子元件(Truss和Beato，內分泌評論14，459(1993))，尤其是*鼠乳腺腫瘤病毒啟動子該啟動子在大多數(shù)細胞中由類固醇激活，例如，由糖皮質激素(Parks，等人，細胞8，87(1976)或由黃體制劑(Cato等人，歐洲分子生物學組織雜志5，2237(1986))激活。MMTV長末端重復區(qū)的啟動子區(qū)cDNA序列被描述過(Chalepakis等人，細胞53，371(1988)和Truss及Beato內分泌學評論14，459(1993))。2.2受體組件的選擇作為一個例子，細胞周期調節(jié)的啟動子組件可以理解為核苷酸序列CDE-CHR-Inr(參見下文)。該啟動子組件的基本功能是抑制細胞周期G0/G1期激活物序列的功能，并在S/G2期繼而在增生的細胞中引起細胞周期特異性的表達。
啟動子組件CDE-CHR-Inr是在對人cdc 25c啟動子的G2特異性表達的詳細研究過程中發(fā)現(xiàn)的。最開始的突破點是發(fā)現(xiàn)了負責在細胞周期G1期關閉啟動子的阻遏物元件(細胞周期依賴性元件，CDE)(Lucibello等人，歐洲生物學組織雜志14，132(1995))。借助基因組二甲基硫酸(DMS)足跡法和功能分析(圖1和圖2)，有可能證明CDE以G1特異性方式結合阻遏物(CDE結合因子，CDF)，并籍此在非增生(G0)細胞中對轉錄產生抑制作用。在其阻遏功能中，位于基礎啟動子區(qū)的CDE依賴于上游激活序列(UAS)。由此得出結論，CDE結合因子以細胞周期依賴性方式在非增生細胞中和處于細胞周期的G1期細胞中抑制5’結合激活物蛋白的轉錄激活作用(圖3)。
上述結論通過下面進一步的實驗得到證實，將非細胞周期調節(jié)的病毒早期SV40增強子與cdc25最小的啟動子(含有CDE和位于3’端的起始位點)融合將對所得嵌合啟動子產生明確的細胞周期調節(jié)作用(圖4)。隨后對cdc 25C增強子的研究表明，以細胞周期依賴性方式受到CDF調節(jié)的轉錄因子是NF-Y(同義詞CBF，Dorn等人，細胞50，863(1987)，van Huiisduijnen等人，歐洲生物學組織雜志9，3119(1990)，Coustry等人，生物化學雜志，270，468(1995))、Sp1(Kadonage等人，TIBS 11，10，(1986))和可能是新的并與CBS7結合的一種因子(CIF)。該研究其它令人感興趣的結果是觀察到cdc25C增強子中的NF-Y與至少一種另外的NF-Y復合物或與CIF有效地合作只能激活轉錄。NF-Y和Sp1兩者都屬于富含谷氨酰胺的一類激活物，能提供有關阻遏機理的重要信息(例如與特定的基礎轉錄因子或TAF的相互作用或干擾)。
對cdc 25C、細胞周期蛋白A和cdc2的啟動子序列進行比較，證明在數(shù)個區(qū)域存在同源性(圖5)。不僅僅CDE在所有3個啟動子中都是保守的(所存在的趨異不具有功能相關性)，而且鄰近的Yc盒也是保守的。正如所預料的，所有這些區(qū)域都抑制在體的蛋白質結合，而這一蛋白質結合過程在是CDE情況下為細胞周期依賴性的。另外，有可能證明所有3個啟動子通過CDE突變而去調節(jié)(表1)。在對cdc 25C、細胞周期蛋白質A和cdc2序列進行比較時發(fā)現(xiàn)，在CDE緊接3’的區(qū)域也存在明顯的相似性(細胞周期基因同源性區(qū)，CHR)(圖5)。盡管該區(qū)在功能上與CDE同樣重要(表1)，但在在體的DMS足跡法實驗中尚未觀察到。對此有一個可能的解釋是該因子與所述DNA小溝之間的相互作用。電泳遷移率移位測定(EMSA)實驗的結果表明，CDE和CHR一起結合蛋白質復合物CDF。這些觀測結果表明，富含谷氨酰胺的激活物通過CDF介導的阻遏作用是經常存在的細胞周期調節(jié)的轉錄作用的機理。
但是，很顯然，不僅CDE-CHR區(qū)對調節(jié)cdc 25C啟動子具有重要性，而且還包括基礎啟動子(位置≤-20至≥+30，參見圖1)核苷酸序列中的起始位點(位置+1)之一。包括YY-1體外結合位點在內的該區(qū)域突變(Seto和Shenk，自然354，241(1991)，Usheva和Shenk，細胞，76，1115(1994))將引起完全的去調節(jié)作用。鑒于CDE-CHR與基礎啟動子位置接近，因而就很可能發(fā)生CDF與基礎轉錄復合物間的相互作用。2.3抗腫瘤物質的選擇a)增生作用的抑制劑在本發(fā)明含義范圍內，抗腫瘤物質應理解為能夠抑制內皮細胞增生的蛋白質的DNA序列。所述DNA序列的例子包括下文所列參考文獻涉及的DNA序列-成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白(pRb/p110)或其類似物p107和p120(LaThangue，細胞生物學流行觀點6，443(1994))-p53蛋白(Prives等人，基因開發(fā)7，529(1993))-p21蛋白(WAF-1)(El-Deiry等人，細胞75，817(1993))-p16蛋白(Serrano等人，細胞366，704(1993)，Kamb等人，科學264，436(1994)，Nobori等人，自然368，753(1994))-其它的CdK抑制劑(Pines評述，TIBS 19，143(1995))-CADD45蛋白(Papathanasiou等人，分子細胞生物學11，1009(1991)，Smith等人，科學266，1376(1994))-bak蛋白(Farrow等人，自然374，731(1995)，Chittenden等人，自然374，733(1995)，Kiefer等人，自然374，736(1995))為了防止所述細胞周期抑制劑在細胞內迅速失活，應該優(yōu)先使用具有被表達蛋白質的失活位點發(fā)生突變而并不因此損害蛋白質功能的那些基因。
成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白(pRb)及其相關的p107和p130蛋白經磷酸化作用失活。結果，所使用的pRb/p110、p107或p130 cDNA序列是有點突變的，以使被編碼蛋白質的磷酸化位點用不能被磷酸化的氨基酸取代。
根據(jù)Hamel等人的描述(分子細胞生物學12，3431(1992))，當成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白(pRb/p110)氨基酸的246、350、601、605、780、786、787、800和804位被取代后其不再被磷酸化，而且，這些替代并不損害其與主要T抗原結合的活性。例如，在pRb/p110蛋白質中，用氨基酸Ala取代氨基酸Thr-256、Ser-601、Ser-605、Ser-780、Ser-786、Ser-787和Ser-800，用氨基酸Arg取代氨基酸Thr-350和用氨基酸Glu取代氨基酸Ser-804。
p107蛋白或p130蛋白的DNA序列以類似的方式進行突變。
p53蛋白是通過C末端392位絲氨酸的脫磷酸化的方式經與特定蛋白質(如MDM2)結合或經p53的寡聚而在細胞內失活(Schikawa等人，Leukemia和Lymphoma 11，21(1993)和Brown，腫瘤學年刊4，623(1993))。結果，優(yōu)先使用的p53 cDNA序列是通過去掉392位絲氨酸而將C端截平。
b)血管生成抑制劑抗腫瘤藥物進一步可理解為編碼可抑制血管生成之蛋白質的DNA序列。這些蛋白質(有關的DNA序列參考所引用的文獻)的具體例子有-纖溶酶原激活物抑制劑1(PAl-1)(Reilly等人，生物化學雜志265，9570(1990)，Bosma等人，生物化學雜志253，9219(1988))-PAl-2(Steven等人，歐洲生物化學雜志196，431(1991))-PAl-3(Meijers等人，生物化學雜志266，15028(1991))-血管抑制素(O’Reilly等人，細胞79，315(1994)，Bicknell等人，癌生物學研討會3，399(1992))-干擾素(Dorr，藥物45，177(1993)，今日藥物22，597(1986)，US4518584，US4588585)，*IFNα(Henco等人，分子生物學雜志185，227(1985)，Pestka等人，生物化學年鑒56，727(1987)，Weissmann等人，倫敦皇家學會哲學學報B299，7(1982)，Goeddel等人，自然290，20(1981))
*IFNβ(Sen等人，生物化學雜志267，5017(1992)，Mark等人，歐洲專利192811，歐洲專利234599，美國專利4588585)*IFNγ(Gray等人，自然295，503(1982)，Yip等人，PNAS美國79，1820(1982)，Rinderknecht等人，生物化學雜志259，6790(1984))-血小板因子4(Mc Manus等人，免疫學雜志123，2835(1979)；Brindley等人，臨床研究雜志72，1218(1983)；Deuel美國國家學術科學匯編78，4584，1981))-IL-12(Voest等人，國家癌癥研究所87，581(1995)，Wolf等人，免疫學雜志146，3074(1991)，Gubler等人，PNAS美國88，4143(1991)，Kobayashi等人，實驗醫(yī)學雜志170，827(1989)，Gabler等人，PNAS 88，4143(1991)，Gately等人，免疫學雜志147，874(1991)，Schoenhaut等人，免疫學雜志148，3433(1992)，Wolf等人，免疫學雜志146，3074(1991))-TIMP-1(Kolkenbrock等人，歐洲生物化學雜志198，775(1991)，F(xiàn)aucher等人，病理生物學37，199(1989))-TIMP-2(Kolkenbrock等人，歐洲生物化學雜志198，775(1991))-TIMP-3(Wick等人，生物化學雜志269，18953(1994))-白血病抑制因子(LIF)(Pepper等人，細胞科學雜志108，73(1995)，Gough等人，Ciba基金會座談會，167，24(1992)，PNAS美國85，5971(1988)，Stahl等人，生物化學雜志265，8833(1990)，Rathjan等人，細胞62，1105(1990))
c)細胞生長抑制蛋白和細胞毒性蛋白然而，抗腫瘤物質還可以理解為編碼一種直接或間接顯示對腫瘤具有細胞生長抑制作用之蛋白質的DNA序列。這些蛋白質尤其包括-穿孔素(Lin等人，今日免疫學16，194(1995))-粒酶(Smyth等人，今日免疫學16，202(1995))-IL-2(Fletscher等人，淋巴細胞活素研究6，45(1987)，Matsui等人，淋巴細胞活素12，1(1985)，Tanaguchi等人，自然302，305(1983))-IL-4(Lee等人，PNAS 83，2061(1986)；Paul，血液77，1859(1991)，Yokota等人，PNAS美國83，5894(1986)，van Leuven等人，血液73，1142(1989)，Arai等人，免疫學雜志42，274(1989))-IL-12(Kobayashi等人，實驗醫(yī)學雜志170，827(1989)，Gabler等人，PNAS 88，4143(1991)，Gately等人，免疫學雜志147，874(1991)，Schoenhaut等人，免疫學雜志148，3433(1992)，Wolf等人，免疫學雜志146，3074(1991))-干擾素，例如*IFN-α(Henco等人，分子生物學185，227(1985)，Pestka等人，生物化學年鑒56，727(1987)，Weissmann等人，倫敦皇家學會哲學學報B299，7(1982)，Goeddel等人，自然290，20(1981))*IFNβ(Sen等人，生物化學雜志267，5017(1992)，Mark等人歐洲專利192811，歐洲專利234599，美國專利4588585)
*IFNγ(Gray等人，自然295，503(1982)，Yip等人，PNAS美國79，1820(1982)，Rinderknecht等人，生物化學雜志259，6790(1984))-TNF(Porter TiBTech 9，158(1991)；Sidhu等人，藥物治療57，79(1993))，尤其是*TNFα(Beutler等人，自然320，584(1986)，Kriegler等人，細胞53，45(1988))*TNFβ(Gray等人，自然312，721(1984)，Li等人，免疫學雜志138，4496(1987)，Aggarwal等人，生物化學雜志260，2334(1985))-制瘤素M(Brown等人，免疫學雜志147，2175(1991)；Grove等人，生物化學雜志266，18194(1991)；Hamilton等人，生物化學、生物物理通訊180，652(1991)，Malik等人，分子細胞生物學9，2847(1989)，Kallstad等人，生物化學雜志266，8940(1991))d)炎癥誘導劑抗腫瘤物質進一步可以理解為編碼在適當?shù)臅r候除了抗腫瘤作用外還刺激形成炎癥，籍此消除腫瘤細胞之蛋白質的DNA序列。這些蛋白質的具體例子有-RANTES(MCP-2)(Schall等人，免疫學雜志141，1018(1988)，細胞61，361(1990))-單核細胞趨化和活化因子(MCAF)(Zachariae等人，實驗醫(yī)學雜志171，2177(1990)；Rollins等人，血液78，1112(1991)；Mukaida等人，免疫學雜志146，1212(1991)；Sica等人，免疫學雜志144，3034(1990))-IL-8
(Lotz等人，免疫學雜志148，466(1992)；Clore等人，生物化學29，1689(1990)，Matsushima等人，實驗醫(yī)學雜志167，1883(1988)，Baglioni等人，臨床研究雜志84，1045(1989)，國際免疫藥物雜志17，103(1995)，Carre等人，臨床研究雜志88，1802(1991))-巨噬細胞炎性蛋白1(MIP-1α和MIP-1β)(Broxmeyer等人，免疫學雜志147，2586(1991)；Oh等人，免疫學雜志147，2978(1991)；Graham等人，自然344，442(1990))-中性粒細胞活化蛋白2(NAP-2)(Walz，風濕性關節(jié)炎，倫敦(1991)，Chang等人，生物化學雜志269，25277(1994))-IL-3(Otsuka等人，免疫學雜志140，2288(1988)；de Vries等人，莖細胞11，72(1993)，Yang等人，血液71，958(1988)，細胞47，3(1986)，Philips等人，基因84，501(1989))-IL-5(Azuma等人，核酸研究14，9149(1986)；Yokota等人，PNAS84，7388(1987)；Campbell等人，PNAS 84，6629(1987)，Azuma等人，核酸研究14，9149(1986))-人白血病抑制因子(LIF)(Gough等人，Ciba基金會座談會167，24(1992)，PNAS美國85，5971(1988)，Stahl等人，生物化學雜志265，8833(1990)，Rahtjan等人，細胞62，1105(1990))-IL-7(Matzuda等人，白淋巴細胞5，231(1991)，Lupton等人，免疫學雜志144，3592(1990)，Goodwin等人，PNAS美國86，302(1989)，SWatherland等人，人體遺傳學82，371(1989))-IL-11
(Paul等人，美國國家學術科學匯編87，7512(1990)，Teramura等人，血液79，327(1992)，KaWashima等人，歐洲生物化學學會聯(lián)合會通信283，199(1991))-IL-13(McKenzie等人，免疫學雜志150，5436(1993)，Muzio等人，血液83，1738(1994)，McKenzie等人，PNAS 90，3735(1993)，Minty等人，自然362，248(1993))-GM-CSF(Wong等人，科學228，810(1985)，Gough等人，自然309，763(1984)，Nicola等人，生物化學雜志254，5290(1979))-G-CSF(Nagata等人，歐洲分子生物學組織雜志5，575(1986)，Nagata等人，自然319，415(1986)，Souza等人，科學232，61(1986))-M-CSF(Welte等人，PNAS 82，1526(1985)，Lu等人，生物化學，生物物理檔案268，81(1989)， Kawasaki等人，科學230，291(1985)，Suzu等人，生物化學雜志267，4345(1992)，Wong等人，科學235，1504(1987))可以用作本發(fā)明意義上的活性物質的還有所列細胞因子和人免疫球蛋白之間形成的融合蛋白的DNA序列。具有這種特性的DNA序列及其制備方法已在歐洲專利0464633A1中描述過。
e)激活細胞生長抑制劑前體的酶類但是，抗腫瘤物質還可以理解為可以將抗腫瘤活性化合物前體轉化為抗腫瘤活性化合物之酶的DNA序列。
已有綜述文獻報道了能夠裂解無活性的前體物質(原藥)并籍此形成活性細胞生長抑制劑(藥物)的酶，以及在各種情況下有關的原藥和藥物(Deonarain等人，英國癌癥研究雜志70，786(1994)，Mullen，藥物治療63，199(1994)和Harris等人，基因治療，1，170(1994))。
例如，將利用編碼下列酶之一的DNA序列-單純皰疹病毒胸苷激酶(Garapin等人，PNAS美國76，3755(1979)，Vile等人，癌癥研究53，3860(1993)，Wagner等人，PNAS美國78，1441(1981)，Moelten等人，癌癥研究46，5276(1986)，國家癌癥研究所雜志82，297(1990))-帶狀水痘病毒胸苷激酶(Huber等人，PNAS美國88，8039(1991)，Snoeck國際抗微生物試劑雜志4，211(1994))-細菌硝基還原酶(Michael等人，F(xiàn)EMS微生物通信124，195(1994)，Bryant等人，生物化學雜志266，4126(1991)，Watanabe等人，核酸研究18，1059(1990))-細菌β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等人，PNAS美國，83，8447(1986)-黑麥的植物β-葡糖醛酸糖苷酶(Schulz等人，植物化學26，933(1987))-人β-葡糖醛酸糖苷酶(Bosslet等人，英國癌癥研究雜志65，234(1992)，Oshima等人，PNAS美國84，685(1987))-人羧肽酶(CB)，例如*肥大細胞CB-A(Reynolds等人，臨床研究雜志89，273(1992))*胰CB-B(Yamamoto等人，生物化學雜志267，2575(1992)，Catasus等人，生物化學雜志270，6651(1995))*細菌羧肽酶(Hamilton等人，細菌雜志174，1626(1992)，Osterman等人，蛋白質化學雜志11，561(1992))
-細菌β-內酰胺酶(Rodrigues等人，癌癥研究55，63(1995)，Hussain等人，細菌雜志164，223(1985)，Coque等人，胚胎雜志12，631(1993)-細菌胞嘧啶脫氨酶(Mullen等人，PNAS美國89，33(1992)，Austin等人，分子藥物學43，380(1993)，Danielson等人，分子微生物學6，1335(1992))-人過氧化氫酶或過氧化物酶(Ezurum等人，核酸研究21，1607(1993))-磷酸酶，尤其是*人堿性磷酸酶(Gum等人，癌癥研究50，1085(1990))*人酸性前列腺磷酸酶(Sharieff等人，美國人體遺傳學雜志49，412(1991)，Song等人，基因129，291(1993)，Tailor等人，核酸研究18，4928(1990))*5型酸性磷酸酶(基因130，201(1993))-氧化酶，尤其是*人賴氨酰氧化酶(Kimi等人，生物化學雜志270，7176(1995))*人酸性D-氨基氧化酶(Fukui等人，生物化學雜志267，18631(1992))-過氧化物酶*人谷胱甘肽過氧化物酶(Chada等人，基因組6，268(1990)，Ishida等人，核酸研究15，10051(1987))*人嗜酸性過氧化物酶(Ten等人，實驗醫(yī)學雜志169，1757(1989)，Sahamaki等人，生物化學雜志264，16828(1989))*人甲狀腺素過氧化物酶(Kimura，PNAS美國84，5555(1987))為了促進分泌所列出的酶類，可以用改善了胞內分泌作用的異源信號序列替代各種情況下于所述DNA序列中包含的同源信號序列。
因此，例如可以用免疫球蛋白的信號序列(DNA位置≤63至≥107；Riechmann等人，自然，332，323(1988))替代β-葡糖醛酸糖苷酶的信號序列(DNA位置≤27至93；Oshima等人，PNAS 84，685(1987))。
另外，優(yōu)先選擇的DNA是編碼那些經過點突變后較少地貯存于溶酶體中并提高了分泌能力的酶類。具有所述性質的點突變已有描述，例如，對于β-葡糖醛酸糖苷酶(Shiplex等人，生物化學雜志268，12193(1993))。2.4幾種抗腫瘤物質的聯(lián)合本發(fā)明進一步涉及一種活性化合物，其中結合了幾種相同抗腫瘤物質(A，A)或幾種不同抗腫瘤物質(A，B)的DNA序列。為了表達兩種DNA序列，內部核糖體進入位點(IRES)的cDNA優(yōu)選提出作為調節(jié)元件

這類IRES已被描述過(例如參見Mountford和Smith，TIG 11，179(1995)，Kaufman等人，核酸研究19，4485(1991)，Morgan等人，核酸研究20，1293(1992)，Dirks等人，基因128，247(1993)，Pelletier和Sonenberg，自然334，320(1988)和Sugitomo等人，生物技術12，694(1994))。
因此，脊髓灰質炎病毒IRES序列的cDNA(位置在5’UTR的≤140至≥630；Pelletier和Sonenberg，自然334，320(1988))可用于連接抗炎物質A的DNA(在3’端)和抗炎物質B的DNA(在5’端)。
根據(jù)結合的情況不同(A+A，A+B1)，所述性質的活性化合物表現(xiàn)出本發(fā)明意義上的相加或協(xié)同作用。2.5載體的構建用本領域技術人員熟悉的方式將新的DNA構建體制備成完整的載體。該載體可以來源于病毒或非病毒。例如，新的DNA構建體可以被插入病毒載體(這方面的信息可參見D.Jolly，癌癥基因治療1，51(1994))或還可用作質粒。病毒載體或質粒可與膠體分散體，例如與質脂體復合(Farhood等人，紐約科學院年刊716，23(1994))，或者另外也可以與聚賴氨酸/配體共軛物(Curiel等人，紐約科學院年刊716，36(1994))或與常規(guī)的輔劑配制成藥物。2.6配體的選擇可以給病毒性載體和非病毒性載體增加一個配體。能夠與增生的內皮細胞表面結合的物質優(yōu)選作為配體，例如以聚賴氨酸/配體共軛物形式。所述物質包括針對內皮細胞膜結構的抗體或抗體片段(例如參見Burrows等人，藥物治療64，155(1994)，Hughes等人，癌癥研究49，6214(1989)和Maruyama等人，PNAS-美國87，5744(1990))。所述物質特別包括抗VEGF受體的抗體。
優(yōu)選將鼠源單克隆抗體以人化形式加以利用。用已知的方法將所述抗體人化(Winter等人，自然349，293(1991)和Hoogenbooms等人，輸血生物學譯叢36，19(1993))。所述抗體片段也以本領域現(xiàn)有技術所述方式制備(例如參見Winter等人，自然349，293(1991)，Hoogenboom等人，輸血生物學譯叢36，19(1993)，Girol，分子免疫28，1379(1991)或Huston等人，國際免疫學評論10，195(1993))。
所述配體進一步包括能與內皮細胞上的膜結構或膜受體結合的所有活性物質。例如，包括在末端含有甘露糖的物質，以及能夠與內皮細胞表達的受體結合的IL-1或生長因子或其片段或其組成序列，例如PDGF、bFGF、VEGF和TGFβ(Pusztain等人，病理學雜志169，191(1993))。此外，所述配體還包括與激活的和/或增生的內皮細胞結合的粘著分子。具有所述性質的粘著分子例如有SLex、LFA-1、MAC-1、LECAM-1或VLA-4，這些分子都已被描述過(參見綜述Augustin-Voss等人，細胞生物學雜志119，483(1992)，Pauli等人，癌轉移評論，9，175(1990)和Honn等人，癌轉移評論11，353(1992))。2.7活性化合物的制備(實施例)借助下列實施例將更詳細地描述新活性化合物的制備方法。
a)構建嵌合啟動子內皮縮血管肽1-CDE-CHR-Inr人內皮縮血管肽-1啟動子(位置≤-170至≥-10)或經除去TATA盒而被截平的變異體在其3’端與人cdc 25C基因CDE-CHR-Inr組件(位置≤-20至≥+121)的5’端連接(圖6)。利用本領域技術人員已知且經商業(yè)途徑可以獲得的酶進行有效的連接。
b)構建含活性化合物中心成分的質粒將已描述過的嵌合內皮縮血管肽-1啟動子組件/轉錄單位以其3’端與人β-葡糖醛酸糖苷酶編碼區(qū)DNA的5’端(位置≤27至≥1982，Oshima等人，PNAS美國84，685(1987))連接。該DNA還含有分泌所需的信號序列(22個N端氨基酸)。為了易于從細胞內分泌，該序列最好是由免疫球蛋白信號序列替代(位置≤63至≥107；Riechmann等人，自然332，323(1988)參見圖7)。轉錄調控單位和編碼β-葡糖醛酸糖苷酶的DNA被克隆到pUC 19/19或Bluescript衍生的質粒載體中，其可以直接或于膠體分散體系中應用于體內。另外，嵌合基團可轉移至病毒載體或其它適宜載體中，并用于注射。2.8活性化合物的活性在局部施用(例如在腫瘤部位)或顱內或蛛網(wǎng)膜內施用，或經全身，優(yōu)選經靜脈內或動脈內施用后，本發(fā)明的活性化合物借助組織特異性激活物序列(UAS)和細胞周期調節(jié)的阻遏物組件的結合，能夠使得主要是(即使不完全是)僅增生的內皮細胞或其鄰接細胞分泌能夠抑制增生作用本身或另外能誘導具有抗增生活性或細胞生長抑制作用的物質形成的物質。內此細胞增生的抑制和/或細胞生長抑制物質的釋放可引起腫瘤生長的抑制?；钚曰衔锞哂辛己玫哪褪苄裕驗榭鼓[瘤物質的形成因新活性化合物而限于腫瘤生長部位和由腫瘤引起的血管生成。
既然活性化合物由于其細胞特異性和細胞周期特異性而具有高度安全性，所以所述活性化合物可以大劑量使用，并且如果需要的話，可以數(shù)天或數(shù)周間隔性重復用于腫瘤疾病的治療。


圖1表示cdc 25C啟動子區(qū)連同已在體內發(fā)現(xiàn)的蛋白質結合位點的核苷酸序列(基因組DMS足跡法；(實心圓點)完全性組成保護作用；○(空圈)部分性組成保護作用；*(星號)細胞周期調節(jié)的G1特異性保護作用)。CBS組成性結合位點；CDE細胞周期依賴性元件。以暗色劃線的區(qū)域表示Yc盒(NF-Y結合位點)。起始位點以填黑的方形表示。
圖2表示cdc 25C啟動子通過cdc突變而在G0期出現(xiàn)的特異性去阻遏作用。
圖3圖解說明CDE對cdc 25C增強子的調節(jié)作用。
圖4表示CDE對SV40增強子的G0/G1特異性阻遏作用。右邊的數(shù)字表示G2期的誘導作用(與對照＝1相比)。
圖5表示CDE-CHR區(qū)與cdc以25C、細胞周期蛋白A和cdc2啟動子中位于5’端的Yc盒的同源性。
圖6表示嵌合構建體，其由人內皮縮血管肽-1啟動子、含CDE和CHR阻遏物元件的3’融合啟動子組件以及編碼作為效應子的β-葡糖醛酸糖苷酶的DNA(完整編碼區(qū)，位置≤239-≥2194；Oshima等人，PNAS美國84，685(1987))不同部分組成。對于內皮縮血管肽-1基因的位置命名和對于cdc 25C所用系統(tǒng)分別參考Wilson等(分子生物學10，4854(1990))和Lucibello等(歐洲分子生物學組織15，132(1995))的描述。
圖7中對于免疫球蛋白(HuVHCAMP)信號序列(MGWSCIILFLVATAT)的位置命名參照Riechmann等(自然，332，(1988))的描述。
另外，為了獲得改善的β-葡糖醛酸糖苷酶之胞外分泌作用，插入Ig信號肽(圖7B)。
表1CDE和CHR在cdc 25C、細胞周期蛋白A和cdc 2的細胞周期調節(jié)的轉錄中的作用表1G0生長因子wtcdc25C 0.8 13.117.5細胞周期蛋白A 0.7 27.141.7cdc21.0 41.241.2mCDE(-13)cdc25C 7.6 11.61.5細胞周期蛋白A 13.4 23.91.8cdc211.3 33.93.0mCHR(-6/-3)cdc25C 14.4 21.01.5細胞周期蛋白A 15.5 28.31.8cdc218.6 38.62.1在HIH3T3細胞中瞬時轉染的結果表示為RLU/1000。mCDE突變的CDE(位置-13G→T)；mCHR突變的CHR(位置-6至-3)。
權利要求
1.一種預防或治療腫瘤疾病的活性化合物，含有由激活物序列、啟動子組件和編碼抗腫瘤物質之DNA序列組成的DNA構建體。
2.如權利要求1所述的活性化合物，其中的啟動子組件具有元件CDE-CHR-Inr，并含有cdc25C啟動子區(qū)的位置≤-20至≥+30部分(核苷酸序列GGCTGGCGGAAGGTTTGAATGGTCAACGCCTGCGGCTGTTGATATTCTTG)、CDE表示細胞周期依賴性元件的序列2(核苷酸序列TGGCGG)、CHR表示細胞周期基因同源區(qū)(核苷酸序列GTTTGAA)和Inr表示起始位點(位置+1)的序列3以及對于抑制作用很重要的鄰近序列。
3.如權利要求1所述活性化合物，其含有受轉錄因子調節(jié)的激活物序列(啟動子序列或增強子序列)，所述轉錄因子在內皮細胞或在與增生的內此細胞緊鄰的細胞中形成。
4.如權利要求3所述活性化合物，含有CMV啟動子、CMV增強子或SV40啟動子，或下列因子的啟動子序列內皮細胞葡萄糖-1運輸因子，endogolin，VEGF受體1或2、受體酪氨酸激酶til-1或til-2、B61受體、B61配體、內皮縮血管肽，尤其是內皮縮血管肽B或1、甘露糖-6-磷酸受體、IL-1α或IL-1β、IL-1受體、VCAM-1或vonWillebrand因子，或合成的激活物序列，其由寡聚的轉錄因子結合位點組成，例如結合位點為5’-TTATCT-3’的GATA-2，在內皮細胞內具有優(yōu)先的或選擇活性，或VEGF啟動子序列或VEGF的增強子序列，或c-SRC或v-SRC的cDNA序列，能夠調控VEGF基因，或小鼠乳腺腫瘤病毒的啟動子序列，或甾族化合物受體的啟動子序列。
5.如權利要求1-4所述的活性化合物，其中抗腫瘤物活性化合物的DNA序列編碼成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白p110或p107和p130蛋白，或p53蛋白，或p21蛋白、p16蛋白或其它細胞周期蛋白依賴性激酶(cdK)抑制劑，或GADD45蛋白，或bak蛋白，或抑制血管生成的蛋白，或具有細胞生長抑制作用的蛋白，或刺激炎癥形成的蛋白，或裂解細胞生長抑制劑前體從而形成細胞生長抑制劑的酶。
6.如權利要求5所述化合物，其中的成視網(wǎng)膜細胞瘤蛋白(pRb/p110)通過在246、350、601、605、780、786、787、800和804位上進行不喪失與主要T抗原結合活性的氨基酸取代而使之不再磷酸化，例如，用Ala取代Thr-246、Ser-601、Ser-605、Ser-780、Ser-786、Ser-787和Ser-800，用Arg取代Thr-350，用Glu取代Ser-804，或其中的p107蛋白以類似于pRb/110的方式突變，或其中的p130蛋白以類似于pRb/110的方式突變。
7.如權利要求5所述活性化合物，其中的p53蛋白通過去除Ser-392而在C端截平。
8.如權利要求1-4的活性化合物，其中的抗腫瘤物質是纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)、PAI-2、PAI-3、angiostatin、血小板因子4、TIMP-1、TIMP-2或TIMP-3。
9.如權利要求1-4的活性化合物，其中的抗腫瘤物質是穿孔素、granzyme、IL-2、IL-4、IL-12、干擾素，如IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFα或TNFβ、制瘤素M、RANTES、MCAF、IL-8、MIP-1α、MIP-1β、NAP-2、IL-3、IL-5、LIF、IL-11或IL-13。
10.如權利要求9所述活性化合物，其中的抗腫瘤物質是含免疫球蛋白Fc段的融合蛋白。
11.如權利要求1-4所述活性化合物，其中的抗腫瘤物質是一種酶，包括單純皰疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脫氨酶、帶狀水痘病毒胸苷激酶、硝基還原酶、β-葡糖醛酸糖苷酶(尤其是人、植物或細菌性的)、羧肽酶(優(yōu)選來源于假單胞菌)、內酰胺酶(優(yōu)選來源于蠟狀芽胞桿菌)、焦谷氨酸氨基肽酶、D-氨基肽酶、氧化過氧化物酶、磷酸酶、羥基腈裂解酶、蛋白酶、酯酶或糖苷酶。
12.如權利要求11所述活性化合物，其中因所述酶DNA序列發(fā)生點突變而使溶解體的貯備減少，其胞外分泌增加。
13.如權利要求11所述活性化合物，其中為了改善胞外分泌作用，用異源信號序列替代了所述酶的信號序列。
14.如權利要求1-13的活性化合物，含有數(shù)種相同或不同抗腫瘤物質的DNA序列，在各種情況下，兩個DNA序列借助內核糖體進入位點的DNA序列彼此連接。
15.如權利要求1-13所述活性化合物，其被插入載體中。
16.如權利要求15的活性化合物，其中的載體是病毒。
17.如權利要求16所述活性化合物，其中的病毒是逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、單純皰疹病毒或牛痘病毒。
18.如權利要求1-14的活性化合物，其被插入質粒中。
19.如權利要求15-18的活性化合物，其在膠體分散系統(tǒng)中制備。
20.如權利要求19的活性化合物，其中脂質體是膠體分散系統(tǒng)。
21.如權利要求20的活性化合物，其中聚賴氨酸/配體是膠體分散系統(tǒng)。
22.如權利要求15-21的活性化合物，其中增加了能夠與內皮細胞膜結構結合的配體。
23.如權利要求22的活性化合物，其中的配體是多克隆或單克隆抗體，或其片段，通過可變區(qū)與內皮細胞的膜結構結合，是細胞因子或生長因子，或其片段或組成序列，或與平滑肌細胞上的受體結合，或是粘著分子，如SLeX、LFA-1、MAC-1、LECAM-1或VLA-4。
24.如權利要求23的活性化合物，其中內皮細胞的膜結構是指甘露糖、IL-1或生長因子如PDGF、FGF、VEGF或TGFβ的受體。
25.如權利要求1-24所述的活性化合物，是適于經靜脈內、動脈內、腔內注射至組織或組織間隙或適于局部施用的藥物制劑。
全文摘要
本發(fā)明描述了用于腫瘤的基因治療的DNA序列，所述DNA的基本組成元件包括激活物序列、啟動子組件和編碼活性物質的基因。所述激活物序列在增生的內皮細胞或在與所述細胞鄰接的細胞中以細胞特異性的方式被激活。該激活過程以細胞周期特異性方式受啟動子組件的調節(jié)。所述活性物質是血管生成的抑制劑或細胞生長抑制分子或細胞毒性分子。所述DNA序列插入到病毒或非病毒載體中，所述載體已增加了與激活的內皮細胞具有親和力的配體。
文檔編號C07K14/475GK1158144SQ95195134
公開日1997年8月27日 申請日期1995年8月25日 優(yōu)先權日1994年8月26日
發(fā)明者H·H·塞德拉斯克, K·伯斯萊特, R·穆勒 申請人:赫徹斯特股份公司