專利名稱：一種高溫脂肪酶、其編碼基因序列及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域。具體地說(shuō)，涉及一種編碼嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4脂肪酶的DNA序列，還涉及含有該酶基因的重組質(zhì)粒和表達(dá)相應(yīng)酶的重組菌株。
背景技術(shù)：
脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一種特殊的水解酶，其分解脂肪，催化分解三酸甘油酯，產(chǎn)生甘油酯，游離脂肪酸和甘油。脂肪酶是水溶性的，其催化反應(yīng)的特征是能在不溶性底物和水相界面上迅速催化分解酯鍵，而對(duì)水溶性底物作用很小。這一點(diǎn)在有機(jī)合成中合成手性中間體方面具有很多的優(yōu)越性，例如通常用化學(xué)催化劑金屬鈉或烷基醇鈉來(lái)加快?；诟视王シ肿娱g的遷移，但并無(wú)位置特異性，如用1，-3，-專一性脂肪酶催化時(shí)，?；w移限制在1，-3，-位上，可以生成化學(xué)法不能生產(chǎn)的特殊的甘油三酸酯混合物[Matsuo英國(guó)專利應(yīng)用(British Patent Application)，2335-350，1980]。由于具有不需要輔酶就能催化正逆反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，近些年來(lái)，脂肪酶作為類脂化合物合成分解和酯交換的催化劑，已廣泛應(yīng)用于油脂水解、食品風(fēng)味和香味的改進(jìn)、皮革絹紡脫脂、低等油脂的改性及添加于洗滌劑中以提高去污能力等[陳清馥，生物技術(shù)，242-44，1992；Arnold等，乳品科學(xué)雜志(Jour of Dairy Science)581127，1975；Carasik德國(guó)專利German patent2109-119，1970；Andree等，應(yīng)用生物化學(xué)雜志(J Appl Biochemistry)2218-229，1980；Suzuki，美國(guó)專利US Patent 6,306,813，2001年10月23日]。
脂肪酶的研究始于胰脂酶，但由于其來(lái)源有限，故微生物脂肪酶的研究越來(lái)越受到重視。脂肪酶已從多種不同的微生物中分離，如青霉(黃建忠等，工業(yè)微生物，25(3)1-5，1995)、白地霉(謝舜珍等，微生物學(xué)報(bào)，26(3)260-264，1986)、根霉菌(金其榮等，工業(yè)微生物，25(1)17-20，1995)、類產(chǎn)堿假單胞菌(吳松鋼等，微生物學(xué)報(bào)，37(1)32-39，1997)、假單胞菌(Kotsuka等，美國(guó)專利US Patent 5,846,801，1998年12月8日)、假絲酵母等[William等，微生物酶和生物技術(shù)(MicrobialEnzymes and Biotechnology)，應(yīng)用科學(xué)出版社出版(Applied SciencePublishers Ltd)，1983，225～247]，其中多數(shù)脂肪酶的最適作用溫度較低(35～40℃左右)，熱穩(wěn)定性較差，當(dāng)作用底物為高凝固點(diǎn)油脂，如氫化油、牛油、烏桕脂、棕櫚油等，此類酶就不太適合，需要具有熱穩(wěn)定性的脂肪酶，以適應(yīng)工業(yè)要求。
已有一些來(lái)自細(xì)菌的脂肪酶具有一定的熱穩(wěn)定性，如嗜熱芽孢菌Bacillus stearothermophilus產(chǎn)生的脂肪酶最適溫度為55℃[Sinchaikul等，蛋白質(zhì)純化實(shí)驗(yàn)(Protein Expr Purif)，22(3)388-98，2001]；假單胞菌Pseudomonas sp.產(chǎn)生的脂肪酶最適溫度為55-65℃(石田禮子等，中國(guó)專利CN1129954A；1996年8月28日)；假單胞菌Pseudomonas fragi產(chǎn)生的脂肪酶最適溫度為55-65℃(SHIGEYUKI等，日本專利JP2039890，1990年2月8日)；Aspergillus niger產(chǎn)生的脂肪酶最適溫度為55℃[Namboodiri等，脂質(zhì)(Lipids)，35(5)495-502，2000]；Pseudomonas cepacia產(chǎn)生的脂肪酶最適溫度為55-60℃[Sugihara等，生物化學(xué)雜志(J Biochem)(Tokyo)112(5)598-603]。微生物產(chǎn)生脂肪酶種類多，不同來(lái)源的脂肪酶具有多方面不同性質(zhì)，從而導(dǎo)致各具特色的應(yīng)用范圍。因而需要持續(xù)不斷地開發(fā)新特性脂肪酶以更好地滿足工業(yè)需要。
關(guān)于脂肪酶基因已有專利和文獻(xiàn)報(bào)道。如Rey等報(bào)道了Fusariumvenenatum的脂肪酶基因(美國(guó)專利US Patent 6,432,898，2002年8月13日)；Lin等報(bào)道了Pseudomonas pseudoalcaligenes的脂肪酶基因(美國(guó)專利USPatent 5,766,913，1998年6月16日)；CLAUDIA等報(bào)道了Candida rugosa的脂肪酶基因(歐洲專利WO9914338，1999年3月25日)；HARUMI等報(bào)道了Pseudomonas sp.的脂肪酶基因(歐洲專利，EP0812910，1997年12月17日)；YUJI等報(bào)道了Geotrichum candidum的脂肪酶基因(日本專利，JP2174680，1990年6月6日)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型脂肪酶、及其結(jié)構(gòu)基因、重組質(zhì)粒和重組菌體，該基因表達(dá)產(chǎn)物脂肪酶在高溫條件下顯示活性，可應(yīng)用于洗滌劑工業(yè)和其他工業(yè)過(guò)程。同時(shí)本發(fā)明提供了一種方法，即通過(guò)分子生物學(xué)手段，將本發(fā)明涉及的酶基因克隆到其它受體菌，由其它菌株或在其它培養(yǎng)條件產(chǎn)生本發(fā)明涉及的脂肪酶。
本發(fā)明研究證明，嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4(薛燕芬等，系統(tǒng)與環(huán)境微生物國(guó)際雜志IJSEM，511335-1341，2001)在高溫條件下產(chǎn)生高溫脂肪酶，其分泌的脂肪酶作用溫度范圍為60-80℃，pH6-7。
本發(fā)明從嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4獲得到脂肪酶的基因，它是1209bp的DNA，編碼一個(gè)由403個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。通過(guò)分子生物學(xué)方法獲得了含有該基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌使重組菌株表達(dá)脂肪酶。因此本發(fā)明同時(shí)提供了一種方法，即通過(guò)遺傳工程或分子生物學(xué)手段，將本發(fā)明涉及的酶基因克隆到其它更有利于在生產(chǎn)應(yīng)用的受體菌上，由其它菌株或在其它培養(yǎng)條件產(chǎn)生本發(fā)明涉及的脂肪酶。
為達(dá)到本發(fā)明的目的，實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)步驟如下從嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4中提取總DNA，利用shot-gun技術(shù)，得到所需要的DNA片段，連接到pUC18載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得含高溫脂肪酶基因的重組質(zhì)粒pLIP及重組大腸桿菌菌株DH5αLIP。該重組菌表達(dá)高溫脂肪酶活性。在可使上述脂肪酶基因表達(dá)的條件下培養(yǎng)該重組菌，經(jīng)活性測(cè)定，證明該重組菌表達(dá)高溫脂肪酶活性。該蛋白質(zhì)具有高溫脂肪酶活性，作用溫度60-80℃，pH6-7可水解脂肪產(chǎn)生脂肪酸和甘油。測(cè)序表明，目的基因含有1209bp，編碼一個(gè)由403個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明涉及的脂肪酶是一新型的脂肪酶。屬于脂肪酶Class 2家族中的一員。新的脂肪酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)與已知的脂肪酶的不同，與其它已報(bào)道的脂肪酶的氨基酸序列相比，相似性小于36％。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本發(fā)明的脂肪酶基因所表達(dá)的酶分之的氨基酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、插入或缺失所得到的功能類似物也能達(dá)到本發(fā)明的目的。因而本發(fā)明也包括與SEQNO.2所示的氨基酸序列具有至少有80％的同源性，優(yōu)選具有至少90％的同源性，但同時(shí)具有脂肪酶的活性的功能類似物。
本發(fā)明涉及的脂肪酶的性能不同于已知的脂肪酶，其熱穩(wěn)定性高，適合用于洗滌劑添加劑和其他相關(guān)工業(yè)，如化工、紡織、食品、醫(yī)藥方面應(yīng)用。
按照本發(fā)明所述的脂肪酶，具有如下特性(1)高溫厭氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4或其它衍生菌產(chǎn)生。衍生菌是指轉(zhuǎn)化有本發(fā)明涉及的DNA片段的重組菌株；(2)具有SEQ NO.1所示的核苷酸編碼序列；(3)具有SEQ NO.2所示的氨基酸序列；(4)具有脂肪酶活性，作用溫度60-80℃，pH6-7，分子量42000道爾頓。
本發(fā)明涉及的DNA序列，除了編碼本發(fā)明涉及的脂肪酶的SEQ NO.1外，還應(yīng)當(dāng)包括編碼對(duì)本發(fā)明的脂肪酶基因所表達(dá)的酶分子的氨基酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、插入或缺失所得到的功能類似物也能達(dá)到本發(fā)明的目的DNA核苷酸序列。因而本發(fā)明也包括編碼與SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有80％的同源性，優(yōu)選具有至少90％的同源性，但同時(shí)具有脂肪酶活性的功能類似物的DNA核苷酸序列。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
圖1.pLIP質(zhì)粒的構(gòu)建圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1.
嗜熱厭氧菌MB4總DNA的提取采用從中國(guó)云南騰沖熱泉分離的嗜熱厭氧菌Thermoanaerobactertengcongensis MB4，取其新鮮濕菌體20克，懸于10毫升50mMTris緩沖液中(pH8.0)，加入少量溶菌酶和8毫升0.25mMEDTA(pH8.0)，混勻后于37℃放置20min，之后加入2毫升10％SDS，55℃放置5min，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次，取最后一次的上清溶液，加入2倍體積乙醇，回收DNA，分別用70％和無(wú)水乙醇洗，沉淀溶于0.5毫升TE緩沖液(pH8.0，10mM Tris，1mMEDTA)，加入10mg/ml RNase3μl，37℃保溫1小時(shí)，分別用等體積酚、氯仿各抽提一次，上清液加入2倍體積乙醇，回收DNA，分別用70％和無(wú)水乙醇洗，真空干燥，用去離子水溶解。DNA溶液的紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果為A260/A280＝1.98，A260/A230＝2.18。
脂肪酶基因的克隆取前面所述的總DNA溶液10μl(約50μgDNA)，用限制酶Sau3AI部分酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，電洗脫回收2-10kbDNA片段。取2μl(5μg)Sau3AI酶解DNA片段與1μl(1μg)經(jīng)BamHI酶解并脫磷酸化的質(zhì)粒pUC18DNA在20μl連接體系進(jìn)行連接反應(yīng)，其中含2μl(10X連接緩沖液)，1μl T4DNA連接酶，14μl水。連接體系在16℃反應(yīng)16小時(shí)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α后，涂于含50ug/ml Amp(氨芐青霉素)，橄欖油與聚乙烯醇(PVA)的LB固體培養(yǎng)基上。37℃培養(yǎng)16-18小時(shí)，然后在60℃培養(yǎng)1-5小時(shí)，菌落周圍有透明圈的即為陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆在Amp-LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16-18小時(shí)，經(jīng)活性測(cè)試具有耐熱脂肪酶活性。對(duì)陽(yáng)性菌落用堿法提取重組質(zhì)粒，用各種限制酶水解重組質(zhì)粒，根據(jù)電泳結(jié)果證實(shí)有DNA片段插入質(zhì)粒，其大小約為3.0kb。含該DNA片段的重組質(zhì)粒稱為pLIP，含此重組質(zhì)粒pLIP的重組大腸桿菌稱為大腸桿菌DH5αLIP.
此重組質(zhì)粒pLIP可高頻轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)脂肪酶活性和抗氨芐性能。將重組質(zhì)粒中的DNA插入片段用地高辛DNA標(biāo)記檢測(cè)試劑盒標(biāo)記，與嗜熱菌MB4的染色體DNA進(jìn)行Southern blot DNA雜交實(shí)驗(yàn)，證實(shí)重組質(zhì)粒pLIP中插入的DNA片段來(lái)自嗜熱菌MB4的染色體DNA。
采用Sanger雙脫氧法對(duì)此DNA片段進(jìn)行了測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示插入片段含有一個(gè)長(zhǎng)1209bp的開放閱讀框架(ORF)，編碼一個(gè)由403個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。屬脂肪酶Class2家族，最高相似性同Bacillus subtilis的脂肪酶基因(36％)。
實(shí)施例2.
重組脂肪酶的純化和特性重組菌E.coli DH5αLIP的菌體懸于50mM磷酸緩沖液(pH7)中，利用超聲波破碎細(xì)胞，離心上清液為重組脂肪酶的粗酶液。此上清酶液70oC加熱15分鐘，離心去除變性蛋白，上清酶液經(jīng)離子交換柱層析，羥基磷灰石吸附柱層析和PAGE制備電泳等步驟進(jìn)行純化，得到的酶制劑在SDS-PAGE上顯示一條帶。利用已知的蛋白質(zhì)化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定此重組脂肪酶的基本特性。用SDS-PAGE測(cè)得的重組酶的分子量為42000道爾頓，與理論上推算的分子量(45200道爾頓)相似；重組酶反應(yīng)的作用溫度為60-80℃，pH6-7。
實(shí)施例3重組脂肪酶水解橄欖油向50％的橄欖油溶液(用pH7，0.2M的磷酸鈉緩沖液配制)中，加適量酶液，升溫至60℃，以每分鐘200轉(zhuǎn)攪拌16小時(shí)。色譜法測(cè)得油相含有脂肪酸，水相含有甘油，說(shuō)明重組脂肪酶可水解橄欖油產(chǎn)生甘油和脂肪酸。
SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)科學(xué)院微生物研究所<120>一種高溫脂肪酶、其編碼基因序列及其應(yīng)用<130>IM021104<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1212<212>DNA<213>Thermoanaerobacter tengcongensis MB4<400>1atgaggaagc taagagtatt tcctctattg gtaataatgt cgttgttatt atttcaagga60cattataaag caacatcata ttttgatcca acaccagtaa aaacctttac cgactctaaa120tactgggcta aagtggaact tttgagagat agcaatccta atataggaca agaaaaattt180ataacagata atcaacaaaa agatccagaa attatcaaag aatttaacaa caatcctcaa240ccaaattcac aatatttttt gctccactat gcacccggtt gggatacagg cacaaagcca300tatcctgtaa ttcttgttca cggtgctggg tccgatgcaa acttttttgc agatcctaaa360agggatggtt cgattactgg tttgatgcaa tatctttcgc aaagaggtta taaagtcttt420gctgttacat ttgcgcatcc tcatggggac aattacattc aaagagagat tcttgctgat480gtgattcaga aggttaaggc tgtaacagga gcaagtaaag ttgatattgt agcacatagt540aaaggcaata tgtccgcaag aatgtacgtg tcaaatgtca aagaatcatg gggagttgat600tttggaaaag atgtgagaag atatatccag ctgggagctc caaatggtgg aattgacttt660acttttagga atccaaatat ggcatggggt ataatgacaa ctggaggatt tggacctgtt720ccttatactt atatgttgat ttatggatta tggtataata ccacctatca cagtatatat780acagaaggtg gtgcctatcc aggacaactt cagatgctag caagatggga tagtgtatat840cctctaaata caacgcagca agattggtat acaacttatt atggagggtg gggatttgct900agttattcct atggaataaa ttatgcaatt aaagaaggcg gaaatcttgt taatacatta960
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Met Gln Tyr Leu Ser Gln Arg Gly Tyr Lys Val Phe Ala Val Thr Phe130 135 140Ala His Pro His Gly Asp Asn Tyr Ile Gln Arg Glu Ile Leu Ala Asp145 150 155 160Val Ile Gln Lys Val Lys Ala Val Thr Gly Ala Ser Lys Val Asp Ile165 170 175Val Ala His Ser Lys Gly Asn Met Ser Ala Arg Met Tyr Val Ser Asn180 185 190Val Lys Glu Ser Trp Gly Val Asp Phe Gly Lys Asp Val Arg Arg Tyr195 200 205Ile Gln Leu Gly Ala Pro Asn Gly Gly Ile Asp Phe Thr Phe Arg Asn210 215 220Pro Asn Met Ala Trp Gly Ile Met Thr Thr Gly Gly Phe Gly Pro Val225 230 235 240Pro Tyr Thr Tyr Met Leu Ile Tyr Gly Leu Trp Tyr Asn Thr Thr Tyr245 250 255His Ser Ile Tyr Thr Glu Gly Gly Ala Tyr Pro Gly Gln Leu Gln Met260 265 270Leu Ala Arg Trp Asp Ser Val Tyr Pro Leu Asn Thr Thr Gln Gln Asp275 280 285Trp Tyr Thr Thr Tyr Tyr Gly Gly Trp Gly Phe Ala Ser Tyr Ser Tyr290 295 300Gly Ile Asn Tyr Ala Ile Lys Glu Gly Gly Asn Leu Val Asn Thr Leu305 310 315 320
Gln Asn Ser Pro Val Asp Pro Ser Val Glu Ile Ala Val Leu Ala Gly325 330 335Asp Tyr Asn Tyr Ile Asn Gly Val Pro Trp Glu Thr Thr Gly Pro Ser340 345 350Asp Gly Leu Val Phe Val Lys Ser Ala Thr Asp Thr Ser Ala Met Thr355 360 365Lys Ser Gly Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asp Val Tyr His Leu Asn His370 375 380Leu Glu Leu Ala Tyr Asp Lys Ser Ala Met Asp Trp Ile Asp Ala Gln385 390 395 400Leu Ser Lys
權(quán)利要求
1.一種來(lái)源于嗜熱菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4的高溫脂肪酶或其功能類似物，其氨基酸序列與SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有80％的同源性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶或其功能類似物，其氨基酸序列與SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少有90％的同源性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶或其功能類似物，它具有SEQ NO.2所示的氨基酸序列。
4.一種編碼權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的高溫脂肪酶或其功能類似物的基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，它具有SEQ NO.1所示的核苷酸序列。
6.一種含有權(quán)利要求5所述的核苷酸序列的重組質(zhì)粒，是pLIP。
7.一種含有權(quán)利要求4或5所述的高溫脂肪酶或其功能類似物的基因的表達(dá)載體。
8.一種含有權(quán)利要求7所述表達(dá)載體的重組菌。
9.一種含有權(quán)利要求7所述表達(dá)載體的重組大腸桿菌DH5αLIP。
10.一種制備高溫脂肪酶的方法步驟和用途，包括(1)按照權(quán)利要求8所述的重組菌；(2)按照權(quán)利要求8所述的重組菌是一種含重組質(zhì)粒pLIP的重組大腸桿菌DH5αLIP；(3)重組菌通過(guò)微生物發(fā)酵和酶工程制備高溫脂肪酶；(4)通過(guò)該方法得到的高溫脂肪酶在化工、紡織、食品、醫(yī)藥工業(yè)方面應(yīng)用。
全文摘要
由嗜熱菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4總DNA獲得高溫脂肪酶基因(Lipase gene)，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)脂肪酶。通過(guò)氨基酸序列比較，該酶為一新型脂肪酶。
文檔編號(hào)B62D25/00GK1500868SQ02148778
公開日2004年6月2日 申請(qǐng)日期2002年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月13日
發(fā)明者薛燕芬, 馬延和, 竇岳坦, 周培瑾 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所