專利名稱：抗cd20的人單克隆抗體的制作方法
抗CD20的人單克隆抗體本申請是申請?zhí)枮椤?00380106690. 9”，發(fā)明名稱為“抗CD20的人單克隆抗體”的 專利申請的分案申請。相關(guān)申請本申請要求遞交于2002年10月17日的美國臨時申請?zhí)?0/419163，和遞交于 2003年4月2日的美國臨時申請?zhí)?0/460028的優(yōu)選權(quán)，二者標(biāo)題都是抗⑶20的人單克隆 抗體，本文將二者的全部內(nèi)容并入作為參考。
背景技術(shù)：
⑶20分子(也稱為人B淋巴細(xì)胞限制性分化抗原或Bp35)是前B細(xì)胞和成熟B淋 巴細(xì)胞上的疏水性跨膜蛋白，分子量大約35kD (Valentine等1989) J. Biol. Ghem. 264(19) 11282-11287 ；和 Einfield 等 1988) EMBO J. 7 (3) :711_717)。CD20 在超過 90% 的來自外周 血或淋巴組織的B細(xì)胞的表面被發(fā)現(xiàn)并且在早期前B細(xì)胞發(fā)育過程中表達并且保持到漿 細(xì)胞分化時。⑶20存在于正常B細(xì)胞以及惡性B細(xì)胞上。特別地，⑶20在超過90%的B 細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)上表達(Anderson等(1984)，血液63 (6) 1424-1433)，但在造 血干細(xì)胞、原B細(xì)胞、正常漿細(xì)胞或其它正常組織中未發(fā)現(xiàn)(Tedder等(1985)，免疫學(xué)雜志 135(2) :973-979)。CD20蛋白的85個氨基酸的羧基末端區(qū)位于細(xì)胞質(zhì)中。該區(qū)的長度與其它B細(xì)胞 特異性表達結(jié)構(gòu)如IgM、IgD和IgG重鏈或組織相容性抗原II類α或β鏈相反，所述結(jié) 構(gòu)分別具有相對短的3、3、28、15和16個氨基酸的胞質(zhì)內(nèi)區(qū)(Komaromy等(1983)NAR 11 6775-6785)。在羧基端的最后61個氨基酸中，21個為酸性殘基，只有2個是堿性的，提示該 區(qū)具有凈余的負(fù)電荷。GenBank登錄號為ΝΡ_690605。據(jù)認(rèn)為⑶20可能參與B細(xì)胞的激活和分化過程中的早期步驟(Tedder等(1986) Eur. J. Immunol. 16 :881-887)并且可以作為一種鈣離子通道起作用(Tedder等(1990) J. Cell. Biochem. 14D 195)。盡管并不確定關(guān)于CD20在促進B細(xì)胞的增殖和/或分化中的實際作用，它還是為 抗體介導(dǎo)的治療提供了一種重要的靶以控制或殺死參與癌癥或自身免疫病癥的B細(xì)胞。尤 其是，在腫瘤細(xì)胞，例如，NHL上的⑶20的表達使其成為一種重要的靶以特異性地靶向針對 CD20陽性瘤細(xì)胞的治療劑。但是，盡管到目前為止所獲得的結(jié)果清楚地證實CD20為一種對 于免疫療法有用的靶，它們還顯示目前現(xiàn)有的鼠和嵌合抗體并未構(gòu)成理想的治療劑。因此，存在對于抗CD20的治療性抗體的需求，所述抗體能夠有效預(yù)防和/或治療 多種涉及表達CD20細(xì)胞的疾病。發(fā)明概述本發(fā)明提供改進的抗體療法以治療和/或阻止與表達CD20細(xì)胞相關(guān)的疾病，包括 腫瘤相關(guān)疾病，和免疫疾病，包括自身免疫疾病。對本發(fā)明包括的抗體進行了改進，它們是 完全地人的并且因而，在患者中可能有較小的免疫原性。如本文所例示的，發(fā)明的人抗體通過許多機制介導(dǎo)表達CD20的B細(xì)胞的死亡。在 一個實施方案中，在細(xì)胞，如慢性B淋巴細(xì)胞白血病(B-CLL)細(xì)胞中本發(fā)明的人抗體誘導(dǎo)補體依賴的細(xì)胞毒性(⑶C)，例如，至少大約20%的⑶C介導(dǎo)的裂解，優(yōu)選大約30%的⑶C介 導(dǎo)的裂解，更加優(yōu)選大約40 %的CDC介導(dǎo)的裂解。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人抗體誘 導(dǎo)表達CD20的細(xì)胞的凋亡。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人抗體誘導(dǎo)表達CD20的細(xì)胞 的同型粘著。而且，本發(fā)明的人抗體在人效應(yīng)細(xì)胞(例如，單核細(xì)胞、單核的細(xì)胞、NK細(xì)胞 和多形核細(xì)胞)存在時可以誘導(dǎo)表達CD20的細(xì)胞的抗體依賴細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。而 且，本發(fā)明的人抗體在巨噬細(xì)胞存在時可以誘導(dǎo)表達CD20的細(xì)胞的吞噬作用。本發(fā)明的人 單克隆抗體可以通過這些機制中的一種或多種起作用?？梢员槐景l(fā)明的人抗體殺死的細(xì)胞 的例子包括，但不限于，表達CD20的B細(xì)胞，如致瘤B細(xì)胞和參與免疫疾病的B細(xì)胞。在一 個特定的實施方案中，利用人抗體介導(dǎo)在淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤處理中的B淋巴細(xì) 胞的殺傷。本發(fā)明的人抗體包括IgGl (例如，IgGl，κ )，IgG3(例如，IgG3，κ )和IgG4(例如， IgG4，κ )抗體。但是，本發(fā)明還包括其它的抗體同種型，包括IgG2、IgM、IgAU IgA2、分泌 型IgA、IgD和IgE。抗體可以是完整的抗體或其抗原結(jié)合片段，包括，例如，F(xiàn)ab、F(ab’)2、 Fv、單鏈Fv片段或雙特異性抗體。而且，抗原結(jié)合片段包括結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋 白，它包含(i)融合到免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽上的一種結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽(如重鏈可變區(qū)或 輕鏈可變區(qū))，( )融合到鉸鏈區(qū)上的一種免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，和(iii)融合到 CH2恒定區(qū)上的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)。這類結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白在US 2003/0118592 和 US 2003/0133939 中得到進一步介紹。本發(fā)明的特定人抗體包括那些稱為11B8、2F2和7D8的抗體，為人重鏈和人κ輕 鏈核酸及其保守的序列修飾物所編碼，所述核酸分別在它們的可變區(qū)包含如SEQ ID NOs 1、5或9和SEQ ID NOs :3、7或11中所示的核苷酸序列。在另一個實施方案中，人抗體的 特征在于，具有人重鏈和人κ輕鏈可變區(qū)及其保守的序列修飾物，所述可變區(qū)分別包含如 SEQ ID NOs :2、6或10和SEQ ID NOs :4、8或12中所示的氨基酸序列。仍然在另一個實施方案中，人抗體的特征在于，具有人重鏈和人κ輕鏈可變區(qū)， 所述可變區(qū)分別與SEQ ID NO :2禾口 SEQ ID NO :4;分別與SEQ ID NO :6禾口 SEQ ID NO :8 ；分 別與SEQ ID NO 10和SEQ IDNO 12中所示的氨基酸序列至少90%同源，優(yōu)選至少95%同 源，更加優(yōu)選至少98 %，或至少99 %同源。本發(fā)明的其它特定人抗體包括那些包含具有人重鏈和輕鏈CDRl區(qū)、人重鏈和輕 鏈CDR2區(qū)和人重鏈和輕鏈CDR3區(qū)的CDR結(jié)構(gòu)域的抗體，其中(a) CDRU CDR2 和 CDR3 人重鏈包含選自圖 53,55 或 57 (SEQID NOs :13-15、19_21 和25-27)中所示的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，及其保守的序列修飾物的氨基酸序列， 和(b)CDRl、CDR2 和 CDR3 人輕鏈包含選自圖 53、55 或 57 (SEQID NOs 16-18、22-24 和28-30)中所示的氨基酸序列CDR1、CDR2和CDR3，及其保守的序列修飾物的氨基酸序列。在本發(fā)明中還包括以大約I-IOnM或更低的解離平衡常數(shù)(Kd)由⑶20中解離出 來的抗體。這種抗體還包括那些與相關(guān)的細(xì)胞表面抗原不交叉反應(yīng)并且因而不抑制它們的 功能的抗體。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗⑶20抗體可以通過一種或多種下列特性進行 特征描述
a)對于人⑶20的特異性；b)如通過本文實施例5 (圖9)中公開的結(jié)合實驗所測定的，大約IOnM或更低，優(yōu) 選大約5nM或更低，更加優(yōu)選大約1-3ηΜ或更低的對CD20的結(jié)合親和性(Kd)；c)如通過本文實施例5 (圖9)中公開的解離速率實驗所測定的，大約lessee—1或 更低，優(yōu)選大約IO-5Sec-1或更低，更加優(yōu)選大約IiT6sec-1或更低的由CD20中的解離速率常 數(shù)(Kd)；d)在⑶55/59陰性或⑶55/59陽性細(xì)胞上介導(dǎo)高水平⑶C的能力；e)結(jié)合⑶20后轉(zhuǎn)位于脂筏上的能力；f)抑制表達⑶20的細(xì)胞生長的能力；g)誘導(dǎo)表達⑶20的細(xì)胞凋亡的能力；h)誘導(dǎo)表達⑶20的細(xì)胞同型粘著的能力；i)在效應(yīng)細(xì)胞存在時誘導(dǎo)表達⑶20的細(xì)胞的ADCC的能力；j)延長具有表達⑶20的腫瘤細(xì)胞的個體存活的能力；k)消除表達⑶20細(xì)胞的能力；和/或1)消除表達低水平的⑶20的細(xì)胞(⑶20’的能力。本發(fā)明的人抗⑶20抗體可以衍生自、連接于或者與其它結(jié)合特異性共表達。在一 個特定的實施方案中，發(fā)明提供一種雙特異性或多特異性分子，它包含至少一種對于CD20 的第一結(jié)合特異性(例如，人抗CD20抗體或其模似物)和一種對于人效應(yīng)細(xì)胞的第二結(jié)合 特異性，如對于Fc受體(例如，人Fc y RI受體，如Fc y RI或人Fc α受體)或T細(xì)胞受體， 例如CD3的結(jié)合特異性。因此，本發(fā)明包括結(jié)合人⑶20和Fc受體或T細(xì)胞受體，例如⑶3的雙特異 性或多特異性分子。Fc受體的例子為，例如，人IgG受體，例如，F(xiàn)cy受體(Fe γ R)，如 Fc y RI (CD64)、Fc y RII (CD32)和 Fc γ RIII (CD16)。其它的 Fc 受體，如人 IgA 受體(例如， Fc y RI)，也可以作為靶目標(biāo)。Fc受體優(yōu)選位于效應(yīng)細(xì)胞，例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或激活的 單核細(xì)胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，雙特異性或多特異性分子在不同于受體的免疫球蛋 白Fc (例如，IgG或IgA)結(jié)合位點上結(jié)合到Fc受體上。所以，雙特異性或多特異性分子的 結(jié)合不被免疫球蛋白的生理水平所阻抑。仍然在另一個方面，發(fā)明的人抗CD20抗體可以衍生自、連接于或者與其它功能性 分子，例如，另一種肽或蛋白質(zhì)(例如，F(xiàn)ab'片段)共表達。例如，本發(fā)明的抗體可以功能 性連接于(例如，通過化學(xué)偶合、基因融合、非共價連接或其它)一種或多種其它分子實體， 如另一種抗體(例如，產(chǎn)生一種雙特異性或多特異性抗體)、細(xì)胞毒素、細(xì)胞配體或抗原(例 如，產(chǎn)生一種免疫共軛物，如免疫毒素)。本發(fā)明的抗體可以連接于其它治療部分上，例如， 放射性同位素、小分子抗癌藥物、抗炎劑或免疫抑制劑。因此，本發(fā)明包括大量的抗體共軛 物、雙特異性和多特異性分子和融合蛋白，它們都結(jié)合表達CD20的細(xì)胞并且能夠用于向這 些細(xì)胞靶向其它分子。仍然在另一個方面，本發(fā)明提供組合物，例如，藥學(xué)性和診斷性組合物/試劑盒， 包含一種或一組本發(fā)明的人單克隆抗體一起配劑的可藥用的載體。在一個特定的實施方案 中，該組合物包括一組結(jié)合不同抗原表位或者具有不同功能特性，如誘導(dǎo)⑶C和誘導(dǎo)凋亡 的抗體。
通過將有效量的抗體、免疫共軛物、雙特異性/多特異性分子或組合物與細(xì)胞接 觸從而抑制該細(xì)胞的生長和/或殺死該細(xì)胞，可以將本發(fā)明的人抗體、免疫共軛物、雙特異 性或多特異性分子和組合物用于多種方法中以抑制表達CD20的細(xì)胞的生長和/或殺死表 達CD20的細(xì)胞。在一個實施方案中，該方法包括在效應(yīng)細(xì)胞存在時殺死表達CD20的細(xì)胞， 例如，通過⑶C、凋亡、ADCC、吞噬作用，或這些機制的兩種或多種的組合。優(yōu)選殺死或抑制 這些細(xì)胞，而不殺死或抑制不表達CD20但可能例如表達一種結(jié)構(gòu)相關(guān)的細(xì)胞表面抗原的 (即，沒有相關(guān)的交叉反應(yīng)性但功能性地區(qū)分細(xì)胞表面抗原)細(xì)胞的活性。利用本發(fā)明的人 抗體可以抑制或殺死的表達CD20的細(xì)胞包括，例如，致瘤B細(xì)胞。因此，通過向患有這類疾病的患者給藥，可以用本發(fā)明的人抗體治療和/或預(yù)防 許多涉及表達CD20的細(xì)胞的疾病?？梢灾委?例如，改善)或預(yù)防的例示性的疾病包括， 但不限于，致瘤性疾病和免疫疾病，例如，自身免疫疾病?？梢灾委熀?或預(yù)防的致瘤性疾 病的例子包括B細(xì)胞淋巴瘤，例如，NHL，包括前體B細(xì)胞成淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤和成熟 B細(xì)胞瘤，如B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(SLL)、B細(xì)胞原淋巴細(xì) 胞淋巴瘤、淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)，濾泡淋巴瘤(FL)，包括低級、中級和高 級FL，皮膚毛囊中心淋巴瘤，邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(MALT型，結(jié)節(jié)和脾型)，毛細(xì)胞白血病， 擴散大B細(xì)胞淋巴瘤，Burkitt淋巴瘤，漿細(xì)胞瘤，漿細(xì)胞骨髓瘤，移植后淋巴增生性疾病， Waldenstrom巨球蛋白血癥和退行發(fā)育性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)?？梢灾委熀?或預(yù)防的涉 及表達CD22細(xì)胞的免疫疾病的例子包括牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、皮膚炎、系統(tǒng)性硬皮病、 炎癥性腸疾病(IBD)、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、呼吸窘迫綜合征、腦膜炎、腦炎、色素層 炎、腎小球腎炎、濕疹、哮喘、動脈粥樣硬化、白細(xì)胞粘連缺乏、多發(fā)性硬化癥、Raynaud綜合 征、Sjgren綜合征、青少年起病型糖尿病、Reiter病、Behcet病、免疫復(fù)合性腎炎、IgA腎 病、IgM多發(fā)性神經(jīng)病、免疫介導(dǎo)的血小板減少癥，如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜和慢性 特發(fā)性血小板減少性紫癜，溶血性貧血、重癥肌無力、狼瘡性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎(RA)、特應(yīng)性皮炎、天皰瘡、格雷夫斯病、橋本甲狀腺炎、Wegener肉芽腫病、Omerm 氏綜合征，慢性腎功能衰竭、急性傳染性單核細(xì)胞增多癥、HIV和皰疹病毒關(guān)聯(lián)疾病。進 一步的例子為急性呼吸窘迫綜合征和choreoretinitis。還有進一步的例子是由病毒，如 Epstein-Barr病毒(EBV)感染B細(xì)胞引發(fā)的疾病和病癥。在發(fā)明的一個特定的實施方案中，用化療劑、輻射或藥劑對給藥抗體的個體作進 一步處理，所述藥劑調(diào)節(jié)，例如，增強或抑制Fc受體，例如，F(xiàn)ca受體或Fcy受體的表達 或活性，如一種細(xì)胞因子。在治療中用作給藥的典型細(xì)胞因子包括粒細(xì)胞集落刺激因子 (G-CSF)、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、Y干擾素(IFN- γ )和腫瘤壞死因子(TNF)。在其它 藥劑中典型的治療劑包括抗瘤劑如阿霉素、順鉬、博來霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和環(huán)磷 酰胺。仍然在另一個方面，本發(fā)明提供一種優(yōu)選在早期，體外或體內(nèi)檢測樣品或個體中 CD20的存在，從而例如診斷CD20相關(guān)疾病的方法。這還可以對于監(jiān)測疾病和治療效果以及 對于確定和調(diào)整施用抗體的劑量有用。體內(nèi)方法可以利用成像技術(shù)如PET(正電子發(fā)射斷 層照相術(shù))或SPECT(單光子發(fā)射計算機X線斷層掃描術(shù))進行。在一個實施方案中，這通 過將待測樣品，優(yōu)選和對照樣品一起，與本發(fā)明的人單克隆抗體在允許形成抗體和CD20間 的復(fù)合物的條件下接觸而實現(xiàn)。隨后檢測復(fù)合物的形成(例如，利用FACS分析或蛋白質(zhì)印跡)。當(dāng)和測試樣品一起使用一種對照樣品時，在兩種樣品中都對復(fù)合物進行檢測并且在樣 品之間復(fù)合物形成中的任何統(tǒng)計學(xué)顯著的差異都是測試樣品中CD22D存在的指征。仍然在另一個方面中，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)基因非人動物，如轉(zhuǎn)基因小鼠，它表達結(jié) 合CD20的人單克隆抗體。在一個特定的實施方案中，轉(zhuǎn)基因非人動物是一種轉(zhuǎn)基因小鼠， 它具有編碼本發(fā)明抗體的全部或部分的包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組。可以 用純化的或高濃度的CD20抗原制品和/或表達CD20的細(xì)胞對該轉(zhuǎn)基因非人動物進行免 疫。優(yōu)選地，通過進行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)化，該轉(zhuǎn)基因非人動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠，能夠 產(chǎn)生多種⑶20的人單克隆抗體同種型(例如，IgG，IgA和/或IgM)同種型轉(zhuǎn)化可以是經(jīng) 典的或非經(jīng)典的同種型轉(zhuǎn)化。因此，仍然在另一個方面，本發(fā)明提供了從如上所述的表達人抗CD20抗體的轉(zhuǎn)基 因非人動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠中分離的B細(xì)胞。分離的B細(xì)胞隨后可以通過與永生化細(xì)胞 融合而進行永生化，以提供一和人抗CD20抗體的來源(即，雜交瘤)。這種雜交瘤(即，產(chǎn) 生人抗⑶20的)也包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。如本文所例示的，本發(fā)明的抗體可以直接從表達該抗體的雜交瘤中獲得，或者可 以在宿主細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞、NS/0細(xì)胞或淋巴細(xì)胞)中進行克隆和重組表達。宿主細(xì) 胞的另外的例子為微生物，如大腸桿菌(E. coli)，和真菌，如酵母?；蛘撸鼈兛梢酝ㄟ^在 轉(zhuǎn)基因非人動物或植物中進行重組生產(chǎn)。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)結(jié)合到 人CD20上的人單克隆抗體的方法。在一個實施方案中，該方法包括用純化的或高濃度的人 CD20抗原制品和/或表達人CD20的細(xì)胞免疫一種如前所述的轉(zhuǎn)基因非人動物，例如，轉(zhuǎn)基 因小鼠(例如，具有包含編碼抗CD20抗體的全部或部分的人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的 基因組)。隨后獲得B細(xì)胞(例如，脾B細(xì)胞)并且與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成分泌抗CD20 人單克隆抗體的永生的雜交瘤細(xì)胞。仍然在另一個方面，本發(fā)明提供編碼人抗CD20抗體(例如，其可變區(qū))的核酸分 子，以及包含本發(fā)明的核酸的重組表達載體，和用載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還包括通過 培養(yǎng)這些宿主細(xì)胞來生產(chǎn)抗體的方法。本發(fā)明所提供的特定核酸包含SEQ ID N0s:l、5或 9和SEQ IDNOs :3、7或11中所示的核苷酸序列，它們分別編碼人抗CD20抗體2F2、7D8和 11B8的重鏈和輕鏈。由下面的詳細(xì)介紹和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特征和益處將是顯而易見的。附圖簡述

圖1顯示用作重組生產(chǎn)人單克隆抗體2F2和11B8的pCON y lf/可變重載體。圖2顯示用作重組生產(chǎn)人單克隆抗體2F2和11Β8的pCONic If/可變輕載體。圖3顯示用作重組生產(chǎn)人單克隆抗體2F2和11B8的二基因克隆載體(pCON γ If/ κ 2F2)ο圖4是利用流式細(xì)胞分析比較人單克隆抗體2F2、7D8和11B8結(jié)合到Raji，Daudi， 和CD20轉(zhuǎn)染的NS/0細(xì)胞和親本NS/0細(xì)胞的圖。圖5A和5B利用流式細(xì)胞分析顯示2F2與來自三個人供體的PBMC的結(jié)合。圖6是比較125I-標(biāo)記的2F2和125I-標(biāo)記的11B8與Ramos-EHRB細(xì)胞的結(jié)合親和 性的圖。圖7A和7B顯示與125I-標(biāo)記的利妥?，?嵌合性抗CD20抗體，IDEC)和125I-標(biāo)記的Bl (術(shù)語Bl相應(yīng)于Bexxar 的未標(biāo)記形式，它是131I-標(biāo)記的鼠抗人CD20抗體，Coulter) 比較125I-標(biāo)記的2F2和125I-標(biāo)記的11B8對于Ramos-EHRB細(xì)胞(A)和Daudi細(xì)胞(B)的
社a
？口口。圖8是比較125I-標(biāo)記的11B8T、125I-標(biāo)記的2F2、125I_標(biāo)記的利妥希瑪和125I-標(biāo) 記的Bl的解離速率的圖。圖9顯示在Ramos-EHRB細(xì)胞中2F2、11B8T和利妥?，?shù)腇(ab，)2片段的解離速率。圖IOA和IOB利用流式細(xì)胞分析顯示由2F2T、11B8T、7D8、利妥?，敽虳audi細(xì)胞 (A)以及SU-DHL-4細(xì)胞(B)的同型對照抗體(HuMab-KLH)在不同的時間點進行的CDC(功 能性 off-rate)。圖IlA-E利用流式細(xì)胞分析顯示在不同細(xì)胞系中由2F2和利妥?，斦T導(dǎo)的⑶C的 動力學(xué)。圖12A-D利用流式細(xì)胞分析顯示在不同細(xì)胞系中由2F2和利妥?，斦T導(dǎo)的CDC作 為在兩種不同抗體濃度上的補體濃度(正常的人血清(NHS))的功能。圖13A-D利用流式細(xì)胞分析顯示在不同細(xì)胞系中由2F2和利妥?，斶M行的CDC的 濃度依賴性誘導(dǎo)。圖 14A 和 14B 顯示在 Daudi 細(xì)胞(A)和 Raji 細(xì)胞(B)中由 2F2、2F2T、11B8T、Bl 和利妥希瑪進行的CDC的濃度依賴性誘導(dǎo)。圖15A和15B是比較由人單克隆抗體2F2、7D8和11B8以及利妥?，斶M行的Daudi 細(xì)胞(表達低水平CD55/59的細(xì)胞)的CDC的圖；(A)顯示未洗滌細(xì)胞的百分比裂解而(B) 顯示在加入血清之前進行洗滌的細(xì)胞的裂解。圖16A和16B是比較由人單克隆抗體2F2、7D8和11B8以及利妥?，斶M行的Raji 細(xì)胞(表達高水平⑶55/59的細(xì)胞)的⑶C的圖；(A)顯示未以抗⑶55和抗⑶59抗體阻 抑的細(xì)胞的裂解而(B)顯示以抗CD55和抗CD59抗體阻抑的細(xì)胞的裂解。圖17A-C顯示在Raji細(xì)胞中由2F2和利妥?，斦T導(dǎo)的⑶C中⑶55和⑶59的作 用。(A)顯示在加入抗⑶55抗體之后裂解細(xì)胞的百分率，(B)顯示在加入抗⑶59抗體之后 裂解細(xì)胞的百分率，而(C)顯示加入抗⑶55和抗⑶59抗體二者之后裂解細(xì)胞的百分率。圖18A-D顯示通過流式細(xì)胞分析所測定的在不同細(xì)胞系中由2F2和利妥?，斶M行 的補體因子Clq的結(jié)合。圖19A-D顯示通過流式細(xì)胞分析所測定的在不同細(xì)胞系中由2F2和利妥希瑪進行 的補體因子片段C4c的沉積。圖20顯示在PMNs、MNCs、血漿或全血存在時由2F2、利妥希瑪和11B8T進行的 ARH-77細(xì)胞的裂解。圖21顯示在PMNs、MNCs、血漿或全血存在時由2F2、利妥?，敽?1B8T進行的 B-CLL細(xì)胞的裂解。圖22顯示在PMNs、MNCs、血漿或全血存在時由2F2、利妥?，敽?1B8T進行的 HCL(毛細(xì)胞白血病)細(xì)胞的裂解。圖23顯示在PMNs、MNCs、血漿或全血存在時由2F2和利妥?，斶M行的B-ALL細(xì)胞 的裂解。
圖24顯示在PMNs、MNCs、血漿或全血存在時由2F2、利妥?，敽?1B8T進行的濾泡 淋巴瘤(FL)細(xì)胞的裂解。圖25顯示在PMNs、MNCs、血漿或全血存在時由2F2、利妥?，敽?1B8T進行的套細(xì) 胞的裂解。圖26顯示在全血存在時由2F2和利妥?，斶M行的ARH-77細(xì)胞的濃度依賴性裂解。圖27顯示由2F2T、11B8T和利妥?，斶M行的ARH-77細(xì)胞的MNC介導(dǎo)的裂解。圖28顯示由2F2T、11B8T和利妥希瑪進行的Raji細(xì)胞的麗C介導(dǎo)的裂解。圖29A、B和C是利用FRET分析和Triton-X不溶性測試顯示在用2F2、7D8或11B8 溫育之后脂筏中CD20的集聚的圖。圖30利用FRET分析顯示在用2F2、利妥?，敾?1B8T溫育之后脂筏中⑶20的集
聚ο圖31顯示在用TritonX-IOO(TX)處理和用2F2、利妥希瑪或11B8T溫育之后保留 在不可溶的筏部分中的⑶20的比例。圖32顯示在用2F2、利妥?，敾?1B8T刺激Daudi細(xì)胞之后在筏和非筏膜部分之 間CD20的分布。圖33A-G利用流式細(xì)胞分析顯示由2F2、7D8和11B8進行的Daudi細(xì)胞的凋亡。圖34利用流式細(xì)胞分析顯示由2F2、11B8T、利妥希瑪或Bl進行的Raji細(xì)胞凋亡 的誘導(dǎo)。圖35A利用流式細(xì)胞分析顯示由2F2T、11B8T、利妥希瑪或Bl進行的Daudi細(xì)胞凋 亡的誘導(dǎo)。圖35B利用流式細(xì)胞分析顯示由人單克隆抗體2F2T、11B8T、利妥?，敽虰l進行的 Daudi細(xì)胞的早期和晚期凋亡。圖36A-E利用光學(xué)顯微鏡顯示由2F2、7D8和11B8進行的Ramos-EHRB細(xì)胞的同型粘著。圖37利用光學(xué)顯微鏡顯示由2F2、利妥?，敽虰l進行的Daudi細(xì)胞的同型粘著。圖38是顯示用Daudi細(xì)胞注射并且用2F2或7D8處理的SCID小鼠百分比存活率 的圖。圖39顯示用Tanoue細(xì)胞注射并且用2F2、利妥?，敾駼l處理的SCID小鼠的百分 比存活率。圖40顯示用Daudi細(xì)胞注射并且用不同濃度的2F2或利妥希瑪處理的SCID小鼠 的百分比存活率。圖41顯示用Daudi細(xì)胞注射并且用11B8T或Bl處理的SCID小鼠的百分比存活率。圖42顯示在39天(用10 μ g的Bi、利妥?，?、11B8T、2F2T或hulgGI處理之后31 天)時SCID小鼠中腫瘤細(xì)胞的生物發(fā)光圖像。如在小鼠的黑色和白色身體圖像中所涂布 的生物發(fā)光以紅色代表(小鼠中的暗區(qū)域)(光強度> 50光子每分鐘)。圖43通過整合身體表面的光信號顯示在給藥10μ gBl、利妥?，敗?1B8T、2F2T或 hulgGI之后的第25、32、39和46天，以及第8天量化的每只小鼠中的腫瘤質(zhì)量。
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圖 44A-C 顯示以不同的劑量 4X1. 25mk/kg(A)、4X6. 25mg/kg(B)或 4X12. 50mg/ kg(C)靜脈內(nèi)給藥2F2或利妥?，斨笤谑承泛锿庵苎蠧D20+細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。圖 45A-C 顯示以不同的劑量 4X1. 25mk/kg(A)、4X6. 25mg/kg(B)或 4X12. 50mg/ kg(C)靜脈內(nèi)給藥2F2或利妥?，斨笤谑承泛锿庵苎蠧D21+細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。圖 46A-C 顯示以不同的劑量 4X1. 25mk/kg(A)、4X6. 25mg/kg(B)或 4X12. 50mg/ kg(C)靜脈內(nèi)給藥2F2或利妥希瑪之后在食蟹猴淋巴節(jié)中CD20+細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。圖 47A-C 顯示以不同的劑量 4X1. 25mk/kg(A)、4X6. 25mg/kg(B)或 4X12. 50mg/ kg (C)靜脈內(nèi)給藥2F2或利妥?，斨笤谑承泛锿庵苎斜磉_⑶ZO^raZS+CD^highCDZO+的 細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。圖48A-E顯示如流式細(xì)胞分析所測定的利妥?，敘臁?F2⑶、11B8 (C)、Bl⑶或 同種型對照抗體(E)與表達野生型(WT)⑶20、突變體⑶20 (AxP)或WT⑶20以及突變體 ⑶20 (AxP) 二者的CHO細(xì)胞的結(jié)合。圖49A-F顯示2F2、11B8T、Bl或利妥?，斉c突變體P172S vs. WTCD20 (A)的百分 比結(jié)合，2 21\1讓81\ Bi、CAT (CAT 13. 6E12，一種小鼠單克隆 IgG2A 抗 CD20 抗體，Diatec. Com)、對照同種型抗體(KLH)或利妥?，斉c突變體CD20 (AxP) vs. WT CD20 (B)的百分比結(jié) 合，2F2、11B8T、B1或利妥希瑪與突變體W66D vs. WT CD20 (C)的百分比結(jié)合，2F2T、CAT或 利妥?，斉c突變體W66D vs.WTCD20(D)的百分比結(jié)合，2F2T、2F2、11B8T、B1或利妥希瑪與 突變體W63D vs. WT CD20 (E)的百分比結(jié)合，和2F2T、CAT或利妥?，斉c突變體W63D vs. WT ⑶20 (F)的百分比結(jié)合。圖50顯示如通過ELISA所測定的2F2T、7D8和同種型對照抗體與三種抗獨特型抗 體的結(jié)合，所述三種抗體是相對于2F2培育的抗2F2sab 1. 1，抗2F2sab 1. 2和抗2F2sab 1. 3。圖51顯示如通過ELISA所測定的11B8T與抗獨特型抗體的結(jié)合，所述抗體是相對 于11B8T培育的但不結(jié)合抗獨特型抗2F2抗體的抗11B8T sab 2. 2、抗11B8T sab 2. 3、抗 11B8T sab 2. 4、抗 11B8T sab 2. 5 和抗 11B8T sab 2.6。圖52A-C顯示如通過ELISA所測定的2F2T與三種抗獨特型抗體的劑量依賴型結(jié) 合，所述三種抗體是相對于2F2培育的抗2F2 sab 1. 1(A)、抗2F2 sab 1.2(B)和抗2F2 sab 1. 3(C)。圖53顯示人單克隆抗體2F2重鏈V區(qū)的氨基酸序列(SEQ IDNO 2)和輕(κ)鏈 V區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO :4)，標(biāo)明了⑶R區(qū)。圖54顯示人單克隆抗體2F2重鏈V區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO :1)和輕(κ )鏈 V區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO :3)。圖55顯示人單克隆抗體7D8重鏈V區(qū)的氨基酸序列(SEQ IDNO 6)和輕(κ )鏈 V區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO :8)，標(biāo)明了⑶R區(qū)。圖56顯示人單克隆抗體7D8重鏈V區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO 5)和輕(κ)鏈 V區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO :7)。圖57顯示人單克隆抗體11Β8重鏈V區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO 10)和輕(κ ) 鏈V區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID NO 12)。圖58顯示人單克隆抗體11Β8重鏈V區(qū)的核苷酸序列(SEQ IDNO 9)和輕(κ)鏈V區(qū)的核苷酸序列(SEQ ID Ν0:11)ο發(fā)明詳述本發(fā)明提供治療和診斷各種涉及表達CD20細(xì)胞的病癥的改良的基于抗體的療 法。本發(fā)明的療法使用特異性結(jié)合存在于CD20上的抗原表位的分離的人單克隆抗體。本 發(fā)明包括的分離的人單克隆抗體包括IgA、IgGl-4、IgE、IgM和IgD抗體。在一個實施方案中抗體為IgGl抗體，更特定地是一種IgGl，κ或IgGl，λ同種 型。在另一個實施方案中抗體為IgG3抗體，更特定地是一種IgG3，κ或IgG3，λ同種型。 還在另一個實施方案中抗體為IgG4抗體，更特定地是一種IgG4，κ或IgG4，λ同種型。仍 然在另一個實施方案中抗體為IgAl或IgA2抗體。仍然在在另一個實施方案中抗體為IgM抗體。在一個實施方案中，通過進行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)化在能夠產(chǎn)生多種⑶20的 人單克隆抗體同種型的非人類轉(zhuǎn)基因動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠中生產(chǎn)人抗體。因此，本發(fā)明 的方面不僅包括抗體、抗體片段及其藥物組合，還包括非人類轉(zhuǎn)基因動物、B細(xì)胞、宿主細(xì)胞 和產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。這種轉(zhuǎn)基因動物還可以是產(chǎn)生如在US2003/0017534中公開 的抗體的轉(zhuǎn)基因兔。因此，本發(fā)明還包括特異性結(jié)合CD20的人多克隆抗體。在一個實施方 案中發(fā)明涉及結(jié)合CD20上表位的多克隆抗體，所述多克隆抗體(i)不包含或需要172位置 上的氨基酸殘基脯氨酸；( )不包含或需要170位置上的氨基酸殘基丙氨酸或172位置上 的脯氨酸；(iii)包含或需要163位置上的氨基酸殘基天冬酰胺或166位置上的天冬酰胺； (iv)不包含或需要172位置上的氨基酸殘基脯氨酸，但包含或需要163位置上的氨基酸殘 基天冬酰胺或166位置上的天冬酰胺；或(ν)不包含或需要170位置上的氨基酸殘基丙氨 酸或172位置上的脯氨酸，但包含或需要163位置上的氨基酸殘基天冬酰胺或166位置上 的天冬酰胺。在另一個實施方案中發(fā)明涉及具有一種或多種下列特性的人多克隆抗體(i)以 至少與人⑶20相同的親和性結(jié)合突變體P172S⑶20 (172位置上的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸) ( )以至少與人⑶20相同的親和性結(jié)合突變體AxP(170位置上的丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸， 172位置上的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸)；(iii)與人⑶20相比于10 μ g/ml的抗體濃度顯示與 突變體W66D的減弱50%或更多的結(jié)合；和/或(iv)與人⑶20相比于10μ g/ml的抗體 濃度顯示與突變體W63D的減弱50%或更多的結(jié)合。還在另一個實施方案中發(fā)明涉及結(jié)合人CD20的第一胞外小環(huán)中的抗原表位的人 多克隆抗體。仍然在另一個實施方案中發(fā)明還包括結(jié)合CD20上不連續(xù)抗原表位的人多克 隆抗體。在進一步的實施方案中發(fā)明涉及結(jié)合CD20上不連續(xù)抗原表位的人多克隆抗體，它 具有部分第一細(xì)胞外小環(huán)和部分第二細(xì)胞外環(huán)。仍然在進一步的實施方案中發(fā)明涉及結(jié)合 CD20上不連續(xù)抗原表位的人多克隆抗體，它具有第一細(xì)胞外小環(huán)的殘基AGIYAP和第二胞 外環(huán)的殘基MESLNFIRAHTPH。發(fā)明包括利用發(fā)明的抗體檢測表達CD20的細(xì)胞的方法。還提供利用發(fā)明的抗體 阻抑或抑制CD20誘導(dǎo)的活性，例如增殖和/或分化活性的方法，它在與CD20相關(guān)的病癥， 如致瘤性疾病(例如，B細(xì)胞淋巴瘤)和自身免疫疾病(例如，RA、Chrohn氏病和Wegener 氏肉芽腫病)的治療中是有用的。為了可以更加容易地理解本發(fā)明，首先定義某些術(shù)語。其它的定義在整個詳述中全A屮
5 口 OD。術(shù)語“⑶20”和“⑶20抗原”在本文中可以交換使用，包括人⑶20的任何變異體、 亞型和物種同源物，它被細(xì)胞天然地表達或表達于用CD20基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上。本發(fā)明的抗 體結(jié)合到⑶20抗原上介導(dǎo)通過滅活⑶20殺死表達⑶20的細(xì)胞?？梢酝ㄟ^一種或多種下 列機制殺死表達⑶20的細(xì)胞表達⑶20的細(xì)胞的補體依賴性細(xì)胞毒性(⑶C)；表達⑶20的細(xì)胞的凋亡；表達⑶20的細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞吞噬作用；或表達⑶20的細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。如本領(lǐng)域中所認(rèn)識的，⑶20的同義詞包括B淋巴細(xì)胞抗原⑶20、B淋巴細(xì)胞表面 抗原 Bi、Leu-16、Bp35、BMS 和 LF5。如本文所用的，術(shù)語“抑制生長”(例如，指細(xì)胞的)意在包括與不和抗⑶20抗體 接觸的相同細(xì)胞的生長比較，當(dāng)與抗CD20抗體接觸時細(xì)胞生長的可測量的降低，例如至少 大約 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%或 100% 的細(xì)胞培養(yǎng)物生長 的抑制。這種細(xì)胞生長的降低能夠以多種機制發(fā)生，例如，效應(yīng)細(xì)胞吞噬作用、ADCC、⑶C和
/或凋亡。術(shù)語“筏”指位于細(xì)胞質(zhì)膜外片區(qū)的富含鞘磷脂和富含膽固醇的膜微域。某些蛋 白質(zhì)在這種域內(nèi)聯(lián)合的能力可以影響蛋白質(zhì)的功能。例如，在用本發(fā)明的抗體結(jié)合之后，將 CD20易位到脂筏中，在質(zhì)膜中產(chǎn)生了高密度的CD20抗原-抗體復(fù)合物。這種高密度的CD20 抗原_抗體復(fù)合物可以使得在CDC期間有效激活補體系統(tǒng)成為可能。如本文所稱的術(shù)語“抗體”包括完整的抗體及其任何抗原結(jié)合片段(即，“抗原結(jié) 合部分”)或單鏈?？贵w表示包括通過二硫鍵相互連接的至少兩個重(H)鏈和兩個輕(L) 鏈的糖蛋白。每一個重鏈由一個重鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)組成。每 一個輕鏈由輕鏈可變區(qū)(在本文中縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)組成。所述VL和VH區(qū)可以進 一步劃分成被稱為互補決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，和散布在其中的被稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保 守的部分。每一個VH和VL都由三個CDRs和四個FRs組成，從氨基末端到羧基末端的排列 順序如下FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。所述重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相 互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述抗體的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子的結(jié)合， 包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補體系統(tǒng)的第一種組分(Clq)。如本文所使用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或者簡稱為抗體部分)表示保留了 與一種抗原(例如，CD20)特異性結(jié)合的能力的抗體的一個或多個片段。已經(jīng)顯示，抗體的 抗原結(jié)合功能可以通過完整長度抗體的片段實施。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”所包括的結(jié) 合片段的例子包括(丨汗油片段，由￥1^!1、仏和011結(jié)構(gòu)域組成的一價片段；(ii)F(ab' )2 片段，在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的包括兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CHl結(jié)構(gòu)域 組成的Fd片段；(iv)由抗體的一個臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(ν)由VH結(jié)構(gòu)域組 成的 dAb 片段(Ward 等，(1989)，Nature 341 ；544-546) ； (vi)分離的互補決定區(qū)(CDR)，和 (vii)優(yōu)選通過合成的連接子聯(lián)結(jié)的兩種或多種分離的CDRs的組合。而且，盡管Fv片段的 兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH是由分離的基因編碼的，但可以利用重組方法通過合成的連接子將它 們結(jié)合在一起，以使它能夠產(chǎn)生單一的蛋白鏈，其中，VL和VH區(qū)配對形成單價分子(被稱為單鏈 Fv(scFv)；參見例如，Bird 等，(1988)，Science 242 :423_426 ；和 Huston 等，(1988)， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 =5879-5883) 這種單鏈抗體同樣被認(rèn)為包括在術(shù)語抗體的 “抗原結(jié)合部分”的含義范圍內(nèi)。另一個例子是結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白，包含(i) 融合到免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽上的一種結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽(如重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū))， ( )融合到鉸鏈區(qū)上的一種免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，和(iii)融合到CH2恒定區(qū)上的 免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)。這類結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白在US 2003/0118592和 US 2003/0133939中得到進一步介紹。這些抗體片段是利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的常規(guī) 技術(shù)獲得的，并且以篩選完整抗體的相同方法篩選所述片段的用途。術(shù)語“抗原表位”意為一種能夠特異性結(jié)合到一種抗體上的蛋白質(zhì)決定簇?？乖?表位通過由分子的化學(xué)活性表面簇如氨基酸或糖側(cè)鏈組成并且通過具有特異性的三維結(jié) 構(gòu)特性，以及特異性的電荷特性。構(gòu)象性和非構(gòu)象性抗原表位的區(qū)別在于在變性溶劑存在 時前者的結(jié)合喪失，而后者則不然。如本文所用的術(shù)語“不連續(xù)抗原表位”，意為一種由蛋白質(zhì)原始序列中的兩個獨立 區(qū)所形成的構(gòu)象性抗原表位。術(shù)語“雙特異性分子”意在包括諸如蛋白質(zhì)、肽、或蛋白質(zhì)或肽復(fù)合物的具有兩種 不同的結(jié)合特異性的任何制劑。例如，所述分子可以結(jié)合(a)細(xì)胞表位抗原和(b)位于效應(yīng) 細(xì)胞表面上的Fc受體，或與之相互作用。術(shù)語“多特異性分子”或“異特異性分子”意在包 括諸如蛋白質(zhì)、肽、或蛋白質(zhì)或肽復(fù)合物的具有兩種以上不同的結(jié)合特異性的任何制劑。例 如，所述制劑可以結(jié)合(a)細(xì)胞表面抗原，(b)效應(yīng)細(xì)胞表面上的Fc受體，和(c)至少一種 其它成分，或與之相互作用。因此，本發(fā)明包括，但不限于針對細(xì)胞表面抗原，如⑶20和針 對效應(yīng)細(xì)胞上的其它靶，如Fc受體的雙特異性、三特異性、四特異性和其它多特異性分子。術(shù)語“雙特異性抗體”還包括雙抗體(diabodies)。雙抗體是二價雙特異性抗體， 其中，VH和VL結(jié)構(gòu)域是在單一的多肽鏈上表達的，但是所使用的連接子太短，以至于不能 使這兩個結(jié)構(gòu)域在同一個鏈上配對，從而迫使這兩個結(jié)構(gòu)域與另一個鏈上的互補結(jié)構(gòu)域配 對，并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合部位(參見例如，Holliger，P.等，(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448 ；Poljak, R. J.等，(1994) Structure〗1121-1123)。術(shù)語“人抗體衍生物”指該抗體的任何修飾形式，例如該抗體和另一種制劑或抗體 的共軛物。如本文所用的，如果該抗體獲自一種使用人免疫球蛋白序列的系統(tǒng)的話，例如，通 過免疫一種攜帶人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠或通過篩選人免疫球蛋白基因文庫，人抗 體“源自”特定的種系序列，并且其中選擇的人抗體在氨基酸序列上與由該種系免疫球蛋 白基因所編碼的氨基酸序列至少90%，更加優(yōu)選至少95%，甚至更加優(yōu)選至少96%、97%、 98%或99%相同。一般地，源自特定人種系序列的人抗體會顯示與該種系免疫球蛋白基因 所編碼的氨基酸序列不超過10個氨基酸的差異，更加優(yōu)選地，不超過5個，或甚至更加優(yōu)選 地，不超過4、3、2或1個氨基酸的差異。如本文所用的，術(shù)語“異源抗體”是指兩種或多種抗體、其衍生物或連接在一起的 抗原結(jié)合區(qū)，至少其中的兩個具有不同的特異性。這種不同的特異性包括對效應(yīng)細(xì)胞上Fc 受體的結(jié)合特異性，和諸如腫瘤細(xì)胞的靶細(xì)胞上的抗原或表位的結(jié)合特異性。如本文所用的，術(shù)語“人抗體”意在包括具有源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)
20和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括不是由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘 基(例如，通過體外隨機的或位點特異性的誘變或通過體內(nèi)體細(xì)胞突變導(dǎo)入的突變)。不 過，本文所使用的術(shù)語“人抗體”并不包括這樣的抗體其中，源于另一種哺乳動物，如小鼠 的的⑶R序列業(yè)已嫁接到人框架序列上。如本文所使用的術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”表示具有單一分子組 合物的抗體分子的制劑。單克隆抗體組合物表現(xiàn)出對一種特定表位的單一的結(jié)合特異性和 親和力。因此，術(shù)語“人單克隆抗體”表示具有源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定 區(qū)的表現(xiàn)出單一結(jié)合特異性的抗體。在一個實施方案中，人單克隆抗體是通過雜交瘤產(chǎn)生 的，所述雜交瘤包含獲自轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體非人動物，例如轉(zhuǎn)基因小鼠的B細(xì)胞，所述B細(xì) 胞具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組并且融合于一種永生化細(xì)胞。如本文所用的術(shù)語“重組人抗體”包括通過重組方法制備、表達、產(chǎn)生或分離的所 有人抗體，如(a)從人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體動物(例如，小鼠)體內(nèi)或由該 基因制備的雜交瘤分離的抗體(在下面的I節(jié)中進一步說明)；(b)由表達該抗體的轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞，例如，由一種轉(zhuǎn)染瘤中分離的抗體，(c)從重組的組合人抗體文庫中分離的抗體 和(d)通過涉及到將人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列上的任何其它方法制備、 表達、產(chǎn)生或分離的抗體。這種重組人抗體具有源于人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒 定區(qū)。不過，在某些實施方案中，可以將這類重組人抗體進行體外誘變(或在使用人Ig序 列的轉(zhuǎn)基因動物時，進行體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因此，所述重組抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列 是這樣的序列盡管所述序列源于并相關(guān)于人種系VH和VL序列，但是它可能并非天然體內(nèi) 存在于人抗體種系成分中。如本文所用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)染瘤”包括表達所述抗體的重組真核宿主細(xì)胞，如CHO細(xì) 胞、NS/0細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌，包括酵母。如本文所用的，術(shù)語“異源抗體”是相對產(chǎn)生這種抗體的轉(zhuǎn)基因非人生物定義的。 該術(shù)語表示這樣一種抗體該抗體的氨基酸序列或編碼核酸序列對應(yīng)發(fā)現(xiàn)于不包括所述轉(zhuǎn) 基因非人動物的生物中的序列，并且通常來自除了所述轉(zhuǎn)基因非人動物之外的物種。如本文所用的，“異源雜合抗體”表示具有不同生物的輕鏈和重鏈的抗體。例如，具 有與鼠類輕鏈結(jié)合的人重鏈的抗體就是異源雜合抗體。這種異源雜合抗體的例子包括嵌合 抗體和人源化抗體，如上所述。如本文所用的，“分離的抗體”意指基本上不含具有不同抗原特異性的其它抗體的 抗體(例如，特異性結(jié)合CD20的分離的抗體基本上不含能特異性結(jié)合除了 CD20的抗原的 抗體)。不過，特異性結(jié)合人CD20的抗原表位、亞型或變異體的分離的抗體可能具有對其它 相關(guān)抗原，例如來自其它物種的抗原(例如，CD20物種同源物)的交叉反應(yīng)性。而且，分離 的抗體可能基本上不含其它細(xì)胞物質(zhì)和/或化合物。在本發(fā)明的一個實施方案中，在一種 充分定義的組合物中將具有不同特異性的“分離的”單克隆抗體組合在一起。如本文所用的，術(shù)語“特異性結(jié)合”表示抗體與預(yù)定的抗原結(jié)合。一般，所述抗體 的結(jié)合親和力相應(yīng)于大約ι χ IO-7M或更小的KD，并且與預(yù)定抗原的結(jié)合親和力比與除了所 述預(yù)定抗原或密切相關(guān)抗原之外的非特異性抗原(例如，BSA，酪蛋白)的結(jié)合親合力高至 少兩個數(shù)量級。在本文中，短語“識別一種抗原的抗體”和“對一種抗原特異的抗體”可以 與術(shù)語“特異性結(jié)合一種抗原的抗體”互換使用。(sec"1)意指特定抗體_抗原相互作用的解離速率常數(shù)。
(Μ"1 X sec"1)意指特定抗體_抗原相互作用的締合速率
(M)意指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數(shù)。 (Μ"1)意指特定抗體_抗原相互作用的締合平衡常數(shù)，并
表示由重鏈恒定區(qū)基因編碼的抗體類型(例如，IgM或如本文所用的，術(shù)語“K/ 所述值也稱為K。ff值。如本文所用的，術(shù)語“K/ 常數(shù)。所述值也稱為K。ff值。如本文所用的，術(shù)語“K/'如本文所用的，術(shù)語“K/ 且它通過Ka除以Kd來獲得。如本文所用的，“同種型' IgGl)。如本文所用的，“同種型轉(zhuǎn)換”表示一種抗體的類型或同種型從一種Ig類型轉(zhuǎn)變成 另一種Ig類型的現(xiàn)象。如本文所用的，“非轉(zhuǎn)換同種型”表示在沒有發(fā)生同種型轉(zhuǎn)換時所產(chǎn)生的重鏈的同 種型類型；編碼非轉(zhuǎn)換同種型的CH基因一般緊挨著功能性重排VDJ基因下游的第一個CH 基因。業(yè)已將同種型轉(zhuǎn)換劃分成經(jīng)典的或非經(jīng)典的同種型轉(zhuǎn)換。經(jīng)典的同種型轉(zhuǎn)換是通過 重組事件發(fā)生的，它包括位于所述轉(zhuǎn)基因上的至少一個轉(zhuǎn)換序列區(qū)。非經(jīng)典同種型轉(zhuǎn)換可 以通過諸如人σ μ和[μ (δ-相關(guān)的缺失)之間的同源重組完成。其它的非經(jīng)典轉(zhuǎn)換機 制，如轉(zhuǎn)基因間和/或染色體間的重組也可能發(fā)生，并實現(xiàn)同種型轉(zhuǎn)換。如本文所用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)換序列”表示負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)換重組的DNA序列。一般為μ轉(zhuǎn)換 區(qū)的“轉(zhuǎn)換供體”序列將會在轉(zhuǎn)換重組期間將要缺失的構(gòu)建體區(qū)的5'末端(即上游)?！稗D(zhuǎn) 換受體”區(qū)將位于將要缺失的構(gòu)建體區(qū)和置換的恒定區(qū)(例如，Y、ε等)之間。由于沒有 經(jīng)常發(fā)生重組的特定位點，一般無法根據(jù)所述構(gòu)建體預(yù)測最終的基因序列。如本文所用的，“糖基化形式”被定義為與蛋白，更具體的是與免疫球蛋白共價結(jié) 合的碳糖單位的形式。當(dāng)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員認(rèn)為異源抗體的糖基化形式與來自獲得所述 轉(zhuǎn)基因的CH基因的物種相比更類似于所述非人轉(zhuǎn)基因動物物種的糖基化形式時，異源抗 體的糖基化形式可以被鑒定為基本類似于由所述非人轉(zhuǎn)基因動物物種所產(chǎn)生的抗體上天 然存在的糖基化形式。如本文所用的，用在一種客體上的術(shù)語“天然存在的”表示一種物體可以在自然界 中找到的事實。例如，可以從天然來源分離，并且沒有在實驗室中做過人為有意修飾的、存 在于一種生物(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本文所用的術(shù)語“重排的”表示重鏈或輕鏈免疫球蛋白基因座的一種構(gòu)象，其中 在編碼基本完整的VH或VL結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象中，V片段的位置分別緊挨著D-J或J片段?？?以通過與種系DNA比較確定重排的免疫球蛋白(抗體)基因座；重排的基因座具有至少一 個重組的七聚體/九聚體同源元件。如本文所用的關(guān)于V片段的術(shù)語“未重排的”或“種系構(gòu)象”表示這樣一種構(gòu)象， 其中V片段不是重組的，以便它緊挨著D或J片段。如本文所用的，術(shù)語“核酸分子”意在包括DNA和RNA分子。核酸分子可以是單鏈 或雙鏈的，但優(yōu)選雙鏈DNA。如本文所用的關(guān)于與CD20結(jié)合的抗體或抗體部分(例如，Vh、\、CDR3)的核酸的術(shù) 語“分離的核酸分子”意在表示這樣一種核酸分子，其中編碼完整抗體或抗體部分的核苷酸
22序列不含編碼能結(jié)合除了 CD20以外的抗原的完整抗體抗體部分的核苷酸序列，其它序列 可以天然存在于人基因組DNA上的核酸側(cè)翼。在一個實施方案中，人抗⑶20抗體包括2F2、 7D8或11B8的核苷酸或氨基酸序列，以及分別具有SEQ ID Nos :1、5或9和SEQ ID Nos :3、 7或11所示序列的重鏈(Vh)和輕鏈可變區(qū)。如本文所公開和要求的，SEQ ID NOs 1_30中所示的序列包括“保守性序列修飾 物”，即，不顯著影響或改變由該核苷酸序列編碼或包含該氨基酸序列的抗體結(jié)合特性的核 苷酸和氨基酸序列修飾物。這類保守性序列修飾物包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。 可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如定點突變和PCR介導(dǎo)的突變將修飾引入SEQID NOs 1-30中。保守性氨基酸取代包括這種取代，其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基 所取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已在本領(lǐng)域進行定義。這些家族包括具有堿性側(cè) 鏈(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不帶電荷的極性 側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非 極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)，β分支的 側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組 氨酸)。因此，優(yōu)選用來自相同側(cè)鏈家族的另一種氨基酸殘基來代替在人抗CD20抗體中預(yù) 定的非必需氨基酸殘基。本發(fā)明還包括SEQ ID NOs :1_30中所示的氨基酸序列的“衍生物”及其保守性序 列修飾物，其中例如通過?；蛱腔饔脤σ环N或多種氨基酸殘基進行衍化，而不顯著 地影響或改變含有該氨基酸序列的抗體的結(jié)合特性。另外，本發(fā)明包括這樣的抗體，其中在Fc區(qū)進行變換以便改變所述抗體的功能特 性或藥物動力學(xué)特性。這類變換可能導(dǎo)致Clq結(jié)合和⑶C或Fc γ R結(jié)合ADCC的降低或增 強。例如，在重鏈恒定區(qū)的位置234、235、236、237、297、318、320和322可以進行取代，由此 引發(fā)效應(yīng)物功能的變化，同時與未修飾的抗體相比(參看US 5，624，821和US 5，648，260) 保持結(jié)合抗體的能力。通過修飾Ig恒定區(qū)或類Ig恒定區(qū)的補救受體表位使得該分子不包含完整的CH2 區(qū)或完整的Ig Fc區(qū)，參見US 6，121，022和US 6，194，551，也可以提高抗體的體內(nèi)半衰期。 另外體內(nèi)半衰期還可以通過在Fc區(qū)中制造突變，例如，通過在位置252取代蘇氨酸為亮氨 酸，通過在位置254取代蘇氨酸為絲氨酸，或通過在位置256取代蘇氨酸為苯丙氨酸，參見 US 6，277，375，而得以提高。另外，可以修飾抗體的糖基化形式以便改變抗體的效應(yīng)物功能。例如，可以在一 種轉(zhuǎn)染瘤中表達抗體，所述轉(zhuǎn)染瘤不添加正常情況下附于Fc區(qū)的位置297上的天冬酰胺 的巖藻糖，從而導(dǎo)致在NK細(xì)胞存在時抗體的增強的ADCC，參見Shield等(2002) JBC, 277 26733。另外，可以進行半乳糖基化修飾以便改進CDC。或者，在另一個實施方案中，可以通過如飽和誘變在全部和部分抗⑶20抗體編碼 序列上隨機引入突變，并且可以篩選得到的修飾抗CD20抗體的結(jié)合活性。因此，由本文公開的(重鏈和輕鏈可變區(qū))核苷酸序列編碼的和/或包含本文公 開的(重鏈和輕鏈可變區(qū))氨基酸序列(即，SEQ IDNOs 1-30)的抗體，包括由已經(jīng)進行過 保守性修飾的相似序列編碼的或包含相似序列的基本上相似的抗體。可以在如下面提供的 SEQ IDNOs 1-30所公開的部分序列(即，重鏈和輕鏈可變區(qū))的基礎(chǔ)上進一步討論如何能夠生成這類基本上相似的抗體。對于核酸來說，術(shù)語“基本同源性”表示在對兩種核酸或其設(shè)計的序列進行優(yōu)化排 列和比較時，在具有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牒腿笔闆r下，其核苷酸的相同性至少為大約80%， 通常至少為大約90-95%，更優(yōu)選至少為大約98-99. 5%?；蛘?，當(dāng)所述片段在選擇性雜交 條件下與所述鏈的互補體雜交時，就存在基本同源性。對于核苷酸和氨基酸序列來說，術(shù)語 “同源性”表示在具有適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牒腿笔闆r下進行優(yōu)化排列和比較時兩種核酸或 氨基酸序列之間的相同性。或者，當(dāng)DNA片段在選擇性雜交條件下與所述鏈的互補體雜交 時，就存在基本同源性。兩種序列之間的相同性百分比是這兩種序列所共有的相同位點的數(shù)量的函數(shù) (即％同源性=相同位點的數(shù)量/位點的總數(shù)量X100)，考慮到了為了對這兩種序列進行 優(yōu)化比對而需要引入的空位數(shù)量和每一個空位的長度。兩種序列之間的序列比較和相同性 百分比的確定，可以利用在下面的非限定性實施例中所公開的數(shù)學(xué)算法完成。兩種核苷酸序列之間的相同性百分比可以利用GCG軟件包中的GAP程序(可以 在http://www. gcg. com獲得)確定，使用NWSgapdna. CMP矩陣和空位權(quán)數(shù)為40、50、60、70 或80，長度權(quán)數(shù)為1、2、3、4、5或6。兩種核苷酸或氨基酸序列之間的相同性百分比還可以 用 E. Meyers 和 W. Miller 的算法確定(Comput. Appl. Biosci.，4 :11_17，(1988))，該方法 業(yè)已整合到ALIGN程序(2. 0版)中，使用PAM120加權(quán)殘基表，空位長度罰分為12，而空位 罰分為4。另外，兩種氨基酸序列之間的相同性百分比可以用Needleman和WunschCJ. Mol. Biol. 48 =444-453, (1970))算法確定，該方法業(yè)已整合到GCG軟件包中的GAP程序中(可 以從http://www. gcg. com獲得)，使用Blossum62距陣或PAM250距陣，空位權(quán)數(shù)為16、14、 12、10、8、6或4，而長度權(quán)數(shù)為1、2、3、4、5或6。還可以將本發(fā)明的核酸和蛋白序列用作“查詢序列”對公共數(shù)據(jù)庫進行檢索，以 便，例如，鑒定相關(guān)的序列。所述檢索可以用Altschul等的NBLAST和XBLAST程序(2. O 版)完成(1990. J. Mol. Biol. 215 :403_10)。BLAST核苷酸檢索可以通過NBLAST程序完成， 得分等于100，字長等于12，以便獲得與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白 檢索可以通過XBLAST程序完成，得分=50，字長=3，以便獲得與本發(fā)明蛋白分子同源的氨 基酸序列。為了獲得用于比較目的的有空位的排列，可以使用Altschul等所公開的空位 BLAST (1997，NucleicAcids Res. 25(17) :3389_3402)。在采用 BLAST 和空位 BLAST 程序時， 可以使用相應(yīng)程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。參見http//www. ncbi. nlm. nih. gov。所述核酸可以存在于完整細(xì)胞、細(xì)胞裂解物中，或者以部分純化或基本上純的 形式存在。當(dāng)通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使核酸從諸如其它細(xì)胞核酸或蛋白的其它細(xì)胞成分或其它 污染物中純化出來時，它就是“分離的”或“成為基本上純的”，所述標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括堿/SDS 處理、氯化銫帶型、柱層析、瓊脂糖凝膠電泳和本領(lǐng)域公知的其它技術(shù)。參見F. Ausubel 等，編輯.Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishingand Wiley Interscience, New York，1987。盡管本發(fā)明的核酸組成經(jīng)常是以來自cDNA、基因組或其混合物的天然序列(修飾 過的限制位點等除外)存在，但可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對其進行誘變，以便提供基因序列。對于編碼序列來說，所述誘變可以按照需要影響氨基酸序列。具體地講，包括大體上同源于或源于 本文所述的天然V、D、J、恒定、轉(zhuǎn)換和其它諸如此類的序列的DNA序列(其中，“源于”表示 一種序列與另一種序列相同或者是由另一種序列修飾物而成)。當(dāng)一種核酸分子與另一種核酸序列置于功能性關(guān)系時，它就是“可操作地連接 的”。例如，如果啟動子或增強子能影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄的話，它們就是與編碼序列可操作 地連接的。就轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列而言，可操作地連接意味著所連接的DNA序列是相鄰的，并且有 必要連接兩個蛋白編碼區(qū)，相鄰并且存在于讀框內(nèi)。對于轉(zhuǎn)換序列來說，可操作地連接表示 有關(guān)序列能夠影響轉(zhuǎn)換重組。如本文所用的，術(shù)語“載體”意在表示能夠轉(zhuǎn)運業(yè)已連接在它上面的另一種核酸的 核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！?，它表示在它上面可以連接其它DNA片段的環(huán)狀雙鏈 DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中，可以將其它DNA片段連接在病毒基因組上。 某些載體能夠在導(dǎo)入了這種載體的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點的細(xì)菌 載體和附加型哺乳動物載體)。其它載體(例如，非附加型哺乳動物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞 時能夠整合到宿主細(xì)胞的基因組中，并因此與宿主基因組一起復(fù)制。另外，某些載體能夠指 導(dǎo)與它可操作地連接的基因的表達。在本文中，所述載體被稱為“重組表達載體”(或簡單 地稱之為“表達載體”)。一般，應(yīng)用于重組DNA技術(shù)中的表達載體通常是質(zhì)粒形式的。在 本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因為質(zhì)粒是最常使用載體的形式。不過，本發(fā) 明還包括所述其它形式的表達載體，如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒和 腺相關(guān)病毒)，這些病毒行使等同的功能。如本文所用的，術(shù)語“重組宿主細(xì)胞”(或簡單地稱之為宿主細(xì)胞)意在表示業(yè)已 導(dǎo)入了重組表達載體的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解的所述術(shù)語不僅僅表示特定的個體細(xì)胞，而且還包 括所述細(xì)胞的后代。由于在延續(xù)的世代中因為突變或環(huán)境影響可能發(fā)生某些修飾，事實上， 所述后代可能與親代細(xì)胞不相同，但這種細(xì)胞仍然屬于本文所使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”的范 圍。重組宿主細(xì)胞包括，例如，轉(zhuǎn)染瘤，如CHO細(xì)胞、NS/0細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。如本文所用的，術(shù)語“個體”包括任何人或非人動物。術(shù)語“非人動物”包括所有的 脊椎動物，例如哺乳類和非人哺乳類，如非人靈長類、羊、狗、牛、雞、兩棲動物和爬行動物。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的，非人動物”表示一種非人動物，它具有包含一種或多種人重鏈和/ 或輕鏈轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體(整合或非整合入動物的天然基因組DNA中)的并且能夠表達完 整人抗體的基因組。例如，轉(zhuǎn)基因小鼠可以具有人輕鏈轉(zhuǎn)基因和人重鏈轉(zhuǎn)基因或人重鏈轉(zhuǎn) 染色體，從而小鼠在用CD20抗原和/或表達CD20的細(xì)胞進行免疫時產(chǎn)生人抗CD20抗體。 人重鏈轉(zhuǎn)基因可以整合入小鼠的染色體DNA中，如轉(zhuǎn)基因的，例如，HuMAb小鼠，如HCo7或 HCol2小鼠的情況，或者人重鏈轉(zhuǎn)基因可以保持于染色體外，如WO 02/43478中所述的轉(zhuǎn)染 色體(例如，KM)小鼠的情況。通過進行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換這類轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體 小鼠能夠產(chǎn)生相對于CD20的多同種型的人單克隆抗體(例如，IgG, IgA和/或IgE)。在下面的各小節(jié)中將對本發(fā)明的各個方面作更詳細(xì)的說明。I.抗⑶20的人抗體的生產(chǎn)可以通過多種技術(shù)，包括傳統(tǒng)的單克隆抗體方法，例如Kohler和Milstein， Nature 256:495,(1975)的標(biāo)準(zhǔn)體細(xì)胞雜交技術(shù)來生產(chǎn)本發(fā)明的人單克隆抗體。盡管體細(xì) 胞雜交法在理論上是優(yōu)選的，但是可以利用生產(chǎn)單克隆抗體的其它技術(shù)，例如B淋巴細(xì)胞的病毒或致癌轉(zhuǎn)化或利用人抗體基因文庫的噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)。用于制備分泌人單克隆抗體的雜交瘤的優(yōu)選動物體系是鼠類體系。在小鼠中生產(chǎn) 雜交瘤是一種業(yè)已完善的方法。免疫方案和分離用于融合的免疫化的脾細(xì)胞的技術(shù)為本領(lǐng) 域所公知。融合配偶體(例如，鼠骨髓瘤細(xì)胞)和融合方法同樣是眾所周知的。在一種優(yōu)選實施方案中，抗CD20的人單克隆抗體可以用攜帶所述人免疫系統(tǒng)的 一部分而非小鼠系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠來產(chǎn)生。這些轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠在本文 中分別稱為“HuMAb”小鼠和KM小鼠，并且在本文中總稱為“轉(zhuǎn)基因小鼠”。HuMAb小鼠含有編碼未重排的人重鏈(μ和Y)和κ輕鏈免疫球蛋白序列的 人免疫球蛋白基因微型基因座，同時還含有使內(nèi)源μ和κ鏈基因座失活的定向突變 (Lonberg, N.等，(1994)，Nature368 (6474) :856_859)。因此，所述小鼠表現(xiàn)出小鼠 IgM 或 κ的表達減弱，并且在免疫應(yīng)答時，所導(dǎo)入的人重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因發(fā)生類型轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞 突變，產(chǎn)生高親和力IgGK單克隆抗體(Lonberg, N.等，(1994)，同上；綜述見于Lonberg， N.等，(1994)，Handbook of ExperimentalPharmacology 113 49-101 ；Lonberg, N.禾口 Huszar, D. (1995), Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 :65_93,禾口 Harding, F.禾口 Lonberg, N., (1995)，Ann. N. Y. Acad. Sci 764:536-546)。 在 Taylor，L.等，(1992) Nucleic Acids Research 20 6287-6295 ；Chen, J.等，(1993) InternationalImmunology 5:647-656; Tuaillon 等，(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :3720_3724 ;Choi.等，(1993)Nature Genetics 4 :117-123 ;Chen，J.等，(1993)EMBO J. 12 821-830 ；Tuaillon 等，(1994) J. Immunol. 152 2912-2920 ；Lonberg 等，(1994)Nature 368(6474) 856-859 ；Lonberg, N.，(1994)Handbook of ExperimentalPharmacology 113 :49_101 ；Taylor, L.等，(1994) InternationalImmunology 6 :579_591 ；Lonberg, N. and Huszar, D. (1995)Intern. Rev. Immuno 1. Vol. 13 :65_93 ；Harding, F.禾口 Lonberg，N. ， (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764 536-546 ；Fishwild, D.等(1996)NatureBiotechnology 14 :845_851 中詳細(xì)介紹了 HuMab 小鼠的制備。還參見美國專利 5545806 ；5569825 ；5625126 ；5633425 ；5789650 ；5877397 ； 5661016 ；5814318 ；5874299 ；和 5770429 ；以上所有專利均屬于 Lonberg ；以及屬于 Surani 等的美國專利 5545807 ；WO 98/24884、WO 94/25585、WO 93/1227、WO 92/22645、WO 92/03918 和 WO 01/09187。KM小鼠包含人重鏈轉(zhuǎn)染色體和人κ輕鏈轉(zhuǎn)基因。還在KM小鼠中破裂內(nèi)源性小鼠 重鏈和輕鏈基因，從而小鼠的免疫導(dǎo)致產(chǎn)生人免疫球蛋白而非小鼠免疫球蛋白。KM小鼠的 構(gòu)建以及它們培育人免疫球蛋白的應(yīng)用在WO 02/43478中進行了詳細(xì)介紹。免疫為了制備CD20的完整的人單克隆抗體，可以通過Lonberg，N.等(1994)同上 856-859 ；Fishwild,D.等(1996)同上和WO 94/24884中所述的方法用富集的CD20抗原制 品和/或表達CD20的細(xì)胞對包含免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠(例如，HCol2、 HCo7或KM小鼠)進行免疫?；蛘?，可以用編碼人⑶20的DNA免疫小鼠。優(yōu)選地，在第一 次輸注時，所述小鼠為6-16周齡。例如，可以通過腹膜內(nèi)注射方式用CD20抗原的富集制品 (5-50 μ g)對HuMab小鼠進行免疫。在用CD20抗原的純化或富集制劑進行免疫能產(chǎn)生抗體 時，還可以用表達CD20的細(xì)胞，例如，一種細(xì)胞系來免疫小鼠以促進免疫反應(yīng)。用各種抗原積累的經(jīng)驗業(yè)已表明，當(dāng)用存在于完全弗氏佐劑中的表達⑶20的細(xì)胞通過腹膜內(nèi)(IP)或皮下(SC)起始免疫，然后每隔一周用存在于PBS中的表達CD20的細(xì) 胞進行IP免疫(一共多達10次)時，所述HuMAb轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)答最強。在免疫接種過程 中，可以通過眼眶后取血獲得的血漿樣品監(jiān)測免疫應(yīng)答。可以通過FACS分析對所述血漿進 行篩選(如下所述的)，并且可以將具有足夠滴度的抗CD20人免疫球蛋白的小鼠用于融合。 在宰殺并取出脾臟之前3天，可以通過靜脈內(nèi)注射表達CD20的細(xì)胞對所述小鼠進行加強免 疫。制備產(chǎn)生抗CD20的人單克隆抗體的雜交瘤為了制備生產(chǎn)抗人CD20的人單克隆抗體的雜交瘤，可以從免疫小鼠中分離脾 細(xì)胞和淋巴節(jié)細(xì)胞并且與合適的免疫化細(xì)胞系相融合，如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系。隨后可以 對得到的雜交瘤篩選抗原特異性抗體的生產(chǎn)。例如，通過50%的PEG使來自免疫過的小 鼠的脾淋巴細(xì)胞的單細(xì)胞懸浮液與SP2/0-Ag 8. 653非分泌型小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC， CRL1580)融合。以大約2 X IO5每孔的密度將細(xì)胞鋪在平底微量滴定板上，然后在選擇培養(yǎng) 基中孵育2周，該培養(yǎng)基含有10%胎克隆血清，5-10% origen雜交瘤克隆因子(IGEN)和 IXHAT(Sigma)0大約2周之后在HAT被HT取代的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。然后通過ELISA篩 選每一個孔中的包含人κ輕鏈的抗體，并且通過FACS利用表達⑶20的細(xì)胞篩選⑶20的 特異性。一旦發(fā)生了廣泛的雜交瘤的生長，通常在10-14天之后對培養(yǎng)基進行觀察。將抗 體分泌雜交瘤重新鋪平板，再次篩選，并且如果人IgG抗CD20單克隆抗體仍然呈陽性的話， 可以通過限制稀釋亞克隆至少2次。然后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆，以便在組織培養(yǎng)基中 制備抗體用于鑒定。生產(chǎn)抗CD20的人單克隆抗體的轉(zhuǎn)染瘤的制備利用，例如本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合，還可以在宿主細(xì) 胞轉(zhuǎn)染瘤中生產(chǎn)本發(fā)明的人抗體(Morrison, S. (1985) Science 229 :1202)。例如，在一個實施方案中，可以將目的基因，例如，人抗體基因連接入一種表達載 體中，如在WO 87/04462,WO 89/01036和EP 338841中公開的GS基因表達系統(tǒng)或其它本領(lǐng) 域公知的表達系統(tǒng)所用的真核表達質(zhì)粒。可以將純化的具有克隆的抗體基因的質(zhì)粒導(dǎo)入真 核宿主細(xì)胞如CHO細(xì)胞、NS/0細(xì)胞或HEK293細(xì)胞或其它真核細(xì)胞像源于植物的細(xì)胞、真菌 或酵母的細(xì)胞中。用于導(dǎo)入這些基因的方法可以是本領(lǐng)域所公開的方法，如電轉(zhuǎn)化、脂染、 脂轉(zhuǎn)染胺或其它的方法。將這些抗體基因?qū)胨拗骷?xì)胞中后，可以鑒定并篩選表達該抗體 的細(xì)胞。這些細(xì)胞代表轉(zhuǎn)染瘤，隨后可以對其進行擴增以增加它們的表達水平并進行提高 以生產(chǎn)抗體。生產(chǎn)抗⑶20的人單克隆抗體的其它重組方法選擇性地，可以將克隆的抗體基因表達于其它表達系統(tǒng)中，包括原核細(xì)胞，如微 生物，如大腸桿菌(E. coli)以生產(chǎn)單鏈Fv抗體，藻類以及昆蟲細(xì)胞。另外，抗體可以 在轉(zhuǎn)基因非人動物，如在羊和免的奶中或在雞蛋中，或在轉(zhuǎn)基因植物中進行生產(chǎn)。見， 例如 Verma, R.等(1998). Antibody engineering !Comparison of bacterial，yeast, insectand mammalian expression systems.J. Immuyzol. Meth. 216 :165_181 ；Pollock 等 (1999).Transgenic milk as a method for the production ofrecombinant antibodies. J. Immunol. Meth. 231 147-157 ；禾口 Fischer，R.等(1999). Molecular farming of recombinant antibodies inplants· Biol· Chem· 380 :825_839。
利用部分抗體序列表達完整抗體抗體主要經(jīng)位于6個重鏈和輕鏈互補決定基區(qū)域(OTR)中的氨基酸殘基與靶抗原 相互作用。為此，單個抗體間CDR內(nèi)的氨基酸序列比CDR外的序列有更多變化。因為CDR序 列負(fù)責(zé)大多數(shù)抗體-抗原的相互作用，所以通過構(gòu)建表達載體表達重組抗體是可能的，這 些載體包括來自特殊的自然發(fā)生的抗體的CDR序列，其移植到來自帶有不同性質(zhì)的不同抗 體的框架序列上，這些抗體模仿特定的天然發(fā)生的抗體的性質(zhì)(見，例如，RieChmann，L.等 (1998)Nature 332 :323_327 Jones, P.等(1986)Nature 321 :522_525 ；和 Queen, C.等 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. . U. S. Α. 86 10029-10033)。該框架序列能從包括種系抗體基 因序列的公共DNA數(shù)據(jù)庫中獲得。這些種系序列將區(qū)別于成熟抗體基因序列，因為它們將 不包括完整裝配的可變基因，這些可變基因在B細(xì)胞成熟過程中由V (D) J連接形成。種系 基因序列在個別的甚至是整個可變區(qū)也將區(qū)別于高親和性所有二級抗體。但是，體細(xì)胞突 變不是均勻分布在可變區(qū)。例如，體細(xì)胞突變在框架區(qū)域1的氨基端部分和在框架區(qū)域4 的羧基端部分相對不常見。而且，許多體細(xì)胞突變不會顯著地改變抗體的結(jié)合特性。為此， 沒有必要為了再生出一種完整的含有與原始抗體相似的結(jié)合特性的重組抗體，獲得特定抗 體的完整DNA序列(參見WO 99/45962)?？缭舰荝區(qū)的部分重鏈和輕鏈序列通常足夠用于 本目的。部分序列用于測定哪些種系可變的和連接的基因區(qū)段有助于重組抗體可變基因。 種系序列然后用在填充可變區(qū)域的丟失部分。重鏈和輕鏈的前導(dǎo)序列在蛋白成熟過程中被 切下，因而不為最終抗體的性質(zhì)作貢獻。為了加入丟失的序列，可以將克隆的cDNA序列與 合成的寡核苷酸通過連接或PCR擴增進行結(jié)合?；蛘撸麄€可變區(qū)能合成為一組短小、重疊 的寡核苷酸合成并由PCR擴增組合從而產(chǎn)生一個完整的合成可變區(qū)克隆。本方法具有某些 益處如消除或包括特定的限制性位點，或特定密碼子的最優(yōu)化。來自雜交瘤的重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列被用于設(shè)計一重疊組的合成寡核 苷酸從而產(chǎn)生合成的帶有與天然序列相同氨基酸編碼能力的V序列。合成的重鏈和κ輕 鏈序列能在三個方面與自然序列相區(qū)別重復(fù)核苷酸堿基的鏈被中斷以便有利于寡核苷酸 合成和PCR擴增；依據(jù)Kozak規(guī)則引入最佳翻譯起始位點(Kozak, 1991，J. Biol. Chem. 266， 19867-19870，)；和翻譯起始位點上游的HindIII位點改造。對于重鏈和輕鏈可變區(qū)，最佳的編碼和對應(yīng)的非編碼鏈的序列分裂成30-50個核 苷酸區(qū)段，所述分裂大致發(fā)生于對應(yīng)非編碼寡核苷酸的中點。因此，對每個鏈來說，寡核 苷酸都能裝配成跨越150-400個核苷酸區(qū)段的重疊雙鏈組。隨后使用該組作為模板生產(chǎn) 150-400個核苷酸的PCR擴增產(chǎn)物。一般，一個單一可變區(qū)寡核苷酸組將裂解為兩個組，這 兩個組單獨擴增以生成兩個重疊的PCR產(chǎn)物。然后這些重疊產(chǎn)物由PCR擴增組合形成完整 的可變區(qū)。它還有可能在PCR擴增中包括重鏈或輕鏈恒定區(qū)域的重疊片段(包括κ輕鏈 的BbsI位點或γ重鏈的AgeI位點)，從而生成能夠輕易克隆到表達載體構(gòu)建體中的片段。隨后將重構(gòu)的重鏈和輕鏈可變區(qū)與克隆的啟動子、引導(dǎo)序列、翻譯起始序列、恒定 區(qū)、3’未翻譯序列、多腺苷酸化序列和轉(zhuǎn)錄終止序列組合形成表達載體構(gòu)建體。重鏈和輕鏈 表達構(gòu)建體能組合成一個單一載體，將該載體共轉(zhuǎn)染、按順序轉(zhuǎn)染或單獨轉(zhuǎn)染進宿主細(xì)胞 中，然后融合形成表達兩個鏈的宿主細(xì)胞。用于構(gòu)建表達載體表達人IgGK的質(zhì)粒描述如下。構(gòu)建質(zhì)粒以使得PCR擴增的V 重鏈和VK輕鏈cDNA序列能用于重構(gòu)完整的重鏈和輕鏈小基因。這些質(zhì)粒能用作完整地表達人或嵌合IgGl κ或IgG4K抗體。構(gòu)建相似的質(zhì)粒用于表達其它重鏈同種型，或用于 表達含有λ輕鏈的抗體。因而，在發(fā)明的另一方面，將發(fā)明的人抗⑶20抗體，例如，11B8、2F2或7D8的結(jié)構(gòu) 特征用于產(chǎn)生結(jié)構(gòu)相關(guān)的人抗CD20抗體，它至少保留本發(fā)明抗體的一種功能特征，如結(jié)合 ⑶20。更具體地，可以將11B8、2F2或7D8的一種或多種⑶R區(qū)與已知的人框架區(qū)和⑶Rs 重組結(jié)合以產(chǎn)生本發(fā)明的其它的、重組性設(shè)計的人抗CD20抗體。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種制備抗⑶20抗體的方法，包括(1) 人重鏈框架區(qū)和人重鏈⑶R，其中至少一種人重鏈⑶Rs包含選自圖53、55或57中所示的 ⑶R氨基酸序列的氨基酸序列(或?qū)?yīng)SEQ ID NOs 13-15、19-21或25-27中的氨基酸序 列)；和(2)人輕鏈框架區(qū)和人輕鏈CDR，其中至少一種人輕鏈CDR包含選自圖53、55或 57中所示的的CDRs氨基酸序列的氨基酸序列中所示的氨基酸序列(或?qū)?yīng)SEQ ID NOs 16-18、22-24或28-30中的氨基酸序列)；其中該抗體保留結(jié)合⑶20的能力。利用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合測試，如在實施例中給出的那些(例如，F(xiàn)ACS分析)來測定抗體 結(jié)合⑶20的能力。由于在本領(lǐng)域中眾所周知抗體重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在抗體對抗原的結(jié)合特異性/ 親和性中發(fā)揮著特別重要的作用，所以如上制備的本發(fā)明的重組抗體優(yōu)選包含2F2、7D8或 11B8的重鏈和輕鏈⑶R3。另外該抗體可以包含2F2、7D8或11B8的⑶R2。另外該抗體可以 包含2F2、7D8或11B8的⑶R1。因此，本發(fā)明進一步提供抗⑶20抗體，包含(1)人重鏈框 架區(qū)、人重鏈⑶Rl區(qū)、人重鏈⑶R2區(qū)和人重鏈⑶R3區(qū)，其中人重鏈⑶R3區(qū)是如圖53、55或 57中所示的2F2、7D8或11B8的CDR3 (或?qū)?yīng)SEQ ID NOs 15、21或27中的氨基酸序列)； (2)人輕鏈框架區(qū)、人輕鏈CDRl區(qū)、人輕鏈CDR2區(qū)和人輕鏈CDR3區(qū)，其中人輕鏈CDR3區(qū)是 如圖53、55或57中所示的2F2、7D8或11B8的CDR3(或?qū)?yīng)SEQ ID NOs 18、24或30中的 氨基酸序列)，其中該抗體結(jié)合⑶20。該抗體可以進一步包含2F2、7D8或11B8的重鏈⑶R2 和/或輕鏈⑶R2。該抗體可以進一步包含2F2、7D8或11B8的重鏈⑶Rl和/或輕鏈⑶R1。優(yōu)選地，上述工程化的抗體的⑶Rl、2和/或3包含本文公開的2F2、7D8或11B8 的⑶R確切氨基酸序列。不過，普通技術(shù)人員會理解從2F2、7D8或11B8的⑶R確切氨基酸 序列而來的一些偏差是可能的，同時仍然保持有效結(jié)合CD20的抗體的能力(例如，保守性 取代)。因此，在另一個實施方案中，工程化的抗體可以由與一種或多種2F2、7D8或11B8的 ⑶R例如90%、95%、98%或99. 5%相同的一種或多種⑶R組成。除了簡單地結(jié)合⑶20之外，工程化的抗體如即些上述的抗體可以對于它們保有 其它本發(fā)明的抗體的功能特性進行選擇，如(1)從⑶20上的低解離速率；(2)結(jié)合CD20的高親和力；(3)結(jié)合CD20上的獨特表位，和/或特異性定向結(jié)合CD20，和/或結(jié)合CD20的特 異性形式；(4)在⑶55/59陰性或⑶55/59陽性細(xì)胞上介導(dǎo)高水平的⑶C ；(5)結(jié)合⑶20后轉(zhuǎn)位到脂筏中；(6)抑制表達⑶20的細(xì)胞生長；(7)誘導(dǎo)表達⑶20的細(xì)胞凋亡；
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(8)誘導(dǎo)表達⑶20的細(xì)胞同型粘著；(9)延長具有表達⑶20的腫瘤細(xì)胞的個體存活；(10)與效應(yīng)細(xì)胞混合時介導(dǎo)CD20靶的ADCC ；(11)消除表達⑶20細(xì)胞的能力；和/或(12)消除表達低水平的CD20的細(xì)胞(CD20Low)的能力。人單克隆抗體結(jié)合⑶20的鑒定為了純化人抗CD20抗體，可以將選擇的雜交瘤生長于兩升的旋轉(zhuǎn)燒瓶中，用于單 克隆抗體純化。在用蛋白A-瓊脂糖(針對IgGl抗體)(Pharmacia，Piscataway, NJ)或抗 人IgG涂布的瓊脂糖或?qū)τ贗gG3的蛋白質(zhì)G-瓊脂糖進行親和層析之前，可以對上清液進 行過濾并濃縮?？梢酝ㄟ^凝膠電泳和高效液相層析檢查洗脫的IgG，以確保純度?？梢詫⑺?述緩沖液換成PBS，并且可以通過0D280使用1. 43的消光系數(shù)測定濃度?？梢詫⑺隹贵w 分裝，并且在-80°C下保存。為了確定所選擇的人抗CD20單克隆抗體是否結(jié)合獨特的表位，可以使用定點突 變和多點突變。為了確定純化抗體的同種型，可以進行同種型ELISAs?？梢栽?°C下用10微克/ 毫升的抗人Ig將微量滴定板孔涂布過夜。在用5% BSA封閉之后，在環(huán)境溫度下讓所述平 板與10微克/毫升單克隆抗體或純化的同種型對照反應(yīng)2小時。然后用人IgGl或人IgM 特異性堿性磷酸酶共軛的探針與所述孔反應(yīng)。在洗滌之后，用PNPP底物(1毫克/毫升) 使所述平板顯影，并在405-6500D下分析。為了證明抗CD20抗體在免疫小鼠血清中的存在或單克隆抗體與表達CD20的活細(xì) 胞的結(jié)合，可以使用流式細(xì)胞分析。簡單地講，將表達CD20的細(xì)胞系(生長于標(biāo)準(zhǔn)生長條 件下)與各種濃度的在包含0. BSA和0.02%疊氮化鈉的PBS中的單克隆抗體混合，于 4°C孵育30分鐘。在洗滌之后，將細(xì)胞與熒光素標(biāo)記的抗人IgG抗體在與一抗染色相同的 條件下進行反應(yīng)。可以通過FACScan儀器利用單一活細(xì)胞上的光散射和側(cè)面散射特性分析 所述樣品?？梢岳檬褂脽晒怙@微鏡的其它測定方法，作為流式細(xì)胞儀測定的補充或替代。 可以按上述方法對細(xì)胞進行染色，并且通過熒光顯微鏡檢查。該方法可以觀察單細(xì)胞，但根 據(jù)抗原密度靈敏度可能降低?？梢酝ㄟ^Western印跡進一步檢驗抗⑶20的人IgGs與⑶20抗原的反應(yīng)性。簡 單地講，可以制備來自表達CD20的細(xì)胞的細(xì)胞提取物，并且進行十二烷基硫酸鈉(SDS)聚 丙烯酰胺凝膠電泳。在電泳之后，將分離的抗原轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用20%的小鼠血清 封閉，并且用待試驗的單克隆抗體作探針檢測?？梢杂每谷薎gG堿性磷酸酶檢測人IgG結(jié) 合,并且用 BCIP/NBP 底物片(Sigma Chem. Co.，St. Louis, MO)顯影?？笴D20的人單克隆抗體的吞噬作用和細(xì)胞殺傷活性除了能特異性結(jié)合⑶20之外，還可以檢測人單克隆抗⑶20抗體介導(dǎo)對表達⑶20 細(xì)胞的吞噬作用和殺傷作用的能力。在體外對單克隆抗體活性的檢測，可以在體內(nèi)模型試 驗之前提供初步的篩選。簡單地講，可以通過Ficoll Hypaque密度離心，然后裂解污染紅細(xì) 胞純化來自健康供體的多型核細(xì)胞(PMN)、NK細(xì)胞或其它效應(yīng)細(xì)胞。可以將洗滌過的PMNs 懸浮在添加了 10%加熱滅活的胎牛血清的RPMI中，并且以各種效應(yīng)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的比 例(效應(yīng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞)與51Cr標(biāo)記過的表達CD20的細(xì)胞混合。然后可以以各種濃度添加純化的人抗CD20IgGs?？梢杂脽o關(guān)的人IgG作陰性對照。根據(jù)所用的效應(yīng)細(xì)胞，測定可 以在37°C下進行4-20小時?？梢酝ㄟ^測定釋放到培養(yǎng)上清液中的51Cr分析樣品的細(xì)胞裂 解作用。還可以通過相互組合的方式測定抗CD20單克隆抗體，以便確定多種單克隆抗體是 否增強細(xì)胞裂解。也可以在活體模型(例如，小鼠)上檢驗與CD20結(jié)合的人單克隆抗體，以便測定 它們控制表達CD20的腫瘤細(xì)胞的生長的效力。例如，這些抗體可以根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)進行選 擇，這些標(biāo)準(zhǔn)并不是排他性的1.與活的表達⑶20的細(xì)胞結(jié)合；2.從CD20上的低解離速率；3.結(jié)合CD20的高親和力；4.結(jié)合⑶20上的獨特表位，和/或特異性定向結(jié)合⑶20，和/或結(jié)合⑶20的特 異性形式；5.表達CD20的細(xì)胞的調(diào)理；6.在人效應(yīng)細(xì)胞存在時介導(dǎo)表達⑶20的細(xì)胞的生長抑制、吞噬作用和/或殺傷；7.在⑶55/59陰性或⑶55/59陽性細(xì)胞上介導(dǎo)高水平⑶C的能力；8.誘導(dǎo)同型粘著的能力；9.結(jié)合⑶20后誘導(dǎo)轉(zhuǎn)位到脂筏中的能力10.誘導(dǎo)凋亡的能力；11.在表達CD20的細(xì)胞上誘導(dǎo)ADCC的能力；12.消除表達⑶20細(xì)胞的能力；和/或13.消除表達低水平的⑶20的細(xì)胞(⑶20’的能力。本發(fā)明優(yōu)選的人單克隆抗體滿足這些標(biāo)準(zhǔn)中的一條或多條。利用多種已知的技 術(shù)，可以測試人單克隆抗CD20抗體介導(dǎo)CDC的能力。例如，可以從健康個體的血液中獲得 補體血清，所述血液可以進行離心和收集。為了測定各種mAbs的CDC活性，可以使用不同 的方法。例如可以測量51Cr釋放或者可以利用碘化丙錠(PI)排除測試來評估提升的膜滲 透性。簡言之，可以洗滌靶細(xì)胞并且在RPMI-I % BSA中重懸為IX 106/ml?？梢韵蚣?xì)胞中 加入各種濃度的mAb并且允許在室溫結(jié)合10-15分鐘。隨后加入血清至終濃度20% (ν/ν) 并且將細(xì)胞在37°C溫育45分鐘?？梢栽贔ACS管中將所有來自每個樣品的細(xì)胞加至PI溶 液?；旌衔镫S后可以立即利用FACScalibur流式細(xì)胞儀通過流式細(xì)胞分析進行評估并且利 用 CellQuest pro 軟件(BD Biosciences, Mountain view, CA)進行分析。為了檢測啟動凋亡的能力，可以，例如，將人單克隆抗CD20抗體與CD20陽性腫瘤 細(xì)胞，例如，Daudi 一起于37°C溫育約20小時。可以收集細(xì)胞并在膜聯(lián)蛋白-V-FITC結(jié)合 緩沖液(BD biosciences)中洗滌，并且以膜聯(lián)蛋白V-FITC(BD biosciences)于4°C黑暗 中標(biāo)記15分鐘?？梢栽贔ACS管中將所有來自每個樣品的細(xì)胞加至PI溶液(10yg/ml于 PBS中)并且立即通過流式細(xì)胞分析進行評估(如上)。在本發(fā)明的一個特定實施方案中，將人單克隆抗體組合使用，例如，作為一種包含 一種或多種抗CD20單克隆抗體的藥物組合物?？梢詫⒕哂胁煌パa的活性的人抗CD20 單克隆抗體組合于單個治療以達到預(yù)期的治療或診斷效果。在一個優(yōu)選的實施方案中，該 組合物包括一種介導(dǎo)⑶C的抗⑶20人單克隆抗體，組合以另一種誘導(dǎo)凋亡的人抗⑶20單克隆抗體。在另一實施方案中，該組合物包括一種介導(dǎo)高效殺傷靶細(xì)胞的抗CD20人單克隆 抗體，組合以另一種抑制表達⑶20細(xì)胞生長的人抗⑶20單克隆抗體。II.吿1丨各產(chǎn)牛人單克降杭CD杭體的轉(zhuǎn)某因非人云M勿在另一方面，本發(fā)明提供了諸如轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體非人 動物，它能夠表達可以特異性結(jié)合CD20的人抗體。在一種特定的實施方案中，發(fā)明提供一 種具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠，從而當(dāng)用表達CD20的細(xì)胞 進行免疫時該小鼠產(chǎn)生人抗CD20抗體。人重鏈轉(zhuǎn)基因可以整合入小鼠的染色體DNA中，如 轉(zhuǎn)基因的，例如本文詳細(xì)描述和示例的HuMab小鼠的情況一樣?；蛘?，人重鏈轉(zhuǎn)基因可以保 持于染色體外，如WO 02/43478中所述的轉(zhuǎn)染色體(例如，KM)小鼠的情況一樣。這類轉(zhuǎn)基 因和轉(zhuǎn)染色體動物能夠通過進行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生抗CD20的人單克隆抗體的 多種同種型(例如IgG、IgA和/或IgE)。以異源抗體集合應(yīng)答外源抗原刺激的轉(zhuǎn)基因或 轉(zhuǎn)染色體非人動物的設(shè)計，需要包含在轉(zhuǎn)基因動物中的異源免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在整個B細(xì) 胞發(fā)育途徑中正確地發(fā)揮作用。這包括，例如，異源重鏈轉(zhuǎn)基因的同種型轉(zhuǎn)換。因此，構(gòu)建 本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因，以便能誘導(dǎo)同種型轉(zhuǎn)換和下列抗體基因特性的一種或多種(1)高水平 的和細(xì)胞類型特異性的表達，(2)功能性基因重排，(3)活化等位排斥并對等位排斥作出反 應(yīng)，(4)表達足夠的一級成分，(5)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，(6)體細(xì)胞高變，和(7)在免疫應(yīng)答中所述轉(zhuǎn) 基因抗體基因座的支配作用。并不需要滿足上述所有標(biāo)準(zhǔn)。例如，在轉(zhuǎn)基因動物的內(nèi)源免疫球蛋白基因座被 功能性破壞的實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因不必活化等位排斥。另外，在所述轉(zhuǎn)基因包括功能 性重排的重鏈和/或輕鏈免疫球蛋白基因的實施方案中，第二個標(biāo)準(zhǔn)即功能性基因重排 是不需要的，至少對于業(yè)已重排的轉(zhuǎn)基因來說是如此。關(guān)于分子免疫學(xué)的背景知識，參見 Fundamental Immunology, 2nd edition (1989)，Paul，Wi 1 IiamE.，ed. Raven Press，N. Y.。在某些實施方案中，本發(fā)明用于制備人單克隆抗體的轉(zhuǎn)基因非人動物在轉(zhuǎn)基因動 物種系中含有重排的、未重排的或重排的和未重排的異源免疫球蛋白重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因的 組合。每一個重鏈轉(zhuǎn)基因包含至少一個Ch基因。另外，所述重鏈轉(zhuǎn)基因可以包含有功能的 同種型轉(zhuǎn)換序列，該序列能支持編碼多個Ch基因的異源轉(zhuǎn)基因在所述轉(zhuǎn)基因動物的B細(xì)胞 中的同種型轉(zhuǎn)換。所述轉(zhuǎn)換序列可以天然存在于被用作轉(zhuǎn)基因Ch基因來源的物種的種系 免疫球蛋白基因座上，或者所述轉(zhuǎn)換序列可以來源于存在于接受所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的物種 (轉(zhuǎn)基因動物)中的序列。例如，用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因小鼠的人轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體如果結(jié)合類似于 天然存在于小鼠重鏈基因座上的轉(zhuǎn)換序列的話，就能產(chǎn)生高頻率的同種型轉(zhuǎn)換事件，因為 小鼠轉(zhuǎn)換序列可能進行了優(yōu)化，能和小鼠轉(zhuǎn)換重組酶系統(tǒng)一起發(fā)揮作用，而所述人轉(zhuǎn)換序 列則不能?？梢苑蛛x轉(zhuǎn)換序列并通過傳統(tǒng)克隆方法克隆，或者通過根據(jù)公開的與免疫球蛋 白轉(zhuǎn)換區(qū)序列相關(guān)的序列信號設(shè)計的重疊的合成寡核苷酸從頭合成(Mills等，Nucl. Acids Rev. 15 7305-7316,1991 ；Sideras 等，Intl. Immunol. 1 :631_642，1989)。對上述每一種轉(zhuǎn) 基因動物來說，在顯著比例(至少10%)的所述轉(zhuǎn)基因動物B細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了功能性重排的 異源重鏈和輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因。用于產(chǎn)生本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的轉(zhuǎn)基因包含一個重鏈轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因包含編碼至 少一個可變基因片段，一個多樣性基因片段，一個連接基因片段和至少一個恒定區(qū)基因片 段的DNA。免疫球蛋白輕鏈轉(zhuǎn)基因包含編碼至少一個可變基因片段，一個連接基因片段和至。編碼所述輕鏈和重鏈基因片段的基因片段相對于轉(zhuǎn)基因動 物而言是異源的，因為它們來源于或者相應(yīng)于來自不包含所述轉(zhuǎn)基因非人動物的物種中編 碼免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因片段的DNA。在本發(fā)明的一個方面，構(gòu)建所述轉(zhuǎn)基因，以便單 個的基因片段是未重排的，即沒有進行重排，以便編碼有功能的免疫球蛋白輕鏈或重鏈。所 述未重排的轉(zhuǎn)基因支持V、D和J基因片段的重組(功能性重排)，并優(yōu)選支持在接觸CD20 抗原時，在所述轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)將D區(qū)基因片段的全部或一部分摻入到所得到的重排免疫 球蛋白重鏈上。在另一個實施方案中，所述轉(zhuǎn)基因包含一個未重排的“微型基因座”。所述轉(zhuǎn)基因 通常包含C、D和J片段的主要部分，以及V基因片段的亞型。在所述轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體中，諸如 啟動子、增強子、類型轉(zhuǎn)換區(qū)、RNA加工的剪接供體和剪接受體序列和重組信號之類的各種 調(diào)控序列，包含來自所述異源DNA的相應(yīng)序列。所述調(diào)控序列可以整合到來自用于本發(fā)明 的非人轉(zhuǎn)基因動物的相同或相關(guān)物種的轉(zhuǎn)基因上。例如，可以將人免疫球蛋白基因片段與 嚙齒類動物免疫球蛋白增強子序列組合在一個轉(zhuǎn)基因上以便用于轉(zhuǎn)基因小鼠。另外，可以 將合成的調(diào)控序列整合到所述轉(zhuǎn)基因上，其中，所述合成的調(diào)控序列與已知天然存在于哺 乳動物基因組中的功能性DNA序列不同源。合成的調(diào)控序列是按照公認(rèn)的規(guī)則設(shè)計的，例 如，規(guī)定剪接_受體位點或啟動子/增強子基序的容許序列的規(guī)則。例如，與天然存在的種 系Ig基因座相比，微型基因座包含具有至少一個非必需DNA部分(例如，間隔序列；內(nèi)含子 或其部分)內(nèi)部(即不在該部分的末端)缺失的基因組免疫球蛋白基因座的一部分。優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)染色體非人動物，例如，小鼠，具有免疫球蛋白產(chǎn)物的大部分成 分，理想的是在調(diào)整體積后基本上類似于人的免疫球蛋白組成成分。通常至少占大約10%， 優(yōu)選25-50%或更多的多樣性。一般，根據(jù)導(dǎo)入小鼠基因組中的V、J和D區(qū)的數(shù)量會產(chǎn)生 至少大約1000種不同的免疫球蛋白(優(yōu)選IgG)，優(yōu)選IO4-IO6或更多，并且由在連接區(qū)上 的V(-D-) J基因片段重組隨機核苷酸添加所產(chǎn)生的其它多樣性所驅(qū)動。一般地，免疫球蛋 白對預(yù)先確定抗原的親和力(Kd)為小于10_7M，如小于10_8M、10_9M或ΙΟ,Μ或甚至更低。如上所述的轉(zhuǎn)基因的和轉(zhuǎn)染色體的非人動物，例如，小鼠可以用，例如，表達CD20 的細(xì)胞進行免疫?；蛘?，該轉(zhuǎn)基因動物可以用編碼人CD20的DNA進行免疫。這些動物隨后 將產(chǎn)生通過轉(zhuǎn)換重組(順式轉(zhuǎn)換)進行類型轉(zhuǎn)換的B細(xì)胞并且表達與CD20反應(yīng)的免疫球 蛋白。該免疫球蛋白可以是人抗體(也稱為“人序列抗體”)，其中重鏈和輕鏈多肽由人轉(zhuǎn) 基因序列所編碼，它可以包括源于體細(xì)胞突變和V區(qū)重組連接的序列，以及種系編碼序列； 這些人抗體可以稱作基本上與由人\和叉或Vh、Dh和Jh基因片段所編碼的多肽序列相同， 即使其它種系序列可以作為體細(xì)胞突變和不同的V-J和V-D-J重組連接的結(jié)果存在。每個 抗體鏈的可變區(qū)一般與人種系V、J至少80%相似，并且對于重鏈來說，與D基因片段相似； 經(jīng)常是與存在于轉(zhuǎn)基因上的人種系序列至少85%相似；常常與存在與轉(zhuǎn)基因上的人種系 序列90%或95%或更高地相似。不過，由于非種系序列是由體細(xì)胞突變和VJ以及VDJ連 接引入的，人序列抗體經(jīng)常會具有一些可變區(qū)序列，它不是由小鼠種系的人轉(zhuǎn)基因中發(fā)現(xiàn) 的人V、D或J基因片段所編碼的。一般地，這種非種系序列(或個別的核苷酸位置)將在 CDR中或附近聚集，或在聚類已知體細(xì)胞突變的區(qū)域聚集。本發(fā)明的另一方面包括源自如本文所述的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體非人動物的B細(xì)胞。 所述B細(xì)胞可以用于產(chǎn)生表達人單克隆抗體的雜交瘤，所述單克隆抗體以高親和力(例
33如，低于ICT7M的解離平衡常數(shù)(Kd))結(jié)合人CD20。因而，在一個實施方案中，本發(fā)明提供 一種雜交瘤，它產(chǎn)生具有低于IO-7M的親和力(Kd)的人抗體，如低于IO-8MUO-9M或ΙΟ,Μ或 甚至更低，所述親和力是當(dāng)通過利用放射活性標(biāo)記的單克隆抗體進行表達CD20的細(xì)胞的 scatchard分析或通過利用FACS分析測定半最大結(jié)合濃度而進行測定時得到的。在本文中單克隆抗體包含一種人序列輕鏈，所述輕鏈由(1)具有與由人\基因片 段和人叉片段所編碼的多肽序列基本上相同的多肽序列的輕鏈可變區(qū)，和(2)由人Q基因 片段編碼的輕鏈恒定區(qū)；和一種人序列輕鏈，所述輕鏈由(1)具有與由人Vh基因片段、D區(qū) 和人Jh片段所編碼的多肽序列基本上相同的多肽序列的重鏈可變區(qū)，和(2)由人Ch基因片 段編碼的重鏈恒定區(qū)。通過一種在具有包含整合的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的基因組的轉(zhuǎn)基因非人動物中 擴增人可變區(qū)基因片段集合的方法可以促進抗CD20的高親和力人單克隆抗體的發(fā)展，所 述方法包括將一種包含V區(qū)基因片段的V基因轉(zhuǎn)基因?qū)牖蚪M中，所述V區(qū)基因片段不 存在于所述整合的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因中。通常，所述V區(qū)轉(zhuǎn)基因是包含一部分人Vh或 八(Vk)基因片段排列的酵母人工染色體，該基因片段排列可以天然存在于人基因組中，或者 可以通過重組方法分別剪接在一起，它可以包含失調(diào)的(out of order)或省略的V基因片 段。通常在YAC上包含至少5個或更多個功能性V基因片段。在這種變化形式中，可能通 過V集合擴增方法制備一種轉(zhuǎn)基因小鼠，其中，該小鼠表達的免疫球蛋白鏈包含由存在于V 區(qū)轉(zhuǎn)基因上的V區(qū)基因片段編碼的可變區(qū)序列和由人Ig轉(zhuǎn)基因上編碼的C區(qū)。通過V集 合擴增方法，可以產(chǎn)生具有至少5個不同V基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。因為小鼠可以包含至少大 約24個V基因或更多。某些V基因片段可能是無功能的(例如，假基因等)；所述片段可 以保留，或者如果需要的話，可以通過技術(shù)人員現(xiàn)有的重組方法選擇性地刪除這些片段。一旦將所述小鼠種系工程改造成包含具有基本上不存在于含有J和C基因片段的 人Ig轉(zhuǎn)基因上的擴增的V片段組成成分的有功能的YAC，就可以將該性狀繁殖并轉(zhuǎn)育到其 它遺傳背景中，包括具有擴增的V片段組成成分的有功能的YAC被轉(zhuǎn)育到具有不同的人Ig 轉(zhuǎn)基因的小鼠種系中的背景?？梢詫⒕哂袛U增的V片段組成成分的多個有功能的YACs轉(zhuǎn) 育到一個種系中，以便與人Ig轉(zhuǎn)基因(或多個人Ig轉(zhuǎn)基因)一起起作用。盡管在本文中 被稱為YAC轉(zhuǎn)基因，這種轉(zhuǎn)基因在整合到所述基因組中之后可能基本上缺乏酵母序列，如 缺乏在酵母中自主復(fù)制所需要的序列；在酵母中復(fù)制之后一旦不再需要(即在導(dǎo)入小鼠ES 細(xì)胞或小鼠原合子中之前)，可以通過遺傳工程(例如，限制性消化和脈沖場凝較電泳或其 它合適方法)選擇性地除去所述序列。繁殖人序列免疫球蛋白表達性狀的方法，包括培育 具有人Ig轉(zhuǎn)基因，并且還選擇性地具有包含擴增的V片段組成成分的有功能的YAC的轉(zhuǎn)基 因小鼠。V1^Pt基因片段都可以存在于YAC上。操作者可以將所述轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)育到任 何背景，包含具有其它人轉(zhuǎn)基因的背景，包含人Ig轉(zhuǎn)基因和/或編碼其它人淋巴細(xì)胞蛋白 的轉(zhuǎn)基因。本發(fā)明還提供了一種由具有擴增的V區(qū)成分YAC轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的高 親和力人序列免疫球蛋白。盡管上面公開了本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物的優(yōu)選實施方案，其它實施 方案也是可行的，可以將這些實施方案劃分成三種類型I.含有未重排的重鏈和重排的輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物；II.含有未重排的重鏈和未重排的輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物；
III.含有重排的重鏈和未重排的輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物。在這些類型的轉(zhuǎn)基因動物中，其優(yōu)選的順序如下II > I > III，其中，業(yè)已通過同 源重組(或其它方法)敲除了內(nèi)源輕鏈基因(或至少是K基因)；I > II > III，其中，并 未敲除內(nèi)源輕鏈基因，并且必須經(jīng)過等位排斥成為顯性。III.能結(jié)合CD20的雙特異t牛/多特異t牛分子在本發(fā)明的另一個實施方案中，可以將抗CD20的人單克隆抗體衍生化，或者與諸 如另一種肽或蛋白質(zhì)(例如，F(xiàn)ab'片段)的另一種功能性分子偶聯(lián)，以便制備能結(jié)合多個 結(jié)合位點或靶表位的雙特異性或多特異性分子。例如，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分能 功能性地連接于(例如，通過化學(xué)連接、基因融合、非共價結(jié)合或其它方式)諸如另一種抗 體、抗體片段、肽或結(jié)合模擬物的一種或多種其它結(jié)合分子上。因此，本發(fā)明包括含有至少一種對⑶20的第一結(jié)合特異性和對第二種靶表位的 第二結(jié)合特異性的雙特異性和多特異性分子。在本發(fā)明的一種特定實施方案中，所述第二 靶表位是Fc受體，例如人Fc y RI (CD64)或人Fc α受體(CD89)，或T細(xì)胞受體，例如CD3。 因此，本發(fā)明包括能夠同時結(jié)合表達Fc γ R、Fc α R或Fc ε R的效應(yīng)細(xì)胞(例如，單核細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞或多型核細(xì)胞(PMNs))和表達CD20的靶細(xì)胞的雙特異性和多特異性分子。這些 雙特異性和多特異性分子將CD20引導(dǎo)至效應(yīng)細(xì)胞，并且象本發(fā)明的人單克隆抗體一樣，誘 導(dǎo)Fc受體介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞的活性，如吞噬表達CD20的細(xì)胞、抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒 性(ADCC)、細(xì)胞因子釋放、或產(chǎn)生超氧化物陰離子。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子除了抗Fc結(jié)合特異性或抗靶細(xì)胞抗原和抗 CD20結(jié)合特異性之外，還可以包括第三種結(jié)合特異性。在一個實施方案中，所述第三種結(jié)合 特異性是抗增強因子(EF)部分，例如，結(jié)合參與細(xì)胞毒性活性的表面蛋白，并因此增強對 所述靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答的分子。“抗增強因子部分”可以是一種抗體、功能性抗體片段或結(jié) 合諸如抗原或受體的特定分子的配體，并因此導(dǎo)致Fc受體或靶細(xì)胞抗原的結(jié)合決定因子 效果的增強。“抗增強因子部分”可以結(jié)合Fc受體或靶細(xì)胞抗原。另外，所述抗增強因子部 分可以結(jié)合在與所述第一和第二結(jié)合特異性結(jié)合的實體不同的實體上。例如，抗增強因子 部分可以結(jié)合一種細(xì)胞毒性T細(xì)胞(例如，通過⑶2、⑶3、⑶8、⑶28、⑶4、⑶40、ICAM-I或 其它免疫細(xì)胞，它們導(dǎo)致針對所述靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答增強)。在一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子包括至少一種抗體，或其 抗體片段作為結(jié)合特異性，包括，例如，F(xiàn)ab、Fab’、F(ab’)2、Fv、或單鏈Fv。所述抗體也可 以是輕鏈或重鏈二聚體或其任何最小片段，如Fv或公開于Ladner等US 4，946，778中的單 鏈構(gòu)建體。該抗體還可以是一種公開于US 2003/0118592和US 2003/0133939的結(jié)合結(jié)構(gòu) 域免疫球蛋白融合蛋白。在一個實施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子包含對存在于效應(yīng)細(xì)胞表 達上的Fc γ R或人Fc α R的結(jié)合特異性，以及對靶細(xì)胞抗原，例如，⑶20的第二結(jié)合特異性。在一個實施方案中，對Fc受體的結(jié)合特異性是由人單克隆抗體提供的，它的結(jié)合 不受人免疫球蛋白G(IgG)阻斷。如本文所用的，術(shù)語“IgG受體”表示位于1號染色體上的 8個Y鏈基因中的任一個。這些基因一共編碼12種跨膜或可溶性受體同種型，這些同種型 被劃分成三種類型的
35
Fc γ 受體=Fc γ RI (CD64)、Fc γ RII (CD32)、Fc γ RIII (CD16)。在一種優(yōu)選實施方 案中，F(xiàn)c γ受體是人高親和力Fc YRI。Fanger等在WO 88/00052和US 4954617中介紹了這些優(yōu)選單克隆抗體的產(chǎn)生和 特征分析。這些抗體與Fc γ RI、Fc γ RII或Fc γ RIII的表位結(jié)合的位點，與所述Fc γ的受 體結(jié)合位點不同，因此，其結(jié)合基本上不會受到IgG生理水平的的抑制。在本發(fā)明中有用的 特異性抗Fc y RI抗體是mAb22、mAb32、mAb44、mAb62和mAbl97。在其它實施方案中，所述 抗Fc γ受體抗體是單克隆抗體22 (H22)的人源化形式。H22抗體的產(chǎn)生和特征分析公開在 Graziano R. F.等(1995) J. Immunol 155 (10) :4996_5002 和 WO 94/10332 中。H22 抗體生產(chǎn) 細(xì)胞系以HA022CL1的名稱，于1992年11月4日保存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號 為 CRL11177。仍然在另一種優(yōu)選實施的方案中，對Fc受體的結(jié)合特異性是由結(jié)合諸如Fc-α 受體(FcaRI(CD89))的人IgA受體的抗體提供的，所述抗體的結(jié)合優(yōu)選不會受到人免 疫球蛋白A(IgA)的阻斷。術(shù)語“IgA受體”意在包含位于19號染色體上的一個α基 因(FcaRI)的基因產(chǎn)物。已知該基因編碼55-llOkDa的若干種不同剪接的跨膜同種型。 Fc α RI (⑶89)是在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、嗜伊紅性和嗜中性粒細(xì)胞上組成型表達的，但不 能在非效應(yīng)性細(xì)胞群體上表達。Fc α RI對IgAl和IgA2具有中等親和力，該親和力在接觸 諸如 G-CSF 或 GM-CSF 的細(xì)胞因子之后會提高(Morton, H. C.等，1996，Critical Reviews in Immunology 16 423-440)。業(yè)已介紹了能在IgA配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域之外結(jié)合Fc α RI的四 種Fc α RI特異性單克隆抗體，這些抗體被確定為A3、Α59、Α62和Α77 (Monteiro, R. C.等， 1992，J. Immunol. 148 1764)。FcaRI和FcyRI是用于本發(fā)明的優(yōu)選的觸發(fā)受體，因為它們是(1)主要在諸如單 核細(xì)胞、PMNs、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的免疫效應(yīng)細(xì)胞上表達的；(2)以高水平表達(例如，每 個細(xì)胞5，000-100，000) ； (3)細(xì)胞毒性活性的介體(例如，ADCC，吞噬作用)；(4)介導(dǎo)靶向 它們的包括自身抗原在內(nèi)的抗原的增強了的抗原呈遞。在另一個實施方案中，雙特異性分子由兩種根據(jù)本發(fā)明的單克隆抗體組成，這兩 種單克隆抗體具有互補的活性，如一種抗體主要通過誘導(dǎo)CDC起作用而另一種抗體主要通 過誘導(dǎo)凋亡起作用，例如，2F2結(jié)合以11B8。在其它實施方案中，本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子還包括識別，例如，結(jié)合諸 如CD20的靶細(xì)胞抗原的結(jié)合特異性。在一種優(yōu)選的實施方案中，所述結(jié)合特異性是由本發(fā) 明的人單克隆抗體提供的。如本文所用的“效應(yīng)細(xì)胞特異性抗體”表示結(jié)合效應(yīng)細(xì)胞的Fc受體的抗體或功能 性抗體片段。用于本發(fā)明的優(yōu)選抗體與效應(yīng)細(xì)胞Fc受體在一個內(nèi)源免疫球蛋白不能結(jié)合 的位點結(jié)合。如本文所用的，術(shù)語“效應(yīng)細(xì)胞”表示參與免疫應(yīng)答的效應(yīng)期的免疫細(xì)胞，所述效 應(yīng)期與免疫應(yīng)答的識別期和激活期相反。例示性的免疫細(xì)胞包括骨髓或淋巴來源的細(xì)胞， 例如，淋巴細(xì)胞(例如，B細(xì)胞和T細(xì)胞，包括溶細(xì)胞T細(xì)胞(CTLs))、殺傷細(xì)胞、天然殺傷 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜伊紅性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、多型核細(xì)胞、粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞 和嗜堿性粒細(xì)胞。某些效應(yīng)細(xì)胞表達特異性Fc受體，并且執(zhí)行特定的免疫功能。在優(yōu)選的 實施方案中，效應(yīng)細(xì)胞能夠誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)，例如，嗜中性粒細(xì)胞能夠誘導(dǎo)ADCC0例如，表達FcR的單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞參與靶細(xì)胞的特異性殺傷和將抗原呈遞給免疫 系統(tǒng)的其它成分或者結(jié)合到呈遞抗原的細(xì)胞上。在其它實施方案中，效應(yīng)細(xì)胞可以吞噬靶 抗原、靶細(xì)胞或微生物?？梢酝ㄟ^諸如細(xì)胞因子的體液因子調(diào)控特定FcR在效應(yīng)細(xì)胞上的 表達。例如，業(yè)已發(fā)現(xiàn)干擾素Y(IFN-Y)上調(diào)FcyRI的表達。這種增強的表達提高了具 有Fc γ RI的細(xì)胞對靶的細(xì)胞毒性。效應(yīng)細(xì)胞可以吞噬或裂解靶抗原或靶細(xì)胞。“靶細(xì)胞”意為個體(例如，人或動物)體內(nèi)的能夠由本發(fā)明的組合物(例如，人單 克隆抗體，雙特異性或多特異性分子)靶向的任何不需要的細(xì)胞。在一種優(yōu)選的實施方案 中，所述靶細(xì)胞是表達或過表達⑶20的細(xì)胞。表達⑶20的細(xì)胞一般包括B細(xì)胞和B細(xì)胞 腫瘤。盡管人單克隆抗體是優(yōu)選的，可以用于本發(fā)明的雙特異性或多特異性分子中的其 它抗體為鼠類、嵌合型和人源化的單克隆抗體。這些鼠類、嵌合型和人源化的單克隆抗體可 以通過本領(lǐng)域已知的方法進行制備?？梢岳没瘜W(xué)技術(shù)(參見，例如D.M. Kranz 等，1981，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 5807)、“多瘤”技術(shù)(參見授予Reading的US 4474893)或重組DNA技術(shù)制備本發(fā)明的 雙特異性和多特異性分子。具體地講，可以利用本領(lǐng)域公知的、并且在本文所提供的實施例中所介紹的方法， 通過結(jié)合組成性結(jié)合特異性，例如，抗FcR和抗CD20的結(jié)合特異性，制備本發(fā)明的雙特異性 和多特異性分子。例如，可以分別制備所述雙特異性和多特異性分子的每一種結(jié)合特異性， 然后再彼此結(jié)合在一起。當(dāng)所述結(jié)合特異性是蛋白或肽時，可以將多種偶聯(lián)劑或交聯(lián)劑用 于共價結(jié)合。交聯(lián)劑的例子包括蛋白A、碳化二亞胺、N-琥珀酰亞氨基-S-乙酰基-硫代乙 酸酯(SATA)、5，5，- 二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、鄰-亞苯基二馬來酰亞胺(oPDM)、 N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)和磺基琥珀酰亞氨基4-(N-馬來 酰亞氨基甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)(參見例如，Karpovsky等，1984，J. Exp. Med. 160 1686 ；Liu, MA 等，1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :8648)。其它方法包括 由 Paulus(Behringlns. Mitt.，1985，No. 78 :118-132) ；Brennan 等(Science,1985,229 81-83)和 Glennie 等(J. Immunol.，1987，139 =2367-2375)所介紹的方法。優(yōu)選的結(jié)合制 劑是SATA和磺基-SMCC，這兩種制劑都可以從Pierce化學(xué)公司(Rockford，IL)購買。當(dāng)所述結(jié)合特異性是抗體時，可以通過兩個重鏈的C-末端鉸鏈區(qū)的巰基鍵將它 們結(jié)合。在一種特別優(yōu)選的實施方案中，在結(jié)合之前對所述鉸鏈區(qū)進行修飾，以使其包含奇 數(shù)數(shù)量的巰基殘基，優(yōu)選一個殘基?；蛘撸瑑煞N結(jié)合特異性可以編碼在同一個載體中，并且在同一個宿主細(xì)胞中表 達和組裝。當(dāng)所述雙特異性和多特異性分子是mAbXmAb、mAbXFab、FabXF(ab，)2或配 體XFab融合蛋白時，該方法特別適用。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子，例如，雙特 異性分子可以是單鏈分子，如單鏈雙特異性抗體，包括一個單鏈抗體和一個結(jié)合決定子的 單鏈雙特異性分子，或包括兩個結(jié)合決定簇的單鏈雙特異性分子。雙特異性和多特異性 分子還可以是單鏈分子或者可以包括至少兩個單鏈分子。例如，制備雙特異性和多特異 性分子的方法在例如 US 5260203 ；US 5455035 ；US 4881175 ；US 5132405 ；US 5091513 ；US 5476786 ；US 5013653 ；US 5258498 ；和 US 5482858 中進行了介紹?？梢酝ㄟ^酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、FACS分析、生物測定(例如，生長抑制)或Western印跡測定證實所述雙特異性和多特異性分子對其特異性靶的 結(jié)合。上述每一種測定通常通過采用對目標(biāo)復(fù)合物特異性的標(biāo)記過的試劑(例如，抗體)， 來檢測特定目標(biāo)的蛋白-抗體復(fù)合物的存在。例如，可以用能識別、并特異性結(jié)合抗體-FcR 復(fù)合物的諸如酶聯(lián)抗體或抗體片段檢測FcR抗體復(fù)合物。或者，可以用多種其它免疫測定 方法中的任一種檢測復(fù)合物。例如，可以對所述抗體進行放射性標(biāo)記，并用于放射免疫測定 (RIA)(參見，例如，Weintraub, B.，Principles of Radioimmunoassays, SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques，The EndocrineSociety，March，1986?？梢岳?用諸如γ計數(shù)器或閃爍計數(shù)器或通過放射性自顯影檢測所述放射性同位素。IV.抗體結(jié)合物在另一方面，本發(fā)明描述了與諸如細(xì)胞毒素、藥物(例如，免疫抑制劑)或放射性 同位素的治療成分結(jié)合的人抗CD20單克隆抗體。在本文中這種結(jié)合物稱為“免疫結(jié)合物”。 包括一種或多種細(xì)胞毒素的免疫結(jié)合物稱為“免疫毒素”。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑包括對細(xì) 胞有害的(例如，殺傷性)的任何試劑。其例子包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化 乙錠、吐根堿、絲裂霉素、足葉乙甙、tenoposide、長春新堿、長春花堿、秋水仙素、阿霉素、道 諾紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、l-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)素、 普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾、和嘌呤霉素及其類似物或同系物。用于形成免疫結(jié)合物的合適的治療劑包括，但不限于抗代謝物(例如，氨甲蝶 呤、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、達卡巴嗪)、烷化劑(例如，氮芥、 thio印a苯丁酸氮芥、美法侖、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消胺、二 溴甘露糖醇、鏈脲菌素、絲裂霉素C和順二氯二胺鉬(II) (DDP)順鉬)、蒽環(huán)類(例如，道諾 紅霉素(以前稱之為道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放線菌素(以前稱之為更生霉 素)、博來霉素、普卡霉素和氨茴霉素(AMC))，以及抗有絲分裂劑(例如，長春新堿和長春花 堿)。在一個優(yōu)選的實施方案中，治療劑是一種細(xì)胞毒性劑或放射毒性劑。在另一個實施方 案中，治療劑是一種免疫抑制劑。還在另一個實施方案中，治療劑是GM-CSF。在一個優(yōu)選的 實施方案中，治療劑是阿霉素、順鉬、博來霉素、硫酸鹽、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺或 蓖麻毒素A?？梢詫⒈景l(fā)明的抗體與放射性同位素，例如1-131、釔-90或銦-111結(jié)合，以便制 備細(xì)胞毒性放射性藥物，用于治療與CD20相關(guān)的疾病，如癌癥。本發(fā)明的抗體結(jié)合物可用 于修飾特定的生物學(xué)反應(yīng)，并且所述藥物成分并不被視為局限于傳統(tǒng)的化學(xué)治療劑。例如， 所述藥物成分可以是具有所需生物學(xué)活性的蛋白或多肽。例如，所述蛋白可以包括酶促活 性的毒素或其活性片段，如相思豆毒素、蓖麻毒素A、假單胞菌外毒素、或白喉毒素；諸如腫 瘤壞死因子或干擾素Y的蛋白；或生物學(xué)反應(yīng)修飾劑，如淋巴因子、白介素_1( “IL-1”)、 白介素-2( “IL-2”)、白介素-6( “IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、 粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生長因子。將所述治療成分結(jié)合在抗體上的技術(shù)是眾所周知的，參見，例如，Arnon等， "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting of Drugs InCancer Therapy，，， in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld 等(編輯)，pp. 243-56 (Alan R.Liss, Inc. 1985) ；Hellstrom 等，“Antibodies For Drug Delivery”，in Controlled Drug Delivery (第二版)，Robinson 等(編輯)，pp. 623-53 (Marcel DEkker, Inc. 1987)；Thorpe，“Antibody Carriers of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review，，， in Monoclonal Antibodies 84 :Biological And ClinicalAppIications， Pinchera ^ ( IS ■ )， pp.475-506(1985) ；"Analysis, Results, And Future Prospective of The Therapeutic Use of RadiobeledAnt ibody In Cancer Therapy，，，in Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy，Baldwin 等(編輯)，pp. 303-16 (Academic Press 1985)，and Thorpe 等，"The Preparation And Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates，，，Immunol. Rev.，62 :119_58 (1982)。在另一方面，將根據(jù)本發(fā)明的人單克隆抗體附于聯(lián)結(jié)螯合劑上，如tiuxetan，它允 許將抗體結(jié)合到放射性同位素上。V.藥用組合物在另一方面，本發(fā)明提供了一種組合物，例如，一種含有本發(fā)明的一種或組合的人 單克隆抗體的藥物組合物。該藥物組合物可以與可藥用的載體或溶劑以及任何其它已知的 佐劑和賦形劑以傳統(tǒng)技術(shù)如那些在Remington :The Science and Practice of Pharmacy, 第 19 版，Gennaro，編輯，Mack Publishing Co.，Easton, PA, 1995 中公開的技術(shù)在一起配 制。在一個實施方案中，該組合物包括多種(例如，兩種或更多種)分離的本發(fā)明的人抗體 的組合，所述抗體以不同的機制起作用，例如，一種抗體主要通過誘導(dǎo)CDC起作用，組合以 另一種主要通過誘導(dǎo)凋亡起作用的抗體。本發(fā)明的藥物組合物還可以以組合療法的形式進行給藥，即組合以其它藥物。例 如，組合療法可以包括本發(fā)明的一種組合物和至少一種抗炎劑或至少一種免疫抑制劑。在 一個實施方案中這類治療劑包括一種或多種抗炎劑，如甾體藥物或NSAID(非甾體抗炎藥 物)。優(yōu)選的藥劑包括，例如阿司匹林和其它水楊酸鹽，Cox-2抑制劑，如rofecoxib (Vioxx) 和 celecoxib (Celebrex)，NSAIDs 如布洛芬(Motrin，Advil)，非諾洛芬(Nalfon)，萘 普生(Naprosyn)，舒林酸(Clinoril)，二 氯芬酸(Voltaren)，吡羅昔康(Feldene)，酮 洛芬(Orudis)，二氟尼柳(Dolobid)，萘丁美酮(Relafen)，依托度酸(Lodine)，噁丙秦 (Daypro)，和吲哚美辛(Indocin)。在另一個實施方案中，這類治療劑包括一種或多種DMARDs，如氨甲蝶呤 (Rheumatrex)，羥氯喹(Plaquenil)，水楊酸偶氮磺胺吡啶(Asulfidine)，嘧啶合成抑制 劑，例如，來氟米特(Arava)，IL-I受體阻抑劑，例如，anakinra (Kineret)，和TNF_a阻抑劑， 例如，etanercept (Enbrel)，infliximab (Remicade)禾口 adalimumab。在另一個實施方案中，這類治療劑包括一種或多種免疫抑制劑，如環(huán)孢霉素 (Sandimmune, Neoral)禾口義美仁(Imural)。還在另一個實施方案中，這類治療劑包括一種或多種化療劑，如阿霉素 (Adriamycin)JI^S (Platinol)、博來霉素(Blenoxane)、卡莫司汀(Gliadel)、環(huán)磷酰胺 (Cytoxan, Procytox, Neosar)禾口苯丁酸氮芥(Leukeran)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人抗體可以結(jié)合苯丁酸氮芥和潑尼松龍；環(huán) 磷酰胺和潑尼松龍；環(huán)磷酰胺，長春新堿和潑尼松；環(huán)磷酰胺，長春新堿，阿霉素和潑 尼松；氟達拉濱和蒽環(huán)霉素；或結(jié)合其它普通的對于NHL的多藥物方案，如，例如在 Non-Hodgkin' sLymphomas :Making sense of Diagnosis, Treatment, and Options, Lorraine Johnston, 1999, O，Reilly and Associates, Inc 中公開的方案一起進行給藥。
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還在另一個實施方案中，人抗體可以結(jié)合放療和/或自體外周血干細(xì)胞或骨髓移 植進行給藥。仍然在另一個實施方案中，人抗體可以結(jié)合一種或多種選自人抗CD25抗體、抗 ⑶19抗體、抗⑶21抗體、抗⑶22抗體、抗⑶37抗體、抗⑶38抗體、抗IL6R抗體、抗IL8抗 體、抗IL15抗體、抗IL15R抗體、抗CD4抗體、抗CDlla抗體(例如natalizumab)、抗α -4/ β -1整聯(lián)蛋白(VLA4)抗體(例如，natal izumab)和CTLA4_Ig的抗體進行給藥。在一個特定的實施方案中，人單克隆抗體結(jié)合抗CD25抗體進行給藥來治療例如 在移植物抗宿主病患者中的大皰性類天皰瘡。在另一個特定的實施方案中，人單克隆抗體結(jié)合一種或多種選自抗CD19抗體、抗 ⑶21抗體、抗⑶22抗體、抗⑶37抗體、抗⑶38抗體的抗體進行給藥來治療惡性疾病。仍然在另一個特定的實施方案中，人抗體結(jié)合一種或多種選自抗IL6R抗體、抗 IL8抗體、抗IL15抗體、抗IL15R抗體、抗⑶4抗體、抗⑶Ila抗體(例如natalizumab)、抗 α -4/ β -1整聯(lián)蛋白(VLA4)抗體(例如，natalizumab)和CTLA4_Ig的抗體進行給藥來治 療炎癥疾病。還在另一個實施方案中，人抗體可以結(jié)合抗C3b (i)抗體進行給藥以便增強補體激活。如本文所用的，“可以藥用的載體”包括在生理學(xué)上可混溶兼容的任一種和所有的 溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸附延遲劑等。優(yōu)選地，所述載體 適合通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、脊髓或表皮途徑使用(例如，通過注射或輸注)。根據(jù) 給藥途徑，可以用一種材料對活性化合物，即抗體、雙特異性或多特異性分子進行包衣，以 便保護該化合物免受有可能使該化合物失活的酸和其它自然條件的作用?！翱梢运幱玫柠}”表示能保留親本化合物的理想生物學(xué)活性，并且不會產(chǎn)生任何不 需要的毒理學(xué)作用的鹽(例如，參見Berge，S. Μ.等，1977，J. Pharm. Sci. 66 1_19)。所述 鹽的例子包括酸加成鹽和堿加成鹽。酸加成鹽包括源于諸如氫氯酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴 酸、氫碘酸、亞磷酸之類的無毒無機酸的鹽，以及源于諸如脂肪族一和二羧酸、苯基取代的 鏈烷酸、羥基鏈烷酸、芳族酸、脂族和芳香族磺酸之類的無毒有機酸的鹽。堿加成鹽包括源 于諸如鈉、鉀、鎂、鈣之類的堿土金屬鹽，以及源于諸如N，N’_ 二苯基乙二胺、N-甲基谷胺酰 胺、鹽酸普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺和普魯卡因之類的無毒有機胺的鹽。本發(fā)明的組合物可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法給藥。正如技術(shù)人員可以理解 的，給藥途徑和/或方式可以根據(jù)需要的結(jié)果改變。所述活性化合物可以和能夠防止該化 合物迅速釋放的載體一起制備，如控釋制劑，包括移植物、經(jīng)皮貼膏，和微型膠囊化輸送系 統(tǒng)?？梢允褂媚苌锝到獾?、生物兼容性聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、 聚原酸酯和聚乳酸。用于制備所述制劑的很多方法已經(jīng)具有專利或者為本領(lǐng)域技術(shù)人員 所普遍公知。例如,參見 Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson,編輯，Ma rcelDekker, Inc. , New York, 1978。為了通過某些給藥途徑使用本發(fā)明的化合物gcg，可能有必要用一種材料對該化 合物進行包衣，或者與該化合物共給藥，以防止其失活。例如，所述化合物可以在諸如脂質(zhì) 體或稀釋劑的合適載體中給予個體?？伤幱玫南♂寗┌}水和含水的緩沖液。脂質(zhì)體包 括水包油包水CGF乳液，以及傳統(tǒng)的脂質(zhì)體(Strejan等，1984，J. Neuroimmunol. 7 27)。
可以藥用的載體包括無菌水溶液或分散劑，以及用于臨時制備無菌注射溶液或分 散劑的無菌粉末。所述介質(zhì)和制劑作為藥用活性物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域中都是公知的。任何 傳統(tǒng)介質(zhì)或試劑都可將其用于本發(fā)明的藥用組合物中，除非與所述活性化合物不配伍。還 可將補充性活性化合物摻入所述組合物中。治療組合物一般必須是無菌的，并且在產(chǎn)生和儲存條件下是穩(wěn)定的?？梢詫⑺?組合物制備成溶液、微乳液、脂質(zhì)體、或其它適合高藥物濃度的有序結(jié)構(gòu)。所述載體可以是 含有諸如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)及其合適混合物的溶劑 或分散介質(zhì)。例如，可以通過使用諸如卵磷脂的包衣劑，對于分散劑來說通過保持需要的粒 度，以及通過使用表面活性劑來保持適當(dāng)?shù)牧鲃有浴Ｔ诤芏嗲闆r下，在所述組合物中優(yōu)選包 括等滲劑，例如，糖、聚醇，如甘露糖醇、山梨醇或氯化鈉。通過在所述組合物中添加諸如單 硬脂酸鹽和明膠的能延長吸收的制劑，實現(xiàn)所述可注射組合物的延長吸收。無菌注射溶液可以通過以下方法制備將所需量的活性化合物摻入合適的溶劑 中，該溶劑根據(jù)需要含有上面所列舉的一種成分或幾種成分的組合，然后進行消毒微量過 濾。通常，分散劑是通過將所述活性化合物添加到含有基本分散介質(zhì)和來自上文所列舉的 其它必需成分的無菌載體中而制備的。對于用來制備無菌注射溶液的無菌粉末來說，優(yōu)選 的制備方法是真空干燥和冷凍干燥(冷凍干燥)，它獲得所述活性成分的粉末，和來自它的 事先無菌過濾的溶液的任何其它必需成分。對劑量方案進行調(diào)整，以便提供最佳的所需反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。例如，可以給 予單一的藥團，可以隔一定時間給予若干分開的劑量，或者根據(jù)表現(xiàn)出來的治療狀況緊急 程度的需要，相應(yīng)地減少或增加劑量。將腸胃外組合物制成劑量單位形式是特別有利的，它 可以方便服用，并保持劑量的一致性。本文所用的劑量單位形式表示適合作為接受治療的 個體的單一劑量的在物理形式上獨立的單位；每個單位含有計算出來的、產(chǎn)生所需治療效 果的預(yù)定數(shù)量的活性化合物，和需要的藥用載體。本發(fā)明劑量單位形式的確定直接取決和 依賴于(a)所述活性化合物的獨特特征和要獲得的具體治療效果，和(b)為了個體的治療 靈敏度制備這樣一種活性化合物的領(lǐng)域中所固有的限制?？梢运幱玫目寡趸瘎┑睦影?1)水溶性抗氧化劑，如抗壞血酸、鹽酸半胱氨 酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁 基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、鎵酸丙酯、α -生育酚等；和(3)金 屬螯合劑，如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。對于治療組合物來說，本發(fā)明的制劑包括適合口服、鼻腔、局部(包括口腔和舌 下)、直腸、陰道和/或腸胃外給藥用的制劑。所述制劑能以單位劑量形式方便地提供，并且 可以通過藥物學(xué)領(lǐng)域的任何已知方法制備。用于產(chǎn)生單一劑量形式的可以與載體材料組合 的活性成分的量，根據(jù)被治療的個體和特定的給藥方式而改變?？梢耘c載體材料組合以產(chǎn) 生單一劑量形式的的活性成分的量，通常是能產(chǎn)生治療效果的組合物的量。一般，以百分比 衡量，活性成分的用量在大約0. 01 %到大約99 %之間，優(yōu)選大約0. 1 %到大約70 %，最優(yōu)選 大約到大約30%。適合陰道使用的本發(fā)明的制劑還包括含有本領(lǐng)域已知合適的載體的子宮托、止血 棉塞、乳劑、凝膠、糊劑、泡末或噴霧制劑。用于本發(fā)明組合物的局部或經(jīng)皮給藥的劑量形式 包括粉末、噴霧劑、軟膏、糊劑、乳劑、洗液、凝膠、溶液、膏貼和吸入劑?？梢栽跓o菌條件下將活性化合物與可以藥用的載體和可能需要的任何防腐劑、緩沖劑和推進劑混合。本文所使用的短語“腸胃外給藥”和“經(jīng)腸胃外給藥”表示除了腸道和局部給藥 以外的用藥方式，通常是通過注射給藥，并且包括，但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊 內(nèi)、眼眶內(nèi)、心內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、珠網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)、 硬膜外和胸骨內(nèi)注射和輸注?？捎糜诒景l(fā)明的藥用組合物中的合適的含水載體和無水載體的例子包括水、乙 醇、多元醇(如甘油、丙二醇和聚乙二醇等)及其合適的混合物，植物油，如橄欖油，可注射 的有機酯，如油酸乙酯。例如，通過使用諸如卵磷脂的包衣材料，對于分散劑來說通過保持 需要的粒度，以及通過使用表面活性劑可以保持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。這些組合物還可以含有佐劑，如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。通過上述消毒 方法，并通過添加各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑確保防止出現(xiàn)微生物，例如，添加對羥基苯甲酸 酯類、氯丁醇、和酚山梨酸等?？赡苓€需要向所述組合物中添加等滲劑，如糖類、氯化鈉等。 另外，通過添加能延長吸收時間的諸如單硬脂酸鋁和明膠的制劑，實現(xiàn)可注射藥用制劑的 延長吸收。在一個實施方案中，本發(fā)明的人單克隆抗體通過皮下注射以晶體形式進行給藥， 參見，Yang 等(2003) PNAS, 100(12) :6934_6939。當(dāng)本發(fā)明的化合物在作為藥物給人和動物施用時，可以單獨使用，或者作為藥用 組合物使用，例如，0. 01-99. 5% (更優(yōu)選0. 1-90% )的活性成分與可以藥用的載體組合。無論選擇什么樣的給藥途徑，可以以合適的水化形式應(yīng)用的本發(fā)明的化合物和/ 或本發(fā)明的藥用組合物，能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的傳統(tǒng)方法制備成可以藥用的劑量 形式。本發(fā)明藥用組合物中的活性成分的實際劑量水平可以改變，以便獲得一種治療組 分的用量，它有效地實現(xiàn)預(yù)期的對特定患者、組合物、和給藥模式的治療反應(yīng)，而又對患者 沒有毒性。選擇的劑量水平取決于多種藥物動力學(xué)因素，包括所使用的本發(fā)明的特定組合 物或其酯、鹽或酰胺的活性，給藥途徑，給藥時間，所采用的特定化合物的排出速度，治療時 間，與所采用的特定組合物組合使用的其它藥物，化合物和/或材料，接受治療的患者的年 齡、性別、體重、狀態(tài)、一般健康情況以及以前的醫(yī)療史，以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的類似因
ο具有本領(lǐng)域普通技能的醫(yī)生或獸醫(yī)能方便地確定并開出有效量的所需藥用組合 物。例如，醫(yī)生或獸醫(yī)開始使用的所述藥用組合物中采用的本發(fā)明的化合物的量，低于獲得 理想治療效果所需要的量，并逐漸增加劑量，直到獲得理想的效果。一般地，本發(fā)明組合物 的合適的每日劑量是有效產(chǎn)生治療效果所需要的所述化合物的最低劑量。所述有效劑量通 常取決于上述因素。優(yōu)選通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下途徑使用，優(yōu)選在靠近靶位點處 給藥。如果需要，治療組合物的每日有效劑量可以按2個、3個、4個、5個、6個或更多個小 劑量，在1天內(nèi)以適當(dāng)?shù)臅r間間隔分別使用，選擇性地以單位劑量形式使用。本發(fā)明的化合 物盡管可以單獨給藥，但優(yōu)選以藥用制劑(組合物)形式給藥該化合物。在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的人單克隆抗體可以通過每周輸注10-500mg/m2， 如200-400mg/m2的劑量進行給藥。這種給藥可以重復(fù)，例如1_8次，如3_5次。所述給藥 可以通過在2-24小時的時間上，如2-12小時的持續(xù)輸注而進行。
在另一個實施方案中，通過長時間，如超過24小時的緩慢持續(xù)輸注來給藥人單克 隆抗體，從而減少毒性副作用。仍然在另一個實施方案中，以每周250mg-2000mg，如例如300mg、700mg、lOOOmg、 1500mg或2000mg的劑量多達8次，如4-6次對人單克隆抗體進行給藥。所述給藥可以通過 在2-24小時的時間上，如2-12小時的持續(xù)輸注而進行。如果必要的話可以在6個月或12 個月后重復(fù)這種方案一次或多次。在通過利用靶向抗⑶20抗體的抗獨特型抗體，可以在生 物樣品的給藥之后通過測量循環(huán)中的單克隆抗CD20抗體來測定或調(diào)節(jié)劑量。還在另一個實施方案中，人單克隆抗體通過維持治療，如，例如，每周一次持續(xù)6 個月或更久進行給藥。仍然在一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的人單克隆抗體可以通過一種方案進行給 藥，所述方案包括一次抗CD20的人單克隆抗體的輸注和隨后的結(jié)合到放射性同位素上的 抗⑶20人單克隆抗體的輸注。該方案可以例如在7-9天之后進行重復(fù)。治療組合物可以用本領(lǐng)域公知的醫(yī)療器械給藥。例如，在一種優(yōu)選的實施方案中， 本發(fā)明的治療組合物可以用無針頭的皮下注射裝置給藥，如使用公開于以下美國專利中的 裝置US 5399163 ；US 5383851 ；US 5312335 ；US 5064413 ；US 4941880 ；US 4790824 或 US 4596556?？捎糜诒景l(fā)明中的眾所周知的移植物和組件的例子包括US 4487603，它公開了 一種用于以受控制的流量分配藥物的可植入的微型輸注泵；US 4486194，它公開了一種用 于通過皮膚給藥的治療裝置；US 4447233，它公開了一種用于以精確的輸注流量輸送藥物 的藥物輸注泵；US4447224，它公開了一種用于連續(xù)藥物輸送的流量可變的可植入的輸注裝 置；US 4439196，它公開了一種具有多個腔室的滲透性藥物輸送系統(tǒng)；和US 4475196，它公 開了一種滲透性藥物輸送系統(tǒng)。很多其它這樣的植入物、輸送系統(tǒng)、和組件是本領(lǐng)域技術(shù)人 員所公知的。在某些實施方案中，可以對本發(fā)明的人單克隆抗體進行配劑，以便確保在體內(nèi)正 確地分配。例如，血腦屏障(BBB)排斥很多高度親水性化合物。為了確保本發(fā)明的治療化 合物能通過BBB(如果需要的話)，可以對所述化合物進行配劑，例如，包在脂質(zhì)體中。有 關(guān)產(chǎn)生脂質(zhì)體的方法參見，例如US 4522811 ；US 5374548;和US 5399331。脂質(zhì)體可以 包括一種或多種成分，這些成分被選擇性地輸送到特定的細(xì)胞或器官，因而增強定向藥物 輸送(參見，例如，V. V. Ranade, 1989，J. Clin. Pharmacol. 29 685)。示例性的靶向成分包 括葉酸或生物素(參見，例如，授予Low等的US5416016)；甘露糖苷(Umezawa等，1988， Biochem. Biophys. Res. Commun. 153 1038)；抗體(P. G. Bloeman 等，1995, FEBS Lett. 357 140 ；M-Owais 等，1995，Antimicrob. AgentsChemother39 180)；表面活性劑蛋白 A 受體 (Briscoe等，1995，Am. J. Physiol. 1233 134)，其中的不同種類可以包括本發(fā)明的制劑， 以及本發(fā)明分子的成分；pl20 (Schreier等，1994，J. Biol. Chem. 269 9090)；還可參見 K. Keinanen ；M. L. Laukkanen, 1994，F(xiàn)EBS Lett. 346 123 J. J. Killion ；I. J. Fidler, 1994， Immunomethods4 :273。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的治療化合物是在脂質(zhì)體中制 備的；在一種更優(yōu)選的實施方案中，所述脂質(zhì)體包括一種靶向成分。在一種最優(yōu)選的實施方 案中，所述脂質(zhì)體中的治療化合物是通過藥團注射的方式輸送到靠近目標(biāo)部位的。所述組 合物的流動性必須達到可以注射的程度。在生產(chǎn)和儲存條件下，它必須是穩(wěn)定的，并且必須 能防止諸如細(xì)菌和真菌的微生物的污染作用。
在另一個實施方案中，可以對本發(fā)明的單克隆抗體進行配制以阻止或減少它 們通過胎盤的傳輸。這可以通過本領(lǐng)域已知的方法進行，例如，通過抗體的PEG化或 通過利用F(ab)2，片段。還可以參見另外的參考文獻"Cunningham-Rundles C，Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992)Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulinconjugates. Resistance to enzymatic degradation.Jlmmunol Methods. 152 :177-190 ；禾口 “ Landor Μ. (1995)Maternal-fetal transfer ofimmunoglobulins,Ann AllergyAsthma Immunol 74 :279_283。當(dāng)抗體用于治療或預(yù)防復(fù) 發(fā)的自發(fā)性流產(chǎn)時這特別有效。對于腫瘤治療的“治療有量劑量”能夠通過可以是完全的或部分的客觀腫瘤反應(yīng) 進行測量。完全反應(yīng)(CR)定義為沒有疾病的臨床、放射線學(xué)或其它跡象。部分反應(yīng)(PR) 緣自超過50%的總體腫瘤大小的減小。進程的中間時間是描述客觀腫瘤反應(yīng)的耐久性的測量值。對于腫瘤治療的“治療有量劑量”還可以通過其穩(wěn)定疾病進程的能力進行測量?？?以在一種動物模型中評估一種化合物抑制癌癥的能力以預(yù)測其在人腫瘤中的效力。或者， 可以通過熟練技術(shù)人員已知的體外測試法檢測該化合物抑制細(xì)胞生長或凋亡的能力來評 估該化合物的特性。一種治療性化合物的治療有效量可以減少腫瘤大小，或者在個體中改 善癥狀。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠基于諸如個體大小、個體癥狀的嚴(yán)重性和所選的特定 組合物或給藥途徑的因素來確定這種量。對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的“治療有效劑量”優(yōu)選導(dǎo)致患者中的ACR20Preliminary Definition of Improvement,更力口優(yōu)選 ACR50 PreliminaryDefinition of Improvement 并且甚至更力口優(yōu)選 ARC70 PreliminaryDefinition of Improvement。ACR20 Preliminary Definition of Improvement 定義為在 TenderJoint Count (TCJ)和Swollen Joint Count (SffJ)中彡20%的改善，和在下列5種評估中患者 疼痛評估(VAS)、患者整體評估(VAS)、醫(yī)生整體評估(VAS)、患者自我評估的失能(HAQ)、 Acute PhaseReactant (CRP 或 ESR)的 3 種中彡 20% 的改善。ACR50和ACR70分別以相同的方式定義為彡50%和彡70%的改善。進一步的細(xì) 節(jié)參見 Felson 等· in American College of RheumatologyPreliminary Definition of Improvement in Rheumatoid Arthritis ；Arthritis Rheumatism(1995)38 :727_735。所述組合物必須是無菌的，并且其流動性必須達到使該組合物能夠通過注射器輸 送的程度。除了水之外，所述載體可以是等滲緩沖的鹽溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙 二醇、和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物。例如，合適的流動性可以通過使用諸如卵磷 脂的包衣劑，對于分散劑來說通過保持需要的粒度，以及通過使用表面活性劑來保持。在許 多情況下，優(yōu)選在所述組合物中添加等滲劑，例如，糖類，諸如甘露糖醇或山梨醇的聚醇，和 氯化鈉?？勺⑸浣M合物的長期吸收，可以通過在該組合物中添加諸如單硬脂酸鋁或明膠的 能延長吸收的制劑而實現(xiàn)。當(dāng)所述活性化合物如上所述受到適當(dāng)保護時，該化合物就可以口服使用，例如，用 一種惰性稀釋劑或可同化的食用載體進行保護。VI.本發(fā)明的用途和方法本發(fā)明的人抗體(包括本文所述的免疫結(jié)合物、雙特異性/多特異性組合物和其
44它衍生物)具很多體外和體內(nèi)的診斷和治療用途，包括涉及表達CD20細(xì)胞的病癥的診斷和 治療。例如，可以將抗體施用于培養(yǎng)中的，例如體外或來自體內(nèi)的細(xì)胞，或用于人個體，例 如，體內(nèi)，以便治療、預(yù)防或診斷多種疾病。如本文所用的，術(shù)語“個體”意在包括對于抗CD20 的人抗體產(chǎn)生應(yīng)答的人和非人動物。優(yōu)選的個體包括患有能夠通過抑制或控制B細(xì)胞(正 常的或惡性的)進行修正或改善的病癥的人患者。例如，在一個實施方案中，可以使用本發(fā)明的人抗體來治療致瘤病癥患者，例如特 征為存在表達CD20的細(xì)胞，例如，B細(xì)胞淋巴瘤的病癥，例如，NHL?？梢灾委熀?或預(yù)防的 致瘤疾病的例子包括B細(xì)胞淋巴瘤，例如NHL，包括前體B細(xì)胞成淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤 和成熟B細(xì)胞瘤，如B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(SLL)、B細(xì)胞原 淋巴細(xì)胞淋巴瘤、淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)，濾泡淋巴瘤(FL)，包括低級、中 級和高級FL，皮膚毛囊中心淋巴瘤，邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(MALT型，結(jié)節(jié)和脾型)，毛細(xì)胞白 血病，擴散大B細(xì)胞淋巴瘤，Burkitt淋巴瘤，漿細(xì)胞瘤，漿細(xì)胞骨髓瘤，移植后淋巴增生性 疾病，\Valdenstr5m巨球蛋白血癥和恢復(fù)性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)。B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的其它的例子是淋巴瘤樣肉芽腫病、原發(fā)性擴散淋巴瘤、靜 脈內(nèi)大B細(xì)胞淋巴瘤、縱隔大B細(xì)胞淋巴瘤、重鏈疾病(包括Υ、μ和α疾病)、由免疫抑 制劑療法所誘導(dǎo)的淋巴瘤，如環(huán)孢霉素誘導(dǎo)的淋巴瘤和氨甲蝶呤誘導(dǎo)的淋巴瘤。在另一個實施方案中，可以利用本發(fā)明的人抗體治療霍奇金淋巴瘤?？梢灾委熀?或預(yù)防的涉及表達CD22細(xì)胞的免疫疾病的例子包括自身免疫疾病， 如牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、皮膚炎、系統(tǒng)性硬皮病、炎癥性腸疾病(IBD)、局限性回腸炎、潰 瘍性結(jié)腸炎、呼吸窘迫綜合征、腦膜炎、腦炎、色素層炎、腎小球腎炎、濕疹、哮喘、動脈粥樣 硬化、白細(xì)胞粘連缺乏、多發(fā)性硬化癥、Raynaud綜合征、Sj6gren綜合征、青少年起病型糖 尿病、Reiter病、Behcet病、免疫復(fù)合性腎炎、IgA腎病、IgM多發(fā)性神經(jīng)病、免疫介導(dǎo)的血 小板減少癥，如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜和慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜，溶血性貧 血、重癥肌無力、狼瘡性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、特應(yīng)性皮炎、天皰瘡、 格雷夫斯病、橋本甲狀腺炎、Wegener肉芽腫病、Omenn氏綜合征，慢性腎功能衰竭、急性傳 染性單核細(xì)胞增多癥、HIV和皰疹病毒相關(guān)疾病。進一步的例子為急性呼吸窘迫綜合征和 choreoretinitis。另外，其它的疾病和病癥包括那些由病毒，如Epstein-Barr病毒(EBV) 感染B細(xì)胞所引發(fā)或介導(dǎo)的疾病和病癥。其中自身抗體和/或過度的B細(xì)胞活性是顯著的并且可以治療和/或預(yù)防的炎癥 性、免疫和/或自身免疫病癥的其它例子，包括下列血管炎和其它血管病癥，如血管炎和其它脈管病癥，如細(xì)微多脈管炎、 Churg-Strauss綜合征和其它ANCA關(guān)聯(lián)的脈管炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、原發(fā)性冷球蛋 白血癥性脈管炎、皮膚白細(xì)胞分裂性脈管炎、川崎病、大動脈炎、巨大細(xì)胞關(guān)節(jié)炎、 Henoch-Schnlein紫癜、原發(fā)的或分離的腦脈管炎、結(jié)節(jié)性紅斑、血栓閉塞性脈管炎、血栓性 血小板減少性紫癜(包括溶血性尿毒性綜合征)，和次級血管炎，包括皮膚白細(xì)胞分裂性 脈管炎(例如，乙肝、丙肝、Waldenstr6m，s巨球蛋白血癥、B細(xì)胞瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 Sj6gren，s綜合征或系統(tǒng)性紅斑狼瘡繼發(fā)的)；其它的例子為結(jié)節(jié)性紅斑、變應(yīng)性脈管炎、 脂膜炎、Weber-Christian病、紫癜多球蛋白血癥和Buerger，s病；皮膚病癥，如接觸性皮炎、線性IgG皮膚病、白斑、壞疽性膿皮病、后天性大皰性表皮松解、尋常性天皰瘡(包括疤痕性類天皰瘡和大皰性類天皰瘡)、皰疹樣皮炎、多形紅斑 和慢性自身免疫性風(fēng)疹(包括血管神經(jīng)性水腫和風(fēng)疹性脈管炎)；免疫介導(dǎo)的血細(xì)胞減少癥，如自身免疫性嗜中性白血球減少癥和純紅細(xì)胞再生障 礙；結(jié)締組織病癥，如CNS狼瘡、盤狀紅斑狼瘡、肢端硬皮綜合征、混合性結(jié)締組織病、 多肌炎/皮肌炎、包涵體肌炎、繼發(fā)性淀粉樣變性I和II型、冷球蛋白血癥、纖維肌痛、磷 脂抗體綜合征、繼發(fā)性血友病、復(fù)發(fā)性多軟骨炎、類內(nèi)瘤病、強直人綜合征、風(fēng)濕熱；其它 的例子為嗜酸性筋膜炎；關(guān)節(jié)炎，如強直性脊柱炎、幼年期慢性關(guān)節(jié)炎、成人still’ S病、 SAPHO綜合征；其它的例子為骶髂關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、Still’ s病和痛風(fēng)；血液病癥，如 再生障礙性貧血、原發(fā)性溶血性貧血(包括冷凝集素綜合征)、CLL或系統(tǒng)性紅斑狼瘡繼發(fā) 的溶血性貧血；poems綜合征、惡性貧血、Waldenstrom，s紫癜多球蛋白血癥；其它的例 子為粒細(xì)胞缺乏、自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥、Franklin' s病、Seligmarm’ s病、μ鏈 病、胸腺瘤和淋巴瘤繼發(fā)的癌旁綜合征和因子VIII抑制劑形成；內(nèi)分泌病，如多內(nèi)分泌腺 病、Addison’ s??；自身免疫性低血糖癥、自身免疫性甲狀腺功能低下、自身免疫性胰島素 綜合征、de Quervain' s甲狀腺炎和胰島素受體抗體介導(dǎo)的胰島素耐受性；肝-胃腸道病 癥，如乳糜瀉、惠普爾病、原發(fā)性膽汁性肝硬變、慢性活動性肝炎和原發(fā)性膽管炎；其它的例 子為自身免疫性胃炎；腎病，如急性腎小球腎炎，后鏈球菌腎炎、Goodpasture’ s綜合征、膜 性腎小球腎炎和冷球蛋白血癥；其它的例子為微小病變疾?。簧窠?jīng)障礙，如自身免疫性神 經(jīng)障礙、多發(fā)性單神經(jīng)炎、Lambert-Eaton’ s肌無力綜合征、Sydenham’ s舞蹈癥、脊髓癆和 Gui 1 Iain-Barre’ s綜合征；其它的例子為脊髓病/熱帶強直性下肢輕癱、重癥肌無力、急性 炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病和慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)??；心肺病癥，如成纖維性組織肺泡炎、 細(xì)支氣管炎obliterans、變應(yīng)性曲霉病、囊性纖維化、單純性肺嗜酸細(xì)胞浸潤癥、心肌炎和 心包炎；其它的例子為過敏性肺炎和肺癌繼發(fā)的癌旁綜合征；變應(yīng)性病癥，如支氣管哮喘 和高IgE綜合征；其它的例子為一時性黑蒙；眼科病癥，如特發(fā)性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎；感染性 疾病，如細(xì)小病毒B感染(包括hands-and-socks綜合征)；和婦產(chǎn)科病癥，如習(xí)慣性流產(chǎn)、復(fù)發(fā)性習(xí)慣性流產(chǎn)和子宮內(nèi)生長障礙；其它的例子為 婦科瘤繼發(fā)的癌旁綜合征；男性生殖病癥，如睪丸瘤繼發(fā)的癌旁綜合征；和源自移植的病 癥，如同種異基因移植物和異種移植物排斥，和移植物對抗宿主疾病。在一個實施方案中，所述疾病為炎癥性的、免疫和/或自身免疫性的病癥，選自潰 瘍性結(jié)腸炎，局限性回腸炎，幼年期初期糖尿病，多發(fā)性硬化癥，免疫介導(dǎo)的血小板減少癥， 如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜和慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜，溶血性貧血(包括自體 免疫性溶血性貧血)，重癥肌無力，系統(tǒng)性硬化病和尋常性天皰瘡。在另一個實施方案中，本發(fā)明的人抗體可以用于檢測CD20的水平，或在其膜表面 包含CD20的細(xì)胞的水平，隨后可以將所述水平與某些疾病癥狀聯(lián)系起來?；蛘?，可以將所 述抗體用于消除表達CD20的細(xì)胞或與表達CD20的細(xì)胞相互作用，由此顯示這些細(xì)胞為該 疾病的重要介體。這可以通過將樣品與對照樣品與抗CD20抗體在允許形成抗體和CD20間 復(fù)合物的條件進行接觸而實現(xiàn)。在樣品和對照樣品中檢測和比較抗體和CD20間形成的任 何復(fù)合物。開始可以對本發(fā)明的人抗體測試其與體外治療性和診斷性用途相關(guān)聯(lián)的結(jié)合活性。例如，可以利用在下面實施例中所述的流式細(xì)胞分析測試所述抗體。而且，可以測試抗 體誘發(fā)至少一種效應(yīng)物介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞活性的活性，包括抑制和/或殺死表達⑶20的細(xì) 胞。例如，可以測定抗體誘發(fā)CDC和/或凋亡的能力。測定CDC、同質(zhì)型粘附、分子聚集或凋 亡的方案在下面實施例中進行介紹。本發(fā)明的人抗體在多種CD20相關(guān)疾病的治療和診斷中還有其它的用途。例如，所 述人抗體可以用于在體內(nèi)或體外誘發(fā)一種或多種下列生物學(xué)活性抑制表達CD20的細(xì)胞 的生長和/或分化；殺死表達CD20的細(xì)胞；在人效應(yīng)細(xì)胞存在時介導(dǎo)表達CD20的細(xì)胞的吞 噬作用或ADCC ；在補體存在時介導(dǎo)表達⑶20的細(xì)胞的⑶C ；介導(dǎo)表達⑶20的細(xì)胞的凋亡； 誘導(dǎo)同質(zhì)型粘附；和/或在結(jié)合CD20后誘導(dǎo)向脂筏的轉(zhuǎn)位。在一個特定的實施方案中，所述人抗體用于在體內(nèi)或體外治療、預(yù)防或診斷多種 CD20相關(guān)疾病。CD20相關(guān)疾病的例子包括其它疾病中的B細(xì)胞淋巴瘤，例如，NHL，和免疫 疾病，例如自身免疫疾病，如上所列的那些。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明的人抗體用于治療或預(yù)防NHL，因為所述抗體消 除載有CD20的腫瘤細(xì)胞。非霍奇金淋巴瘤是一種B細(xì)胞淋巴瘤類型。淋巴瘤，例如，B細(xì)胞淋巴瘤，是一組 當(dāng)淋巴細(xì)胞(一種血細(xì)胞)變?yōu)閻盒詴r發(fā)生的相關(guān)腫瘤。淋巴細(xì)胞的正常功能是防御身體 的外侵物細(xì)菌、病毒、真菌，甚至是腫瘤。有許多淋巴細(xì)胞的亞型和突變期，所以，有許多種 類的淋巴瘤。像正常細(xì)胞一樣，惡性淋巴細(xì)胞能夠移至身體的許多部分。一般，淋巴瘤細(xì)胞 在淋巴系統(tǒng)中形成腫瘤骨髓、淋巴結(jié)、脾和血液。但是，這些細(xì)胞可以轉(zhuǎn)移到其它器官中。 某些類型的淋巴瘤趨于在正常細(xì)胞生長的地方生長。例如，濾泡NHL腫瘤普遍在淋巴節(jié)中 發(fā)育。在與NHL相關(guān)聯(lián)的瘤(即，致瘤的)B細(xì)胞中通常以提高的水平表達⑶20。因此， 本發(fā)明的CD20結(jié)合抗體可以用于消除導(dǎo)致NHL的載有CD20的腫瘤細(xì)胞，因而可以用于預(yù) 防或治療這種疾病。本發(fā)明的人抗體(例如，人單克隆抗體、多特異性和雙特異性分子)還可以用于阻 抑或抑制⑶20的其它效應(yīng)。例如，已知⑶20表達于B淋巴細(xì)胞上并且參與這些細(xì)胞的增 殖和/或分化。由于B淋巴細(xì)胞作為一種免疫調(diào)節(jié)物而起作用，所以CD20是靶向B淋巴功 能的抗體介導(dǎo)的治療的重要靶目標(biāo)，例如，滅活或殺死參與自身免疫病癥的B淋巴細(xì)胞。這 類自身免疫病癥包括，例如，上面所列的疾病。體內(nèi)和體外給藥本發(fā)明的組合物(例如，人單克隆抗體、多特異性和雙特異性分 子以及免疫結(jié)合物)的合適途徑是本領(lǐng)域所公知的并且可以為普通技術(shù)人員所選擇。例 如，可以通過注射(例如，靜脈內(nèi)或皮下)來給藥所述抗體組合物。所用分子的合適劑量依 賴于個體的年齡和體重以及抗體組合物的濃度和/或劑型。而且，可以確定腫瘤位置并用 于計算合適的劑量。如前所述，本發(fā)明的人抗CD20抗體可以與一種或多種其它治療劑，例如細(xì)胞毒性 劑、放射毒性劑或免疫抑制劑一起共給藥。該抗體可以連接到抗原上(作為免疫復(fù)合物) 或可以獨立于藥劑進行給藥。在后一種情況中(獨立給藥)，可以在該藥劑之前、之后或同 時給藥該抗體或可以與其它已知的療法一起共給藥，例如，一種如放射的抗癌療法。這類治 療劑包括在其它治療劑中的抗瘤劑如阿霉素、順鉬、博來霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和環(huán)
47磷酰胺。本發(fā)明的人抗CD20與化療劑的共給藥提供兩種通過不同機制起作用的抗癌劑，所 述機制產(chǎn)生對人腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)。這種共給藥可以解決由于抗藥性的發(fā)展或腫瘤抗 原性的變化產(chǎn)生的問題，所述腫瘤抗原性的變化會使得它們與所述抗體不反應(yīng)。靶特異性效應(yīng)細(xì)胞，例如，連接到本發(fā)明的組合物上的效應(yīng)細(xì)胞也可以用作治療 劑。靶向的效應(yīng)細(xì)胞可以是人淋巴細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞或單核細(xì)胞。其它的細(xì)胞 包括嗜曙紅細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞和其它載有IgG或IgA受體的細(xì)胞。如果需要，可以從要治 療的個體中獲得效應(yīng)細(xì)胞。靶特異性效應(yīng)細(xì)胞可以作為生理上可接受的溶液中的細(xì)胞懸液 進行給藥。給藥細(xì)胞的數(shù)目可以在IO8-IO9的數(shù)量級但是將根據(jù)治療目的變化。通常，所述 量將足以獲得靶細(xì)胞，例如，表達CD20的腫瘤細(xì)胞的定位，并且通過吞噬作用影響細(xì)胞殺 傷。給藥的途徑也可以變化。用靶特異性效應(yīng)細(xì)胞的治療可以結(jié)合其它去除靶細(xì)胞的技術(shù)一起進行。例如，利 用本發(fā)明的組合物(例如，人抗體、多特異性和雙特異性分子)的和以裝備這些組合物的 細(xì)胞的抗腫瘤治療可以與化療結(jié)合使用。另外，可以使用組合治療來將兩種不同的細(xì)胞毒 性效應(yīng)群體定向于腫瘤細(xì)胞排斥。例如，連接到抗Fc-YRI或抗CD3的抗CD20抗體可以與 IgG或IgA受體特異性結(jié)合劑結(jié)合使用。本發(fā)明的雙特異性和多特異性分子還可以用于調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞上的Fc γ R或Fc α R 水平，如細(xì)胞表面上的受體加帽和消除?？笷c受體的混合物也可以用作此目的。在補體存在的情況下，還可以使用具有補體結(jié)合位點的本發(fā)明組合物(例如，人 抗體，多特異性和雙特異性分子)，例如，來自IgG_l、2或3或IgM的結(jié)合補體的部分。在一 個實施方案中，用本發(fā)明的結(jié)合制劑和合適的效應(yīng)細(xì)胞對包括靶細(xì)胞的細(xì)胞群體進行的來 自體內(nèi)的治療，可以通過添加補體或含有補體的血清進行補充。通過結(jié)合補體蛋白，可以改 善對由本發(fā)明的結(jié)合制劑包被的靶細(xì)胞的吞噬作用。在另一個實施方案中，由本發(fā)明組合 物(例如，人抗體，多特異性和雙特異性分子)包被的靶細(xì)胞還可以被補體裂解。還在另一 個實施方案中，本發(fā)明的組合物不激活補體。本發(fā)明的組合物(例如，人抗體，多特異性和雙特異性分子)還可以與補體一起施 用。因此，包括人抗體、多特異性或雙特異性分子和血清或補體的組合物屬于本發(fā)明的范 疇。這種組合物的優(yōu)點是，所述補體緊鄰所述人抗體、多特異性或雙特異性分子。另外，可 以分別施用本發(fā)明的人抗體、多特異性或雙特異性分子以及補體或血清。本發(fā)明的靶向細(xì) 胞的組合物的結(jié)合引發(fā)CD20抗原-抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜的脂筏中。這種轉(zhuǎn)位產(chǎn)生高 密度的可以激活和/或增強CDC的抗原-抗體復(fù)合物。包括本發(fā)明組合物(例如，人抗體，多特異性或雙特異性分子)的試劑盒以及使用 的說明書也屬于本發(fā)明的范疇。該試劑盒可以進一步包括一種或多種其它制劑，如免疫抑 制劑、細(xì)胞毒性劑或放射毒性劑，或一種或多種其它本發(fā)明的人抗體(例如，具有互補活性 的人抗體)。因此，用本發(fā)明的抗體組合物治療的患者可以另外給藥(在本發(fā)明的人抗體給藥 之前、同時或之后)另一種治療劑，如細(xì)胞毒性劑或放射毒性劑，它增強或增大人抗體的治 療效果。在其它的實施方案中，還可以用調(diào)節(jié)，例如，增強或抑制免疫細(xì)胞活性和/或Fc Y 或Fc α受體的表達或活性的制劑治療所述個體，通過例如，用細(xì)胞因子治療所述個體。在用所述多特異性分子治療期間給藥的優(yōu)選細(xì)胞因子，包括粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒 細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、干擾素γ (IFN-γ)和腫瘤壞死因子(TNF)。本發(fā)明的組合物(例如，人抗體，多特異性和雙特異性分子)還可以用于靶向于表 達Fc YR或CD20的細(xì)胞，例如，用于標(biāo)記所述細(xì)胞。對這種用途來說，所述結(jié)合制劑可以與 一種可以檢測的分子連接。因此，本發(fā)明提供了用于定位來自體內(nèi)的或體外的表達Fc受 體，如Fc γ R或CD20的細(xì)胞的方法。例如，所述可檢測的標(biāo)記可以是放射性同位素、熒光化 合物、酶或酶輔助因子。在一個特定的實施方案中，本發(fā)明提供在樣品中檢測CD20抗原的存在，或測量 CD20抗原量的方法，包括將樣品和對照樣品與特異性結(jié)合CD20的人單克隆抗體在允許形 成抗體或其部分與CD20間的復(fù)合物的條件下進行接觸。隨后檢測復(fù)合物的形成，其中在樣 品與對照樣品比較之間的差異復(fù)合物形成是樣品中存在⑶20的表征。在其它的實施方案中，本發(fā)明提供通過向個體給藥上述的人抗體，在個體中治療 涉及表達CD20細(xì)胞的病癥，例如，非霍奇金淋巴瘤或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法。這種抗體或 其衍生物用于抑制與某些病癥相關(guān)聯(lián)的CD20誘導(dǎo)的活性，例如，增殖和/或分化。通過將 抗體與CD20接觸(例如，通過向個體給藥抗體)，CD20誘導(dǎo)這種活性的能力得以抑制并且， 因而，相關(guān)聯(lián)的病癥得到治療。因此，在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防涉及表達CD20細(xì)胞的致 瘤性病癥，例如，NHL的方法。該方法包括以足以治療或預(yù)防該病癥的量向個體給藥一種本 發(fā)明的抗體組合物。該抗體組合物可以單獨地或與另一種治療劑一起進行給藥，所述另一 種治療劑如一種細(xì)胞毒性劑或放射毒性劑，它與所述抗體組合物結(jié)合或協(xié)同起作用來治療 或預(yù)防涉及表達CD20細(xì)胞的疾病。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供一種治療非 霍奇金淋巴瘤的方面。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防涉及人表達CD20細(xì)胞的自身 免疫病癥，例如，那些上面所列的疾病。該方法包括以足以治療或預(yù)防該病癥的量向個體給 藥一種本發(fā)明的抗體組合物。該抗體組合物可以單獨地或與另一種治療劑一起進行給藥， 所述另一種治療劑如一種細(xì)胞毒性劑或放射毒性劑，它與所述抗體組合物結(jié)合或協(xié)同起作 用來治療或預(yù)防涉及表達CD20細(xì)胞的疾病。仍然在另一個實施方案中，本發(fā)明提供一種體內(nèi)或體外檢測表達CD20的細(xì)胞的 存在或量化該細(xì)胞的方面。該方法包括(i)向個體給藥一種結(jié)合到可檢測標(biāo)記上的本發(fā)明 的組合物(例如，一種多特異性或雙特異性分子)；(ii)將該個體暴露于檢測所述可檢測標(biāo) 記的工具以便鑒定包含表達CD20的細(xì)胞的區(qū)域。還在另一個實施方案中，本發(fā)明的免疫結(jié)合物可以用于通過將所述化合物連接所 述抗體上，將所述化合物(例如，治療劑、標(biāo)記、細(xì)胞毒素、放射毒素、免疫抑制劑等)靶向表 面有⑶20表達的細(xì)胞上。因而，本發(fā)明還提供定位來自體內(nèi)或體內(nèi)的表達⑶的細(xì)胞，如 Reed-Sternberg細(xì)胞(例如，用一種可檢測的標(biāo)記，如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶 輔助因子)的方法?；蛘撸雒庖呓Y(jié)合物可以通過將細(xì)胞毒素或放射毒素靶向CD20用于 殺死表面有⑶20表達的細(xì)胞。通過以下實施例對本發(fā)明作進一步說明，不應(yīng)當(dāng)將這些實施例理解成是進一步的 限定。實施例用于實施例中的B細(xì)胞系 Daudi、ARH_77、D0HH、Raji、Ramos-EHRB 和 Tanoue B 細(xì)胞系在添加了 10%的胎牛 血清(FCS) (Optimum C241,ffisentlnc. , st. Bruno, Canada) ,2mM L-谷氨酰胺、lOOIU/ml 青 霉素、100 μ g/ml鏈霉素和 ImM丙酮酸鈉(都來自 Gibco BRL,Life Technologies,Paisley, Scotland)的RPMI1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。SU-DHL-4B細(xì)胞系在相同但沒有丙酮酸鈉的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。將培養(yǎng)物保持在37°C下于加濕的5% CO2培養(yǎng)箱中，吹散并收集80_90%的匯集 物。每周更換培養(yǎng)基兩次。此時將細(xì)胞吹散并以1-1. 5X IO6細(xì)胞/ml進行接種以確保生 存力和最佳生長。實施例1抗⑶20人抗體的生產(chǎn)HCo7和KM小鼠利用表達人抗體基因的HCo7和KM小鼠來制備抗⑶20的完整人 單克隆抗體。在KM小鼠系中，如Chen等(1993)EMBO J 12 :811_820所述的對內(nèi)源性的小 鼠κ輕鏈進行同型結(jié)合地裂解并且如PCT公開出版物WO 01/09187的實施例1中所述的對 內(nèi)源性小鼠重鏈基因進行裂解。如Fishwild等(1996)Nature Biotechnologyl4 :845_851 中所述的，這種小鼠系攜帶人κ輕鏈轉(zhuǎn)基因KCo5。如在W002/43478中所述的，這種小鼠系 不攜帶由染色體14片段h CF(SC20)所組成的人重鏈轉(zhuǎn)染色體。HCo7小鼠在其內(nèi)源性輕鏈(κ)基因中具有一個JKD斷裂(如在Chen等(1993) EMBO J. 12 :821-830中所述的)，在其內(nèi)源性重鏈基因中具有一個a CMD斷裂(如在 W001/14424的實施例1中所述的)，一個HCo5人重鏈轉(zhuǎn)基因(如在Fishwild等(1996) Nature Biotechnologyl4 :845_851中所述的)，和一個HCo7人重鏈轉(zhuǎn)基因(如在US5，770，429中所述的)。HGo7和KM小鼠的免疫用人CD20轉(zhuǎn)染的NS/0對HCo7和KM小鼠進行免疫。對 于首次免疫，每只小鼠，IXio7細(xì)胞于150μ1 PBSWl 1混合以完全弗氏佐劑并且進行 腹膜內(nèi)注射(i. P.)。隨后的i.P.免疫利用相似量的無佐劑的細(xì)胞進行。在輸注之前的三 天和兩天對小靜脈內(nèi)加強以0. 5 X IO7懸浮于PBS中的細(xì)胞。通過利用FACS分析，利用人CD20轉(zhuǎn)染的NS/0細(xì)胞以及CD20陰性親本NS/0細(xì)胞 的流式細(xì)胞分析監(jiān)測小鼠血清中抗人CD20抗體的存在。產(chǎn)生抗CD20人單克隆抗體的雜交瘤的制備從HCo7和KM小鼠中分離小鼠脾細(xì) 胞并且基于標(biāo)準(zhǔn)方法以PEG與一種小鼠骨髓瘤細(xì)胞系相融合。隨后通過ELISA對得到的 雜交瘤篩選人IgG，κ生產(chǎn)并且通過FACS分析利用人⑶20轉(zhuǎn)染的NS/0和SKBR3細(xì)胞篩 選⑶20特異性。將來自免疫過的小鼠的脾淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液以50% PEG(Sigma)融 合于四分之一數(shù)目的SP2/0非分泌小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，CRL1581)。以大約IXlO5/孔 將細(xì)胞涂于平底微滴定板上，隨后在選擇性培養(yǎng)基上溫育大約兩周，所述培養(yǎng)基包含10% 胎牛血清、10% P388D1 (ATCC,CRLTIB-63)限制性培養(yǎng)基、3-5%于 DMEM 中的 origen(IGEN) (Mediatech，CRL 10013，具有高葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸鈉)加上5mM HEPES、0. 055mM 2-巰基乙醇、50mg/ml慶大霉素和IXHAT(Sigma，CRL P-7185)。1-2周后，將細(xì)胞培養(yǎng)于 HAT被HT的代替的培養(yǎng)基中。隨后通過流式細(xì)胞分析對單個孔篩選人抗CD20單克隆IgG 抗體。一旦出現(xiàn)廣泛的雜交瘤生長，通過在10-14天后對培養(yǎng)基進行監(jiān)測。對抗體分泌雜 交瘤重新涂布，再次篩選，并且如果依然對人IgG呈陽性，則通過限制性稀釋對抗CD20單克 隆抗體進行亞克隆。隨后在體外培養(yǎng)穩(wěn)定的亞克隆以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生小量的抗體進行 鑒定。從每種雜交瘤中選擇一個保持親本細(xì)胞反應(yīng)性(通過FACS)的克隆。對每個克隆制 成5-10小瓶的細(xì)胞庫并保存于液氮中。結(jié)合CD20的人單克隆抗體的篩選/ 一級篩選為了測定抗體的同種型，進行一種 同種型ELISA。將微滴定板的小孔涂布以1 μ g/ml的小鼠抗人κ輕鏈，50 μ 1/孔于PBS中 4°C溫育過夜。在以5%雞血清封閉之后，將培養(yǎng)板用上清液和純化的同種型對照進行反應(yīng)。 隨后在環(huán)境溫度下將培養(yǎng)板溫育1-2小時。隨后將孔用人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4_特異 性的辣根過氧化物酶結(jié)合的探針進行反應(yīng)。將培養(yǎng)板顯色并且如上所述進行分析。制成了四種雜交瘤細(xì)胞系，三種來自KM小鼠的融合而一種來自HC07小鼠的融合， 表示下列抗體2F2 人單克隆IgGl，κ抗體，具有核苷酸序列SEQ ID NOs :1和3以及氨基酸序 列=SEQ ID NOs 2 和 4。4C9 人單克隆IgGl，κ抗體，具有與2F2 =SEQ ID NOs 2和4完全相同的氨基酸 序列。7D8 人單克隆IgGl，κ抗體，具有核苷酸序列SEQ ID NOs 5和7以及氨基酸序 列=SEQ ID NOs :6和4。11B8 人單克隆IgG3，κ抗體，具有核苷酸序列SEQ ID NOs :9和11以及氨基酸 序列 =SEQ ID NOs 10 和 12。術(shù)語〃 2F2"這里用來表示源自雜交瘤克隆2F2的抗體和源自雜交瘤4C9的抗體。如通過轉(zhuǎn)基因的或轉(zhuǎn)染色體的非人動物所測定的，本發(fā)明的抗體可以轉(zhuǎn)換到其它的同種型，其中所述抗體源自所述非人動物。在本發(fā)明的一個實施方案中，11B8人單克隆 IgG3, κ抗體可以轉(zhuǎn)換為具有完全相同V1^Pt序列的人單克隆IgGl，κ同種型。在另一 個實施方案中，2F2IgGl，κ抗體或7D8IgGl，K抗體可以轉(zhuǎn)換為具有完全相同Vh和\序列 的人單克隆IgG2、IgG4、IgAU IgA2或IgE同種型。實施例2抗⑶20人抗體的抗體測序v1^p vl區(qū)的測序RNA的制備根據(jù)生產(chǎn)商的方法以RNAeasy試劑盒(Qiagen，ffestburg, Leusden， Netherlands)由所有HuMAb CD20雜交瘤細(xì)胞系(2F2，7D8和11B8)的5X IO6細(xì)胞制備總 RNA。2F2和7D8cDNA的制備根據(jù)生產(chǎn)商的方法，利用SMARTRACEcDNA擴增試劑盒 (Clonetech)由 1 μ g 總 RNA 制備 RNA 的 5，-RACE-Ready 互補 DNA(cDNA)。利用有效的HF 2PCR Kit (Clonetech，BD)并且利用下列引物Vk RACE2 5，GCA GGC ACA CAA CAG AGG CAG TTC CAG ATT TC 在 Ck 中退火Vh RACE2 5，GCT GTG CCC CCA GAG GTG CTC TTG GAG G在 Cm 中退火對vh和vl區(qū)進行擴增。11B8 的 cDNA 制備用 AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液(Roche DiagnosticsGmbH, Mannheim, Germany) > oligo d (T) 15(Promega, Ma dison, WI, USA)、dNTP (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)和 RNAsin (Promega)根據(jù)生產(chǎn)商的方法(2000，3 版)由 3 μ g 總 RNA 制 備來自11B8細(xì)胞的RNA的互補DNA(cDNA)。用于擴增Vh和Vl區(qū)進行克隆的PCR引物
所用的引物對
Vh=FRl 5，引物
AB62CAggTKCAgCTggTgCAgTC
AB63SAggTgCAgCTgKTggAgTC
AB65gAggTgCAgCTggTgCAgTC
Ve前導(dǎo)5’引物
AB85ATggACTggACCTggAgCATC
AB86ATggAATTggggCTgAgCTg
AB87ATggAgTTTggRCTgAgCTg
AB88ATgAAACACCTgTggTTCTTC
AB89ATggggTCAACCgCCATCCT
Ve 3’引物
AB90TgCCAgggggAAgACCgATgg
Vk=FRl 5，引物
AB8RACATCCAgATgAYCCAgTC
AB9gYCATCYRgATgACCCAgTC
ABlOgATATTgTgATgACCCAgAC
ABllgAAATTgTgTTgACRCAgtc
AB12gAAATffgTRATgACACAgTC
AB13gAT gTTgTgATgACACAGTC
AB14gAA ATTgTgCTgACTCAgTC
I前導(dǎo)5’引物
AB123CCC gCTCagCTCCTggggCTCCTg
AB124CCC TgCTCAgCTCCTggggCTgC
AB125CCC AgCgCAgCTTCTCTTCCTCCT gC
AB126ATg gAACCATggAAgCCCCAgCAC AgC
V, 3’引物
AB16Cgg gAAgATgAAgACAgATg
其中 K = T 或 G，S = C 或 G，R = AorG,Y =C或T，而W = A或T。
用于擴增Vh和Vl區(qū)以克隆2F2和7D8的PCR條件以HF聚合酶混合物
(Clonetech.)在Tl循環(huán)儀(Biometra，ffestburg)上進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCR 條件94 "C 30 秒 5 個循環(huán)72 "C 1 分鐘94 "C 30 秒70 "C 30 秒 5 個循環(huán)72 "C 1 分鐘94 "C 30 秒68 "C 30 秒 27-30 個循環(huán)72 "C 1 分鐘于擴增Vh和Vl區(qū)以克隆11B8的PCR條件以AmpliTaq聚合酶(Perkin Elmer) 在 Tl 循環(huán)儀(Biometra，Westburg，Leusden，Netherlands)上進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。PCR循環(huán)方案94 "C 2 分鐘11 個循環(huán) 94 °C 30 秒65 V 30秒，每個循環(huán)減1V72 "C 30 秒30 個循環(huán) 94 °C 30 秒55 "C 3O 秒72 "C 30 秒72 "C 10 分鐘冷卻至4°C在pGEMT-載體系統(tǒng)II(2F2，7D8和1188)中克隆Vi^PVl 在瓊脂糖凝膠上分析PCR
^fflQIAEX II Gel Extraction Kit (Qiagen,ffestburg, Leusden, Netherlands) 'Φ 化所述產(chǎn)物。根據(jù)生產(chǎn)商的方法(1999，6版)在pGEMT-載體系統(tǒng)II (Promega)中克隆每 個Vh和\區(qū)的兩種獨立擴增的PCR產(chǎn)物。 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E. coli)JM109中后，利用T7和SP6引物、30個于55°C的退火 循環(huán)通過菌落PCR篩選單個菌落。利用Qiapr印Spinminipr印試劑盒(Qiagen)純化來
53自菌落的質(zhì)粒DNA。為了進一步分析V1^P Vl區(qū)，進行Ncol/Notl(NE Biolabs, ffestburg, Leusden, Netherlands)消化并在瓊脂糖凝膠上進行分析。測序(2F2，7D8和11B8)在pGEMT-載體系統(tǒng)II克隆之后對V區(qū)進行測序。在 Baseclear (Leiden, Netherlands)上進行測序。通過在 V base (www. mrc-cpe. cam. ac. uk/ imt-doc/public/intro. htm). http://www. mrc-cpe. cam. ac. uk/vbase-ok. php ？ menu = 901中比對種系V基因序列對所述序列進行分析。獲得的序列顯示于圖53-58。實施例3在GS-NS/0細(xì)胞系中2F2和11B8的重組生產(chǎn)2F2T 使用引物由標(biāo)準(zhǔn)克隆載體pGem_5Zf (Promega)利用PCR擴增2F2抗體的重 鏈和輕鏈可變區(qū)，所述引物包括優(yōu)選的Kozak序列和合適的限制性位點以克隆在GS恒定區(qū) 載體pCONY If和PCONk (Lonza)中的片段。擴增后，將所述片段進行純化并以限制酶進行消化以進行克隆并連接于兩種載體 中。重鏈可變片段用Hind III和BsiW I消化并且連接入已用Hind III和BsiW I消化并 用堿性磷酸酶去磷酸化的PCON y If載體中。重鏈可變片段用Hind III和Apa I消化并且 連接入已用Hind III和Apa I消化并用堿性磷酸酶去磷酸化的PCON κ載體中。pCON γ lf/ 可變重鏈和PCON κ /可變輕鏈載體分別顯示于圖1和2中。通過菌落PCR檢測轉(zhuǎn)化的大腸 桿菌菌落并且將每個重鏈(HC)和輕鏈(LC)構(gòu)建體的2個陽性菌落進行生長以作質(zhì)粒分 離。對這4個克隆的分離質(zhì)粒進行測序以確定序列。兩個HC克隆和一個LC克隆被發(fā)現(xiàn)具 有正確的序列。將所述兩個HC克隆和一個LC克隆進行組合以給出兩種LC-HC的組合并且在 CH0-K1細(xì)胞進行瞬時共轉(zhuǎn)染以對所述構(gòu)建體檢測正確的2F2抗體生產(chǎn)。在該表達實驗中所 有的組合都達到正常生產(chǎn)的水平并且選擇每個HC和LC構(gòu)建體的一個克隆進行雙基因載體 的構(gòu)建。通過將來自重鏈載體pCON γ If/可變重鏈的完整表達盒連接至輕鏈載體PCON κ / 可變輕鏈中，使用標(biāo)準(zhǔn)克隆方法將HC和LC構(gòu)建體組合于一個命名為pCON y If/ κ 2F2的雙 基因克隆載體中。pCONYlf/κ 2F2載體顯示于圖3中。在CH0-K1細(xì)胞的瞬時轉(zhuǎn)染中再次對該構(gòu)建體進行功能性測試，并且顯示正常的 表達水平。對pCON γ If/ κ 2F2質(zhì)粒的可變區(qū)進行測序以再次確認(rèn)正確的序列。通過用獨特的限制性酶PvuI對pCON Ylf/κ 2F2進行消化來制備線性質(zhì)粒以進行 穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染，所述限制性酶PvuI剪切對于表達非常重要的外側(cè)區(qū)。通過瓊脂糖凝膠電泳確 認(rèn)完全線性化并且將DNA純化并保存于-20°C待用。利用上面的線性DNA質(zhì)粒通過質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化進行六次NS/0宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn) 染后，將細(xì)胞分入96孔板中并進行溫育。加入選擇性培養(yǎng)基(包含10%透析過的胎牛血 清(dFCS)和10 μ M的GS-抑制劑L-甲硫氨酸砜亞胺，但缺少谷氨酰胺)并且檢測培養(yǎng)板 以確定非轉(zhuǎn)染細(xì)胞何時死亡以聚集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。對于有關(guān)GS載體的進一步的細(xì)節(jié)，參見WO 87/04462。產(chǎn)轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)板溫育大約3周以便形成菌落。對得到的菌落進行顯微鏡檢測以 確證這些菌落為適于進行測試的大小(覆蓋超過60%的孔底)，以及在每一孔中只存在一 個菌落。通過IgG，κ-ELISA對來自436個轉(zhuǎn)染瘤的細(xì)胞上清液篩選聚集的抗體。利用這
54種數(shù)據(jù)，選擇111個轉(zhuǎn)化子進行處理并且在靜態(tài)培養(yǎng)物中進行進一步的評估。對選擇細(xì)胞 系的培養(yǎng)物進行傳代并且使之適應(yīng)含有低血清的培養(yǎng)基(包含牛血清白蛋白(BSA)和加入 的dFCS)，并且在靜態(tài)培養(yǎng)物中進行產(chǎn)率的進一步評估(ELISA和百分比匯集的測量)。 選擇65個最高等級的細(xì)胞系進行處理。在含有低血清的培養(yǎng)基(包含牛血清白蛋白(BSA) 和dFCS)中于批量搖瓶懸浮液培養(yǎng)物中進行選擇細(xì)胞系產(chǎn)率的初步評估?；谑斋@抗 體的濃度(通過ELISA)和可接受的生長特性，選擇30個細(xì)胞系利用批量搖瓶懸浮液培養(yǎng) 物在無血清的培養(yǎng)基中作進一步評估。將產(chǎn)生最高抗體濃度的10個細(xì)胞系進一步在無血 清的培養(yǎng)基的重復(fù)添加的批量搖瓶懸浮液培養(yǎng)物中進行評估。根據(jù)公知的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過 蛋白A高效液相色譜(HPLC)測定收獲的產(chǎn)物濃度。如通過蛋白A HPLC測定的，所有的細(xì) 胞系都產(chǎn)生671-1333mg/L的良好產(chǎn)量的2F2抗體(表示為2F2T)。11B8T 以相似的方式如下稍微改進轉(zhuǎn)染過程建立GS-NS/0細(xì)胞系以進行11B8(表 示為11B8T)的重組生產(chǎn)。利用上面的線性DNA質(zhì)粒通過質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化進行四次NS/0宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。 轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞分入96孔板中并進行溫育。對得到的菌落進行顯微鏡檢測以確證這些菌落 為適于進行測試的大小(覆蓋超過60%的孔底)，以及在每一孔中只存在一個菌落之后，通 過IgG，κ-ELISA對來自596個轉(zhuǎn)染瘤的細(xì)胞上清液篩選聚集的抗體。利用這種數(shù)據(jù)，選擇 100個轉(zhuǎn)化子進行處理并且在靜態(tài)培養(yǎng)物中進行進一步的評估。對選擇細(xì)胞系的培養(yǎng)物進 行傳代并且使之適應(yīng)含有低血清的培養(yǎng)基(包含牛血清白蛋白(BSA)和加入的dFCS), 并且在靜態(tài)培養(yǎng)物中進行產(chǎn)率的進一步評估(ELISA和百分比匯集的測量)。選擇60個最 高等級的細(xì)胞系進行處理，并且還對沒有產(chǎn)率數(shù)據(jù)的另外13個細(xì)胞系進行處理。在含有低 血清的培養(yǎng)基(包含牛血清白蛋白(BSA)和dFCS)中于批量搖瓶懸浮液培養(yǎng)物中進行 選擇細(xì)胞系產(chǎn)率的初步評估?；谑斋@抗體的濃度(通過ELISA)和可接受的生長特性，選 擇10個細(xì)胞系進一步在含有低血清的培養(yǎng)基(包含牛血清白蛋白(BSA)和dFCS)的重 復(fù)添加的批量搖瓶懸浮液培養(yǎng)物中進行評估。根據(jù)公知的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過蛋白A高效液相 色譜(HPLC)測定收獲的產(chǎn)物濃度。如通過蛋白A HPLC測定的，得到的9個細(xì)胞系全都產(chǎn) 生354-77mg 1/L的良好產(chǎn)量的11B8抗體(表示為“ 11B8T”)。實施例4源自雜交瘤的2F2和源自轉(zhuǎn)染瘤的重組2F2T的比較通過利用凝膠電泳(SDS-PAGE和天然瓊脂糖凝膠電泳)顯示2F2和2F2T大小相 同，僅在電荷上有稍許差異。而且，如通過利用FACScalibur (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA)的流式 細(xì)胞分析所測量的，2F2和2F2T以相似的親和力與CD20轉(zhuǎn)染的NS/0細(xì)胞和Raji細(xì)胞相 結(jié)合。沒有觀察到結(jié)合于未轉(zhuǎn)染的NS/0細(xì)胞上，這表明2F2和2F2T的特異性。通過流式 細(xì)胞分析(FACScalibur)測量細(xì)胞裂解(PI陽性細(xì)胞的數(shù)目)，2F2和2F2T還與ARH-77細(xì) 胞(IgG血漿細(xì)胞白血病)、Daudi細(xì)胞、DOHH細(xì)胞(源于濾泡中心母細(xì)胞/centrolytic淋 巴瘤、DSMZ的頑固性免疫成纖維B細(xì)胞淋巴瘤Braunschweig，Germany)和Raji細(xì)胞相同 程度地以濃度依賴性的方式誘導(dǎo)CDC。在第二個實驗中，當(dāng)以不同濃度加入血清時，2F2和 2F2T的濃度保持恒定。在2F2和2F2T之間沒有觀察到顯著的差異。最后，結(jié)合細(xì)胞關(guān)聯(lián)的⑶20的2F2和2F2T強烈地和同等程度地結(jié)合補體因子。利 用熒光素結(jié)合的抗Clq多克隆抗體在Daudi細(xì)胞、DOHH細(xì)胞和Raji細(xì)胞中進行所述實驗以檢測Clq的結(jié)合。實施例5抗⑶20的人抗體的結(jié)合特性結(jié)合不同細(xì)胞系將用人CD20轉(zhuǎn)染的NS/0、NS/0，Daudi和Raji細(xì)胞以含有人抗 體2F2、7D8和11B8的培養(yǎng)物上清液于4°C溫育30分鐘，隨后與結(jié)合FITC的抗人IgG Ab 一 起溫育。通過利用FACScalibur流式細(xì)胞儀進行流式細(xì)胞分析來評估結(jié)合。將熒光強度與 陰性對照同種型匹配樣品相比較。如圖4中所示，三種抗體都結(jié)合以人CD20轉(zhuǎn)染的NS/0 細(xì)胞，但是對于親本的未轉(zhuǎn)染NS/0細(xì)胞則沒有觀察到結(jié)合。三種抗體也都結(jié)合兩種不同的 Burkitt淋巴瘤B細(xì)胞系(Raji和Daudi)，這表明2F2、7D8和11B8是CD20特異性的。在 非飽和的條件下測試包含7D8或11B8的上清液，所以，觀察到與2F2相比較低的熒光強度。通過流式細(xì)胞分析測定的2F2的EC5tl值為了測定2F2對表達于人B細(xì)胞上的 CD20的顯而易見的親和力，利用來自三個人供體的分離的PBMCs和CD3陰性細(xì)胞的選通，制 作了 2F2的結(jié)合曲線。將分離的PBMCs與一個濃度范圍的FIFC標(biāo)記的2F2 —起溫育1小 時，并且對于FACS和平均熒光強度(MFI)進行測定。MFI值顯示于圖5A和5B中作為抗體 濃度的功能。通過非線性回歸利用Graph Pad Prism3. 02計算EC5tl值。人2F2的EC5tl值對 于三個供體來說都是相似的，平均值(士 s. e.m.)為287 士 12. 7ng/ml(1.9 士 0. InM) 0125I 標(biāo)記的 mAbs 結(jié)合表達 CD20 的細(xì)胞利用 Iodobeads (PierceChemical Co.， Rockford, IL)對mAbs進行碘化。將125I標(biāo)記的mAbs進行連續(xù)稀釋并且在疊氮化鈉和 2-去氧葡糖存在時與Ramos-EHRB細(xì)胞于37°C下溫育2小時以防止胞飲作用。隨后通過 于14，000 X g離心2分鐘通過苯二甲酸鹽油的混合物以分離結(jié)合細(xì)胞和游離的125I標(biāo)記 的mAbs，允許快速分離而不干擾結(jié)合平衡。隨后利用Y計數(shù)儀(Wallac UKLtd, Milton Keynes, UK)對沉淀的細(xì)胞和結(jié)合抗體一起進行計數(shù)。如圖6中所示，2F2和11B8顯示相似的KD (或相似的飽和點)，這顯示兩種抗體都 以相似的親和力進行結(jié)合。不過，11B8比2F2在一個較低的水平飽和，這顯示它識別不同形 式的⑶20。這還與一個進一步的實驗一致，所述實驗顯示相類數(shù)目的2F2和利妥?，斂贵w 分子結(jié)合Ramos-EHRB細(xì)胞和Daudi細(xì)胞上的⑶20，如由結(jié)合飽和的相似水平所顯示的(大 約2-3X IO5抗體分子/細(xì)胞)。相反地，11B8和Bi，在該水平的一半處飽和并且僅有大約 1-2 X IO5抗體分子結(jié)合到Ramos-EHRB細(xì)胞(圖7A)禾Π Daudi細(xì)胞(圖7Β)。為了排除碘化抗體通過Fc受體結(jié)合的可能性，通過利用抗CD20F(ab’)2片段確定 結(jié)合曲線。再一次，相似數(shù)目的2F2和利妥希瑪_F(ab’)2片段結(jié)合到Ramos-EHRB和Daudi 細(xì)胞上。也是在這些實驗中，結(jié)合到Ramos-EHRB和Daudi細(xì)胞上的2F2或利妥希瑪抗體分 子在結(jié)合在所述細(xì)胞上的11B8和Bl分子的大約兩倍處飽和。解離速率為了測定mAbs的解離速率，將Ramos-EHRB細(xì)胞(在疊氮化物/2D0G存 在的情況下于Iml的終體積)與2 μ g/ml的125I mAbs 一起于37°C溫育2小時以實現(xiàn)最大 結(jié)合。在微離心管中離心后(2000rpm 2分鐘)，去除上清液，將沉淀迅速在Iml培養(yǎng)基中重 懸，立即轉(zhuǎn)移到37°C的于15ml錐形管中的9ml培養(yǎng)基中。在隨后的2小時于不同的時間， 取0. 4ml樣品并且在苯二甲酸鹽油上分離以測定在細(xì)胞表面剩余的放射性標(biāo)記的mAbs的 水平。如圖8中所示，2F2和11B8都比利妥?，敾駼l顯著更加緩慢地從⑶20上解離下來?？笴D20F(ab)2片段的解離速率分別用2 μ g/ml 2F2U1B8和利妥?，?shù)?25I標(biāo) 記的F(ab)2片段對Ramos-EHBR細(xì)胞進行飽和化。洗滌所述Ramos-EHBR細(xì)胞并在高濃度未標(biāo)記抗體的存在下進行溫育。對Ramos-EHRB細(xì)胞的最大(起始)結(jié)合設(shè)定于100%。在 上樣之后的3小時中的幾個時間點，取0. 4ml樣品并且在苯二甲酸鹽油上分離以測定在細(xì) 胞表面剩余的放射性標(biāo)記的mAbs的水平。由圖9可見，2F2和11B8比利妥?，斅枚嗟?從⑶20上解離下來。在90分鐘時，大約50%的F(ab)2利妥希瑪分子結(jié)合到細(xì)胞上，而半 數(shù)的F(ab)22F2分子在3小時后解離。2F2、11B8T和利妥?，敺肿拥膋d(k。ff)值計算如下F(ab)22F2 :kd = In2/t1/2 (sec) = In 2/10800 (sec) = 6. 4 X KT5SecT1F(ab)2llB8T :kd = In2/t1/2 (sec) = In 2/9000 (sec) = 7. 7 X KT5SecT1 (&13)2利妥?，攌d = In2/t1/2(sec) = In 2/5400 (sec) = 1. 3X10_4sec_1抗⑶20mAb功能關(guān)閉速率在功能性⑶C測試中評估與利妥希瑪相比緩慢的2F2 解離速率的影響。之后，將Daudi或SU-DHL4細(xì)胞以10 μ g/ml抗⑶20mAb或一種同種型對 照抗體預(yù)溫育，洗滌并在培養(yǎng)基中溫育不同的時間是。在測試開始后的這些時間點，將樣品 與補體一起進行溫育(正常的人血清20vol/vol% )并且隨后在37°C再溫育45分鐘。隨 后，通過利用PI (碘化丙錠)染色法在FACS上測定細(xì)胞裂解。裂解細(xì)胞(PI陽性細(xì)胞)的 百分比顯示于圖IOA(Daudi細(xì)胞)或圖10B(SU-DHL4細(xì)胞)中作為溫育時間的功能。2F2 在兩種細(xì)胞系中都誘導(dǎo)高度CDC，并且在6小時之后仍裂解多達90%的細(xì)胞，提示這些細(xì)胞 的CDC飽和保持得足夠高以誘導(dǎo)大多數(shù)細(xì)胞的補體介導(dǎo)的解離。相反地，利妥?，斉c上面 的解離速率研究一致，從細(xì)胞上快速解離并且在6小時的溫育期后不能誘導(dǎo)特異性裂解。 11B8被用作對照并且不誘導(dǎo)⑶C。實施例6抗⑶20的人抗體的⑶C血清制備通過將來自健康志愿者的血液引入已在室溫放置30-60分鐘的 autos印膠和凝結(jié)活化劑vacutainer管(BD biosciences,Rutherford,NJ)中來制備用于 補體裂解的血清，隨后于3000rpm離心5分鐘。收集血清并保存于-80°C。流式細(xì)胞分析使用FACScalibur流式細(xì)胞儀以CellQuest pro軟件(BD Biosciences, Mountain view, CA)進行流式細(xì)胞分析。收集至少5000次事件以細(xì)胞碎屑 進行分析，包括調(diào)節(jié)前側(cè)向分散(forwardsideward scatter) (FCS)閾值。⑶C動力學(xué)在第一組實驗(η = 3)中，在加入人血清之前的10分鐘，通過加 Λ 10 μ g/ml的2F2、利妥?，敽虸gG對照抗體分別測定五種不同B細(xì)胞系，即，Daudi、 SU-DHL-4、Raji, DOHH和ARH-77的動力學(xué)。在CDC誘導(dǎo)之后的7個時間間隔(高達1小 時)，將所述細(xì)胞重懸于PI溶液中并且通過流式細(xì)胞分析測量細(xì)胞裂解(PI陽性細(xì)胞的數(shù) 目)。結(jié)果顯示于圖 IlA(ARH-77 細(xì)胞)，IlB(Daudi 細(xì)胞)，llC(Raji 細(xì)胞)，IlD(DOHH)和 llE(SU-DHL-4)中。如所見，加入抗體在5分鐘之內(nèi)誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。有趣的是，加入2F2導(dǎo) 致所有五個B細(xì)胞系中超過80%的標(biāo)記細(xì)胞的裂解。利妥?，攦H在SU-DHL-4和Daudi細(xì) 胞系中誘導(dǎo)超過80%的細(xì)胞裂解，而DOHH細(xì)胞系的細(xì)胞裂解為 50%，并且在ARH-77和 Raji細(xì)胞系中小于20%。用IgG對照抗體沒有觀察到裂解(數(shù)據(jù)僅顯示于圖IlB中)。⑶C血清滴定在一組獨立的實驗中(η = 5)，于兩種不同的抗體濃度0. 5 μ g/ml 和5 μ g/ml對NHS (正常人血清)進行滴定。在加入一個濃度范圍的NHS之前，用2F2或利 妥希瑪對細(xì)胞進行預(yù)溫育10分鐘。在⑶C誘導(dǎo)后的45分鐘，將細(xì)胞重懸于PI溶液中。通 過流式細(xì)胞分析測量細(xì)胞裂解(PI陽性細(xì)胞的數(shù)目)。圖12A-D顯示裂解細(xì)胞(PI陽性細(xì) 胞的數(shù)目)的百分比作為NHS濃度的功能。圖12A顯示Daudi細(xì)胞的細(xì)胞裂解，圖12B顯示ARH-77細(xì)胞的細(xì)胞裂解，圖12C顯示DOHH細(xì)胞的細(xì)胞裂解，而圖12D顯示Raji細(xì)胞的 細(xì)胞裂解。用提高的NHS濃度觀察到增強的細(xì)胞裂解。加入2F2于最高的NHS和抗體濃度 引發(fā)Dau di細(xì)胞的最大裂解。利妥?，斢谧罡叩腘HS濃度誘導(dǎo)大約50%的Daudi細(xì)胞的 細(xì)胞裂解。在ARH-77細(xì)胞中，只有最高濃度的NHS和2F2導(dǎo)致大約75%的細(xì)胞裂解。較低的 抗體濃度不足以誘導(dǎo)ARH-77細(xì)胞裂解。利妥?，斣谠搶嶒炛胁荒苷T導(dǎo)誘導(dǎo)ARH-77細(xì)胞的 細(xì)胞裂解。2F2能夠于高濃度和低濃度下誘導(dǎo)DOHH細(xì)胞的NHS濃度依賴性細(xì)胞裂解，而利妥 ?，攧t不能在這些條件下誘導(dǎo)裂解。最后，2F2誘導(dǎo)Raji細(xì)胞的NHS濃度依賴性細(xì)胞裂解，只有通過利用5 μ g/ml的 mAb它才是明顯的。用利妥希瑪沒有觀察到裂解。在這些實施方案中，用同種型對照抗體(數(shù)據(jù)未顯示)沒有觀察到裂解。CDC抗體滴定為了測量抗CD20抗體在低濃度誘導(dǎo)CDC的能力，進行滴定抗體的 實驗(n = 6)。在加入NHS之前，用一個濃度范圍的2F2或利妥?，敺謩e對各種細(xì)胞系進行 預(yù)溫育10分鐘。在37°C溫育45分鐘之后(最大裂解發(fā)生之時)，將細(xì)胞重懸于PI溶液中并 且通過流式細(xì)胞分析測量細(xì)胞裂解(PI陽性細(xì)胞的數(shù)目)。圖13A (Daudi細(xì)胞)，13B(D0HH 細(xì)胞)，13C(ARH-77細(xì)胞)和13D(Raji細(xì)胞)顯示裂解(PI陽性的)細(xì)胞的百分比作為 抗體濃度的功能。2F2和利妥?，敹颊T導(dǎo)細(xì)胞裂解的溫度依賴性的增強。加入2 μ g/ml的 2F2誘導(dǎo)Daudi細(xì)胞的超過80%的裂解，而用利妥?，敿词乖诩尤?0 μ g/ml之后也沒有達 到這一水平。另外，2F2于0. 4 μ g/ml誘導(dǎo)DOHH細(xì)胞的超過80%的裂解，而用利妥?，斢?該濃度只觀察到極微的裂解。用利妥?，斢?0 μ g/ml達到DOHH細(xì)胞的最大裂解(全部分 析細(xì)胞的 30% )。由2F2進行的ARH-77和Raji細(xì)胞裂解的誘導(dǎo)更低，但于10 μ g/ml的 抗體濃度仍達到70%的裂解。在其最高濃度上，利妥?，攦H在 23%的ARH-77細(xì)胞中和 僅在 6%的Raji細(xì)胞中誘導(dǎo)裂解。在一個相似的實驗中，研究2F2、2F2T、11B8T和利妥?，?shù)恼T導(dǎo)Daudi和Raji細(xì) 胞系的CDC的能力，參見圖14A和14B。在該實驗中還觀察到以(源于轉(zhuǎn)染瘤的)2F2T于 10 μ g/ml進行的Daudi細(xì)胞的80%的裂解，而利妥?，敿词褂?0 μ g/ml也只達到60%的 裂解，見圖14A。用2F2T進行的Daudi細(xì)胞裂解與用源于雜交瘤的2F2所獲得的裂解相同。Raji細(xì)胞的裂解更加困難，但是2F2和2F2T再次在相似的程度上誘導(dǎo)Raji細(xì)胞 的裂解(圖14B)。利妥?，敳荒苷T導(dǎo)Raji細(xì)胞的⑶C，這與圖13D中所示的實驗一致。由圖14A和14B可見，Daudi和Raji細(xì)胞都不對11B8T的CDC敏感。Bl誘導(dǎo)Daudi 的裂解，但是程度很小，并且不能誘導(dǎo)Raji細(xì)胞的裂解。在Daudi細(xì)胞中抗CD20的CDC活性為了測定每種抗體的CDC活性，利用碘化丙 錠(PI)染色的細(xì)胞的分析評估提高的膜通透性。簡言之，將Daudi細(xì)胞洗滌并以IXlO6細(xì) 胞/ml重懸于RPMI/1 % BSA。向Daudi細(xì)胞中加入各種濃度的人單克隆抗體并且于室溫使 其結(jié)合到細(xì)胞上的⑶20 10-15分鐘。隨后，將血清作為一種補體來源加入至終濃度20% (ν/ν)并將混合物于37°C溫育45分鐘。隨后將細(xì)胞保持于4°C直至分析。隨后將每種樣品 (150 μ 1)加至于FACS管中的10 μ 1 PI溶液(10pg/ml于PBS中)中。立即通過流式細(xì)胞 分析對混合物進行評估。如圖15A中所示，2F2和7D8與利妥?，斚啾蕊@示較高⑶C活性。
在第二種實驗中，用如上的人單克隆抗體來標(biāo)記所述細(xì)胞，隨后在加入人血清之 前進行洗滌并在PBS中于37°C溫育45分鐘。這確保了在加入血清時只有結(jié)合細(xì)胞的抗體 可激活補體進行細(xì)胞裂解。如圖15B中所示，與2F2和7D8相比發(fā)現(xiàn)對于利妥希瑪?shù)慕档?的CDC活性，這顯示人抗體(2F2和7D8)并不被在加入血清之前洗滌細(xì)胞所影響。在Raji細(xì)胞中的抗CD20的CDC活性利用Raji細(xì)胞來評估CDC活性，所述Raji 細(xì)胞具有⑶55和⑶59的相對高的表面表達，并且因此更加耐受補體攻擊。將人抗體加至 Raji細(xì)胞并且讓其結(jié)合15分鐘。加入人血清(20% )并且將混合物于37°C溫育45分鐘。 如圖16A中所示，利妥?，攲τ诮閷?dǎo)Raji細(xì)胞的⑶C是無效的，而用2F2或7D8處理的Raji 細(xì)胞中則發(fā)生顯著水平的細(xì)胞裂解。因此，2F2和7D8具有裂解⑶55/59陽性靶細(xì)胞的獨特 能力。在一個單獨的實驗中，將Raji細(xì)胞與飽和濃度的抗⑶55mAb (終濃度5 μ g/ml)和 抗⑶59mAb(終濃度5yg/ml) —起進行預(yù)溫育以阻抑這些補體防御分子的效應(yīng)。隨后將人 抗⑶20抗體與如上的血清(20% ) 一起加入于37°C持續(xù)45分鐘。如圖16B中所示，⑶55 和CD59的封閉作用導(dǎo)致使用人抗體2F2或7D8的Raji細(xì)胞的幾乎100%的裂解，而使用利 妥?，斨挥^察到細(xì)胞裂解的25%的增長。補體抑制劑I的作用-表面分子的表達由于補體抑制劑如⑶55和⑶59好像在 對于利妥希瑪誘導(dǎo)的⑶C中發(fā)揮重要作用，所以進行一種實驗以測定這些分子在所研究的 B 細(xì)胞系上的表達，(Raji, Daudi, DOHH, ARH-77 和 SU-DHL-4)。用結(jié)合FITC的抗⑶55、抗⑶59和抗⑶20抗體對細(xì)胞染色并且通過流式細(xì)胞分析 術(shù)來分析分子表達。結(jié)果示于下表1中。表 1 補體抑制劑I的作用-⑶55和⑶59的封閉作用為了進一步研究⑶55和⑶59 在抗CD20誘導(dǎo)的CDC中的作用，在誘導(dǎo)CDC之前通過特異性抗體對兩種補體抑制劑分 子進行封閉(η = 3)。使用Raji細(xì)胞，因為單獨的2F2只誘發(fā)部分裂解。在加入集取的 NHS (20% )之前，將Raji細(xì)胞(1 X IO5細(xì)胞/50 μ 1)與一個濃度范圍的2F2和利妥希瑪以 及抗⑶55 (5 μ g/ml)或抗⑶59 (5 μ g/ml) 一起進行預(yù)溫育10分鐘。在⑶C誘導(dǎo)之后的45 分鐘，將細(xì)胞重懸于PI溶液中。通過流式細(xì)胞分析測量細(xì)胞裂解(PI陽性細(xì)胞的數(shù)目)。圖17A-C顯示裂解(PI陽性)細(xì)胞的百分比作為抗體濃度的功能，并且顯示一種實驗，它是 三種實驗的示例。圖17A顯示Raji細(xì)胞與抗⑶55抗體一起進行的溫育，圖17B顯示顯示 Raji細(xì)胞與抗⑶59抗體一起進行的溫育，而圖17C顯示顯示Raji細(xì)胞與抗⑶55和抗⑶59 抗體一起進行的溫育。如圖17A中所能見到的，加入抗⑶55并不影響2F2或利妥?，斦T導(dǎo)的⑶C。加入 抗⑶59抗體提高所述細(xì)胞對2F2和利妥?，?shù)拿舾行约s30% (圖17B)。加入抗⑶55和 抗⑶59抗體進一步增強抗⑶20誘導(dǎo)的裂解約30% (圖17C)。如流式細(xì)胞分析所測定的補體因子的作用I-Clq結(jié)合將抗CD20抗體(2F2和利 妥希瑪)和一種同種型對照抗體加至各種B細(xì)胞系中。10分鐘的溫育之后，加入NHS(lvol/ vol%)0進一步于37°C溫育10分鐘并且洗滌所述細(xì)胞之后，棄去上清液并將細(xì)胞沉淀物 與結(jié)合FITC的抗Clq抗體一起進行溫育。數(shù)據(jù)顯示以Clq染色的細(xì)胞的平均熒光強度并 顯示于圖 18A(Daudi)，18B(ARH-77)，18C(DOHH)，禾口 18D (Raji) (η = 6)中。結(jié)果提示 2F2 結(jié)合Clq的抗體濃度依賴性增長與所研究的B細(xì)胞系無關(guān)。而且，在所有的測試細(xì)胞系中， 2F2的Clq結(jié)合通常比利妥?，?shù)慕Y(jié)合更高。用同種型對照抗體(數(shù)據(jù)未顯示)沒有觀察 到平均熒光的增強。如流式細(xì)胞分析II所測定的補體因子的作用_通過傳統(tǒng)途徑的補體激活C4c固 定于抗體包被的細(xì)胞上是通過傳統(tǒng)途徑激活補體的指征。將抗⑶20抗體(2F2和利妥希 瑪)和一種同種型對照抗體加至各種B細(xì)胞系中。37°C溫育10分鐘之后，加入NHS(lvol/ vol%)0在進一步溫育并且洗滌所述細(xì)胞之后，棄去上清液并將細(xì)胞沉淀物與結(jié)合FITC 的抗C4c抗體一起進行溫育。數(shù)據(jù)顯示以C4c染色的細(xì)胞的平均熒光強度并顯示于圖 19A (Daudi)，19B (ARH-77)，19C (DOHH)，禾口 19D (Raji) (η = 6)中。在全部測試的 B 細(xì)胞系中 (η = 3)闡明補體因子C4c對2F2的固定，最大達到約1 μ g/ml的抗體。在2F2結(jié)合之后的 固定遠大于在利妥?，斀Y(jié)合之后的固定，與測試的細(xì)胞系無關(guān)。用同種型對照抗體(數(shù)據(jù) 未顯示)沒有觀察到平均熒光的增強。熱滅活血清中的CDC 在加入NHS (有活性的或在57°C熱滅活30分鐘的)之前，將 細(xì)胞(Daudi細(xì)胞、ARH-77細(xì)胞或Raji細(xì)胞)和抗體(利妥?，?、2F2、2F2T、11B8和同種型 抗體HuMab-KLH IgGl)以一個濃度范圍的抗⑶20抗體進行預(yù)溫育10分鐘。。在⑶C誘導(dǎo) 之后的45分鐘，將細(xì)胞重懸于PI溶液中。通過流式細(xì)胞分析測量細(xì)胞裂解(PI陽性細(xì)胞 的數(shù)目)。在熱滅活的血清存在時沒有觀察到細(xì)胞的裂解，無所用細(xì)胞系和CD20抗體無關(guān)， 在熱滅活的血清存在時沒有觀察到CDC。實施例7抗CD20的人抗體的ADCC ADCC測試I人嗜中性細(xì)胞的富集從加肝素的全血中富集多形核細(xì)胞(嗜中性細(xì)胞，PMNs)。 將血液在 RPMI 1640 中稀釋兩次并且在 Fico “ (Lymphocyte Separation Medium 1077g/ ml，710g，RT，20 分鐘；Bioffhittaker, cat. 17-829E，lot no. 014832)上分層并且于 2000rpm 離心20min。去除單核細(xì)胞層，利用冰冷的NH4Cl溶液(155mMNH4Cl, IOmM NaHCO3,0. ImM EDTA，pH 7.4)將包含嗜中性細(xì)胞的沉淀物中的紅細(xì)胞低滲裂解。將剩下的嗜中性細(xì)胞洗 滌兩次并在添加了 10% FCS(RPMI-IO)的RPMI 1640中重懸。人外周血單核細(xì)胞的富集將人血在RPMI 1640中稀釋兩次并將血細(xì)胞于 Ficoll (Lymphocyte Separation Medium 1077g/ml，710g，RT，20 分鐘；BioWhittaker，Cambrex Bio Science Verviers, Verviers, Belgium, cat. 17-829E, lot no. 0148 32)上 進行分層。從中間相中收集外周血單核細(xì)胞(MNCs)，進行洗滌并在添加了 10%FCS、2mM L-谷氨酰胺、5U/ml青霉素、50pg/ml鏈霉素(全部來自BioWhittaker)和加入了 25mM HEPES(Bioffhittaker)的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中進行重懸。ADCC 設(shè)定用 20 μ Ci51Cr (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)標(biāo)記靴 B 細(xì) 胞(新分離的B細(xì)胞或來自B細(xì)胞系)2小時。在RPMI-IO中充分洗滌后，將細(xì)胞調(diào)節(jié)到 IX IO5細(xì)胞/ml。將全血或分離的效應(yīng)細(xì)胞(50 μ 1 ；MNCs，PMNs)或血漿(50 μ 1)、致敏抗體 (50 μ 1)和 RPMI-IO (50 μ 1)加到圓底微量滴定板(Greiner Bio-OneGmbH, Frickenhausen, Germany)上。通過加入靶細(xì)胞(50 μ 1)至終體積200 μ 1來開始測試。對于分離的效應(yīng)細(xì) 胞，使用一種靶(Ε Τ)比率為40 1的效應(yīng)細(xì)胞。對于全血，相應(yīng)于一種靶比率為40 1 的評估的效應(yīng)細(xì)胞使用33V01/V01%的量。溫育后(3小時，37°C)，通過離心停止測試，并 且在閃爍計數(shù)器中以每分鐘計數(shù)(cpm)來測量從三份樣品中釋放出來的51Cr。利用下列公 式來計算細(xì)胞毒性的百分比%特異性裂解=(實驗cpm-基本cpm) / (最大cpm-基本cpm) X 100通過向靶細(xì)胞中加入高氯酸(3%終濃度)測定最大的51Cr釋放，在致敏抗體和效 應(yīng)細(xì)胞不存在時測量基本釋放量。統(tǒng)計通過單向AN0VA，隨后通過Tukey’ s多重比較post-hoc測試來分析數(shù)據(jù)。 利用 Graph Pad Prism (version 3. 02for Windows, Graph Pad Software, San Diego, CA, USA)進行分析。ARH-77細(xì)胞的裂解在第一組實驗中，將ARH-77細(xì)胞用作靶細(xì)胞(圖20)。加入 2F2(n = 3)、利妥?，?η = 3)或11Β8Τ(η = 1)導(dǎo)致大約50%的ARH-77細(xì)胞的MNC介導(dǎo)的 裂解。在嗜中性細(xì)胞存在時沒有觀察到特異性的裂解。在與2F2—起溫育后加入血漿(為 了評估補體的作用)誘導(dǎo)ARH-77細(xì)胞的裂解，但在與利妥?，?p<0. 05，2F2對無抗體， AN0VA)或11B8T—起溫育后則不然。在全血存在的情況下，在與2F2—起溫育后ARH-77細(xì) 胞的裂解增強(p<0.05，2F2vs.利妥?，敽?F2vs.無抗體，AN0VA)，但在與利妥?，斠黄?溫育后則不然。由利妥?，斦T導(dǎo)的特異性裂解事實上在全血存在的情況下非常低。11B8T 在全血存在的情況下誘導(dǎo)大約25% (η = 1)的細(xì)胞裂解。在抗體不存在時，觀察到10-15% 的非特異性裂解。B-CLL細(xì)胞的裂解在第二組實驗中，將從B-CLL患者(η = 12)中獲得的B淋巴細(xì) 胞白血病(B-CLL)亞克隆5輪并且隨后在實驗中用作靶細(xì)胞(圖21)。在抗體不存在時，沒 有觀察到特異性的裂解，但是加入2F2、11B8T或利妥?，?10yg/ml)將MNC介導(dǎo)的特異性 裂解提高到10-20% (ρ < 0. 00LAN0VA)。靶細(xì)胞與血漿和2F2 —起溫育誘導(dǎo)BCLL細(xì)胞的 特異性裂解，而用11B8T或利妥?，?ρ < 0. 00LAN0VA)則沒有觀察到特異性裂解。而且， 2F2在于全血中溫育之后介導(dǎo)B-CLL細(xì)胞的特異性裂解。用11Β8Τ(ρ < 0. 0LAN0VA)或利 妥希瑪(p<0.001，AN0VA)沒有觀察到全血的B-CLL細(xì)胞的特異性裂解。在嗜中性細(xì)胞存 在的情況下沒有觀察到特異性裂解。由于利妥?，斈軌蚪閷?dǎo)有效的ADCC但不能介導(dǎo)測試腫瘤細(xì)胞的CDC，由2F2進行 的全血誘導(dǎo)的B細(xì)胞裂解有可能是通過補體介導(dǎo)的。毛細(xì)胞白血病(HCL)細(xì)胞的裂解在第三組實驗中測定通過ADCC或在血漿或全血存在時由2F2、11B8T和利妥希瑪進行的HCL細(xì)胞裂解。數(shù)據(jù)顯示于圖22中。盡管嗜中性 細(xì)胞不能介導(dǎo)與所用mAb不相關(guān)的ADCCJS 11B8T能夠比2F2 (ρ < 0. 00LAN0VA)或利妥希 瑪(ρ < 0. 05，AN0VA)更有效地誘導(dǎo)MNC介導(dǎo)的HCL細(xì)胞裂解。2F2和利妥希瑪不能誘導(dǎo) MNC介導(dǎo)的HCL細(xì)胞裂解。與利妥?，?ρ < 0. 05，AN0VA)、11Β8Τ(ρ < 0. 01，AN0VA)或無 抗體(ρ < 0. 001，AN0VA)相比，用2F2強烈地增強血漿介導(dǎo)的細(xì)胞裂解。在全血存在的情 況下研究抗⑶20誘導(dǎo)的裂解時，2F2誘導(dǎo)細(xì)胞的完全裂解，比利妥?，?ρ < 0. 01，AN0VA)、 11Β8Τ或無抗體加入(ρ < 0. 001，AN0VA)程度更高。B-ALL細(xì)胞的裂解利用來自兩位患者的細(xì)胞研究2F2和利妥?，斖ㄟ^ADCC或補 體誘導(dǎo)B-ALL細(xì)胞的能力(圖23)。如在之前的實驗中所觀察的，2F2和利妥?，斠韵嗨频?程度誘導(dǎo)B-ALL細(xì)胞的MNC介導(dǎo)的ADCC。但是2F2還能夠誘導(dǎo)B-ALL細(xì)胞的血漿和全血介 導(dǎo)的裂解，而利妥?，攧t不能。濾泡淋巴瘤細(xì)胞的裂解當(dāng)研究濾泡淋巴瘤細(xì)胞(η = 2)的裂解時，出現(xiàn)了一種不 同的畫面(圖24)。用2F2觀察到較小的PMN介導(dǎo)的細(xì)胞裂解，而2F2和利妥?，敹疾荒苷T 導(dǎo)MNC介導(dǎo)的ADCC。11Β8Τ仍然能夠誘導(dǎo)大約20%的MNC介導(dǎo)的裂解。盡管利妥希瑪誘導(dǎo) 相對高的血漿介導(dǎo)的裂解，但用2F2觀察到完全的血漿介導(dǎo)的裂解。還是用全血，以2F2觀 察到完全的裂解，而用血漿介導(dǎo)的裂解觀察到70%的裂解。用11Β8Τ觀察到極小的血漿或 全血介導(dǎo)的裂解。原發(fā)性套細(xì)胞淋巴瘤的裂解套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的特異性裂解更加難以誘導(dǎo)(η =1，圖25)。用2F2U1B8T或利妥?，斣诩尤隤MN或MNC和CD20mAbs之后觀察到極小的 或觀察不到裂解。不過，2F2仍然能夠誘導(dǎo)40%的通過血漿或全血進行的裂解，而用利妥希 瑪只有10-20%的細(xì)胞被裂解。11B8T不能夠誘導(dǎo)初級套細(xì)胞淋巴瘤的裂解。在全血中ARH-77細(xì)胞的抗體濃度依賴性裂解在進一步的實驗中(η = 4)分析了 有關(guān)在全血存在時ARH-77細(xì)胞上的ADCC的誘導(dǎo)的劑量依賴性。如圖26中所能見到的，2F2 的滴定誘發(fā)了 ARH-77細(xì)胞的特異性裂解百分比的劑量依賴性的增長(ρ < 0. 05 治療-效 果，雙向AN0VA)。用利妥希瑪沒有觀察到ARH-77細(xì)胞的特異性裂解。ADCC 測試 II制備51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞將ARH-77細(xì)胞和Raji細(xì)胞收集(3Χ IO6細(xì)胞)于RPMI++ 中，離心下去(1500印111;5分鐘)，重懸于140口 1 的51Cr(Chromium-51 ；CJSll-lmCi，批量 12 ； 140 μ 1約為100 μ Ci)并且進行溫育(37°C水??；1小時)。洗滌細(xì)胞之后(1500rpm，5分 鐘，于PBS中，3 X)，將細(xì)胞重懸于RPMI++并通過錐蟲藍排除法計數(shù)。將細(xì)胞調(diào)整為2 X IO4 細(xì)胞/ml的濃度。效應(yīng)細(xì)胞的制備通過生產(chǎn)商的說明書用Ficoll (Bio Whittaker ；淋巴細(xì)胞分離 培養(yǎng)基，cat 17-829E)從40ml的肝素血中分離新鮮的外周血單核細(xì)胞。在將細(xì)胞于RPMI++ 中重懸之后，通過錐蟲藍排除法計數(shù)細(xì)胞并且調(diào)整為2X IO6細(xì)胞/ml的濃度。ADCC設(shè)定將50 μ 1 RPMI++滴定于96孔板中，加入50 μ 1的51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞。 隨后，加入50 μ 1的抗體，稀釋于RPMI++中(終濃度10,1,0. 1,0. 01μ g/ml)。溫育細(xì)胞(RT， 10分鐘)，加入50 μ 1效應(yīng)細(xì)胞，產(chǎn)生50 1的效應(yīng)子對靶的比率(為了進行最大裂解的 測定，加入50μ1 5%的Triton-X-100而非效應(yīng)細(xì)胞)。將細(xì)胞離心(500rpm，5分鐘)，溫 育(37°C，5% C02，4小時)。細(xì)胞離心之后(1500rpm，5分鐘)，將100μ 1的上清液收集至
62微電子管中，并且在Y計數(shù)儀中進行計數(shù)。百分比特異性裂解計算如下%特異性裂解=(cpm樣品-cpm僅靶細(xì)胞)/(cpm最大裂解-cpm僅靶細(xì)胞)XlOO統(tǒng)計通過單向AN0VA，隨后通過Tukey’ s多重比較post-hoc測試來分析數(shù)據(jù)。 利用 Graph Pad Prism (version 3. 02 for Windows, Graph Pad Software, San Diego, CA, USA)進行分析。ARH-77和Raji細(xì)胞的抗體濃度依賴性裂解對2F2T和11B8T測試其與利妥希瑪 相比誘導(dǎo)ARH-77和Raji細(xì)胞(η = 3)的ADCC的能力。利用MNC作為效應(yīng)細(xì)胞在ARH-77細(xì)胞的ADCC中觀察⑶20mAbs的劑量-效應(yīng)關(guān) 系。2F2T和11B8T都誘導(dǎo)ARH-77細(xì)胞的特異性裂解，所述裂解于10 μ g/ml的mAbs上為最 大(50%)。利妥?，攦H誘導(dǎo)靶細(xì)胞25%的裂解。加入同種型對照抗體(HuMab-KLH)并不 誘發(fā)ADCC。不加入MNCs觀察不到特異性裂解(數(shù)據(jù)未顯示)。當(dāng)Rajj細(xì)胞被用作靶細(xì)胞時，出現(xiàn)了與ARH-77細(xì)胞相似的圖像(圖28)。2F2T和 11B8T都誘導(dǎo)MNC介導(dǎo)的Raji細(xì)胞裂解，雖然2F2T于低濃度下好像比11B8T更加有效。用 2F2T和11B8T達到的最大裂解大約為35%。利妥?，斦T導(dǎo)MNC介導(dǎo)的Raji細(xì)胞裂解，盡 管只有20%的靶細(xì)胞對利妥?，斆舾?。加入同種型對照抗體(HuMab-KLH)并不誘導(dǎo)ADCC。 不加入MNCs觀察不到特異性裂解(數(shù)據(jù)未顯示)。實施例8 FRET和Triton-X不溶性分析用作熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的Cy3_和Cy5_結(jié)合的mAb的制備如生產(chǎn)商的 說明書中所述將單克隆抗體直接結(jié)合到Cy3和Cy5的雙功能性NHS-酯衍生物(Amserham Biosciences UK Ltd)。簡單地說，將mAb相對于0. IM碳酸鹽/重碳酸鹽緩沖液(pH 9)進 行透析。隨后，將染料溶于水中，立即加至Img的mAb中，并且于室溫黑暗溫育45分鐘。利 用在PBS中平衡的PD10-葡聚糖G25柱通過凝膠層析將標(biāo)記的mAbs從未結(jié)合的染料上分 離。利用分光光度測定結(jié)合的摩爾比為CY3 ε 552 = 150/mM/cm, Cy5 ε 650 = 250/mM/cm, 和蛋白質(zhì)ε 280 = 170/mM/cm，變化幅度為5_8倍的過量染料蛋白質(zhì)。FRET分析將Daudi細(xì)胞以5X IO6細(xì)胞/ml重懸于PBS/0. 1 % BSA中，將等摩爾 的供體(Cy3)_結(jié)合的mAb和受體(Cy5)-結(jié)合的mAb組合并加到細(xì)胞懸浮液中(終濃度 10 μ g/ml)。將細(xì)胞在黑暗中于4°C或37°C溫育30分鐘。在與20倍過量的未結(jié)合mAb—起 溫育之后，每一個實驗都包括用供體_和受體_結(jié)合的mAb標(biāo)記的細(xì)胞，以及用供體-和受 體_結(jié)合的mAb在等摩爾的mAb存在時標(biāo)記的細(xì)胞。為了評估標(biāo)記過的抗原的解離，利用 FACScalibur (BD Biosciences)進行流式細(xì)胞FRET測量。檢測于585nm(FL2)和650nm(FL3) 的熒光強度，二者都在488nm處激發(fā)，以及于635nm處激發(fā)的661nm(FL4)的熒光強度，并用 于根據(jù)下面的等式計算FRET，其中A是受體(Cy5)，D是供體(Cy3)。利用下面的公式校正 得到的所有值進行自發(fā)熒光FRET = FL3 (D，A) -FL2 (D，A) /a_FL4 (D，A) /b其中a = FL2 (D) /FL3 (D)，b = FL4 (A) /FL3 (A)利用從單一標(biāo)記的細(xì)胞中收集的數(shù)據(jù)得到校正參數(shù)，并且使用側(cè)角光散射來排除 碎片和死亡細(xì)胞。在雙重標(biāo)記的細(xì)胞上的供體和受體mAb衍生物之間的FRET以對于488nm 處發(fā)射敏感的受體的方式進行表達。較大的FRET值表示供體和受體標(biāo)記的抗體的較近的 物理關(guān)聯(lián)，或接近于供體標(biāo)記的mAb的較高密度的受體標(biāo)記的mAb。
通過Triton X-IOO(TXY)不溶性評估筏關(guān)聯(lián)的抗體為了快速評估抗原在筏微 區(qū)中的存在，如前所述使用基于Triton X-IOO(TXY)不溶性的流式細(xì)胞分析方法。簡單地 說，將Daudi細(xì)胞在RPMI/1% BSA中洗滌并以2. 5X106/ml進行重懸。隨后將所述細(xì)胞 (100 μ 1)與 10μ g/ml 的 FITC 結(jié)合的 mAb—起于 37°C溫育 15 分鐘，在冷 PBS/1 % BSA/20mM 疊氮化鈉(PBS-BS)中洗滌，將樣品分為兩半。在整個余下的測試中將所有樣品都保持于冰 上。一半保持于冰上以允許計算100%的表達抗原水平，同時另一半以0. 5% TX于冰上處 理15分鐘以測定保留在不溶性筏部分上的抗原的比例。隨后在整個余下的測試中將細(xì)胞 保持于4°C，在PBS-BS中洗滌一次，重懸于PBS-BS中并通過流式細(xì)胞分析進行評估。為了 測定靶抗原的筏關(guān)聯(lián)的組成水平，首先在冰上用0. 5% TX處理細(xì)胞15分鐘并在FITC標(biāo)記 的mAb結(jié)合之前在PBS-BS中洗滌。如圖29A，29B和29中所示，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析顯示在與2F2或7D8 一起溫育之后⑶20的集聚。在與11B8 —起溫育之后沒有觀察到這種集聚。這些結(jié)果與TX 處理數(shù)據(jù)一致，見圖29C，(即，2F2和7D8，不像11B8，在結(jié)合后與細(xì)胞的不溶性部分保持在 一起)，并且支持這種概念，即，2F2和7D8在結(jié)合后將⑶20轉(zhuǎn)位至B細(xì)胞膜的脂筏區(qū)。如圖30中所示(FRET值和利用單向AN0VA，隨后通過Tukey's多重比較post-hoc 測試得到的這些實驗的s. e. m.)，F(xiàn)RET值顯示利妥希瑪和2F2的集聚，而用11B8T沒有觀察 到集聚。如圖31 (η = 2)所示，這些數(shù)據(jù)與在用0. 5% TX處理之后所獲得的數(shù)據(jù)一致，所述 處理是在FITC標(biāo)記的mAbs結(jié)合之前進行的。脂筏片段的制備和蛋白質(zhì)印跡檢測CD20與脂筏關(guān)聯(lián)的另一種方式，是利用 Deans, J. P.等，J. Biol. Chem. , 1998. 273(1) :344_348頁所公開的蔗糖梯度分段法研究 筏和非筏膜片段之間⑶20的分布，不同的是使用Optipr印(Sigma)而非蔗糖。讓靶向 α)20(10μβ/πι1)的單克隆抗體于37°C結(jié)合Daudi細(xì)胞(IX IO7) 20分鐘。在這種溫育之后， 將細(xì)胞進行沉淀，以PBS洗滌兩次并在冰冷的裂解緩沖液(1. 0% TX于MES-緩沖鹽水(25mM MES，pH 6. 5，150mMNaCl，ImM 苯甲磺酰氟，5 μ g/ml 抑肽酶，5 μ g/ml 白胃素，IOmM EDTA)) 中裂解。將細(xì)胞沉淀完全重懸并于冰上溫育20分鐘。隨后，將裂解物與400 μ 1冷的60% Optipr印(Sigma) 一起混合。用600 μ 1的每種裂解緩沖液中的35%，30%，25%，20%，0% Optiprep覆蓋樣品。將所述梯度于4°C 40，OOOrpm離心18小時。從上部收集6種餾分， 置于4-15%的SDS-PAGE凝膠上，轉(zhuǎn)移至硝化纖維膜上并與一抗(小鼠抗⑶20pOlySera ； Serotec, UK) 一起溫育，隨后用HRP結(jié)合的二抗(鼠抗小鼠HRP Jackson, Bar Harbor, Maine, USA)。利用 Supersignal WestDura 延時底物(Pierce, Woburn, ΜΑ, USA)來顯像印 跡。結(jié)果示于圖32中。如可見到的，CD20分子被限制于高密度的餾分5 (未處理的細(xì) 胞)中。用利妥?，斕幚淼募?xì)胞顯示CD20分布的明顯變換，在較低密度的膜餾分2和3中 具有顯著的比例，與膜筏預(yù)計沉淀的餾分相一致。用2F2處理的細(xì)胞也顯示向餾分2和3的 這種轉(zhuǎn)變。相反，用11B8T處理20分鐘的細(xì)胞顯示與未處理細(xì)胞相似的分布，⑶分子在餾 分5中?？傊Y(jié)合2F2和利妥?，斦T導(dǎo)CD20分子向較低密度膜餾分的轉(zhuǎn)變，而結(jié)合11B8T 則不然。實施例9由抗⑶20的人抗體導(dǎo)致的Burkitt細(xì)胞系的凋亡凋亡將0. 5X IO6于Iml組織培養(yǎng)基中的Dau di細(xì)胞與1或10 μ g/ml的mAb或?qū)φ湛贵w一起置于24孔平底培養(yǎng)板中，并在37°C溫育。20小時后，收集細(xì)胞，在膜聯(lián)蛋 白-V-FITC結(jié)合緩沖液(BD biosciences)中洗滌并以膜聯(lián)蛋白V_FITC(BD biosciences) 于黑暗中4°C標(biāo)記15分鐘。將細(xì)胞保持于4°C直到分析。向在FACS管中的每種樣品 (150 μ 1)加入10 μ 1的PI溶液(10 μ g/ml于PBS中)。立即利用FACScalibur流式細(xì)胞 儀以CellQuest pro軟件(BD Biosciences,Mountain view, CA)通過流式細(xì)胞分析對混合 物進行評估。收集至少10，000次事件進行分析。在Daudi細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡在抗⑶20人抗體存在時(1 μ g/ml)溫育Daudi細(xì)胞 20小時(不加入第二交聯(lián)抗體)。利用流式細(xì)胞分析通過膜聯(lián)蛋白V/PI染色對凋亡的誘 導(dǎo)進行評估。如圖33A-G中所示，11B8顯示明顯的誘導(dǎo)凋亡的證據(jù)(與由抗IgM抗體誘導(dǎo)的凋 記相似)。2F2和7D8不誘導(dǎo)Daudi細(xì)胞的凋亡。將誘導(dǎo)凋亡的小鼠抗⑶20抗體用作對照。在Raji細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡用⑶20mAbs的濃度范圍來測試Raji細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)。 圖34顯示膜聯(lián)蛋白-V-陽性細(xì)胞的百分比。如從圖34中所能見到的，陽性對照小鼠抗人 ⑶20mAb，Bi，誘導(dǎo)濃度依賴性的Raji細(xì)胞凋亡增長，于10 μ g/ml的mAb上具有約70%的 最大值。11B8還是凋亡的一種強誘導(dǎo)劑，導(dǎo)致Raji細(xì)胞的凋亡，于10 μ g/ml的mAb上具有 約53. 4%的最大值。在另一方面，2F2和利妥?，斣谡T導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡中作用非常小，與 陰性對照水平相比有輕微升高的凋亡水平。在Dau di細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡在加入1. 0 μ g/ml的mAb后，當(dāng)Daudi細(xì)胞用作靶細(xì) 胞時出現(xiàn)相同的圖像(圖35A和35B)。圖35A中的數(shù)據(jù)顯示全部的膜聯(lián)蛋白-V陽性細(xì)胞， 而圖35B(the X-軸顯示膜聯(lián)蛋白-V，Y-軸顯示PI)顯示早期凋亡(膜聯(lián)蛋白-V陽性和 PI陰性)和晚期凋亡(膜聯(lián)蛋白-V陽性PI陽性)中Daudi細(xì)胞的百分比。再一次地，當(dāng) 在1. 0 μ g/ml的濃度上使用時，Bl (65. 9% )和11Β8Τ(56· 3% )都是凋亡的強誘導(dǎo)劑(圖 36)。加入2F2T產(chǎn)生低水平的凋亡Daudi細(xì)胞(17% )。加入利妥?，敭a(chǎn)生Daudi細(xì)胞大 約29%的凋亡。加入同種型對照抗體HuMab-KLH并不誘導(dǎo)Daudi細(xì)胞的凋亡(6% )。實施例10用抗CD20的人抗體導(dǎo)致的同型粘著同型聚集與凋亡的誘導(dǎo)相關(guān)。所以，對抗CD20mAbs誘導(dǎo)B細(xì)胞同型聚集的能力進 行研究。Ramos-EHRB細(xì)胞的同型聚集在抗CD20抗體11B8、2F2或7D8(無交聯(lián))存在時 于37°C溫育Ramos-EHRB細(xì)胞(0. 5 X IO6于Iml組織培養(yǎng)基中)4小時并通過光學(xué)顯微鏡評 估同型粘著的誘導(dǎo)(如上所述)。如圖36A-E中所示，11B8引發(fā)廣泛的Ramos-EHRB的聚集(類似于由鼠抗⑶20抗 體，AT80所引發(fā)的聚集)。2F2和7D8并不誘導(dǎo)Ramos細(xì)胞的同型粘著。Daudi細(xì)胞的同型聚集將Daudi細(xì)胞與1或10 μ g/ml的抗⑶20mAb或?qū)φ湛贵w 一起置于24孔平底培養(yǎng)板中，并在37°C溫育4小時。通過光學(xué)顯微鏡測定同型聚集的程度。 如由圖37中可見到的，2F2以1. 0 μ g/ml (和10 μ g/ml，數(shù)據(jù)未顯示)幾乎不誘導(dǎo)Daudi細(xì) 胞的同型粘著。利妥希瑪給出稍許的Daudi細(xì)胞的同型粘著。相反地，Bl抗體是同型粘著 的一種強誘導(dǎo)劑。實施例11利用抗⑶20人抗體的免疫治療使用以Daudi細(xì)胞侵染的SCID小鼠的高劑量(100μ g)2F2和7D8進行的治療SCID小鼠獲自Harlan UK Ltd.，Blackthorn，Oxon，UK，培育和保持在無病原的條件下。將 Daudi細(xì)胞(2. 5 X IO6)靜脈注射到12-16周大的SCID小鼠同齡組的尾靜脈中，隨后在7天 后通過同樣的途徑注射IOOyg 2F2或7D8。在呈現(xiàn)四肢麻痹后，依據(jù)動物倫理委員會的指 導(dǎo)將動物處死。如圖38中所示，在用2F2或7D8處理之后小鼠的存活延長。使用以Tanoue細(xì)胞侵染的SCID小鼠的高劑量(100 μ g) 2F2和利妥?，斶M行的 治療將Tanoue細(xì)胞(2. 5X IO6于200 μ 1 PBS中)靜脈注射到12-16周大的SCID小鼠 (Harlan UK Ltd.，Blackthorn, Oxon, UK)同齡組的尾靜脈中，隨后在7天后通過同樣的途 徑注射100 μ g (于200 μ 1 PBS中)抗⑶20mAb。在該實驗中，將2F2與利妥?，敽虰l相比 較。在呈現(xiàn)后肢麻痹后將動物處死。結(jié)果示于圖39中。在第39天，第一批兩只對照小鼠 死亡，在該組內(nèi)的死亡于第54天完成。在該時間段于2F2處理之后僅有一只小鼠死亡并且 該組中其它小鼠的存活顯著提高。在注射腫瘤細(xì)胞81天之后一只小鼠死亡并且剩下的小 鼠(總數(shù)目的60% )存活超過了腫瘤侵染后的100天實驗終止之時。相反利妥希瑪僅僅提高了 5只小鼠中的2只的存活(侵染后的66和83天)并且沒有 小鼠存活到實驗結(jié)束。在Bl組中，SCID小鼠的存活類似于2F2組的存活，兩只小鼠在第48 天死亡，一只小鼠在第76天死亡。在該組中，40%在實驗結(jié)束時存活。以Daudi細(xì)胞侵染的SCID小鼠的2F2和利妥希瑪治療的劑量反應(yīng)為了評估2F2 與利妥?，斚啾仍诳怪铝鲎饔帽Ｗo中的效力，在以Daudi細(xì)胞侵染的SCID小鼠的治療中進 行劑量滴定。Daudi細(xì)胞比Tanoue細(xì)胞表達更多的⑶20并且對于體外殺傷更加敏感。在0 天用2. 5 X IO6Daudi細(xì)胞(于200 μ 1 PBS中)靜脈內(nèi)注射10組SCID小鼠(4只/組)和1 個對照組(5只SCID小鼠)，隨后在第7天以靜脈內(nèi)給與20、5、2、0. 5或0. Iyg(于200μ 1 PBS中)利妥希瑪、2F2或PBS (對照)進行處理。在呈現(xiàn)后肢麻痹后將動物處死。結(jié)果示 于圖40中。在對照組中，所有的小鼠都在26-29天的時間段死亡。不過，用2F2觀察到明顯的 劑量-效果關(guān)系(圖40，上圖)。雖然用0. Iyg和0.5yg 2F2沒有觀察到效果，2 μ g的 2F2基本上將存活延長到41天，5 μ g的2F2將存活延長到47天，而20 μ g的2F2甚至將存 活延長到50天。相反地，即使是在20 μ g的最高劑量測試的利妥?，斠仓皇禽p微地提高存活并且 因而在較低的測試濃度觀察不到劑量_效果關(guān)系(圖40，下圖)。用11B8T和Bl治療患Daudi腫瘤的SCID小鼠將于200 μ 1 PBS中的Daudi細(xì)胞 (2. 5 X IO6)靜脈注射到12-16周大的SCID小鼠同齡組的尾靜脈中，隨后在7天后通過同樣 的途徑注射100 μ g 11B8或Bi。在呈現(xiàn)后肢麻痹后將動物處死。在用PBS處理的對照小 鼠中，所有的小鼠都在35-53天的時間段中死亡(圖41)。11B8T處理有力地保護了小鼠， 小鼠死于腫瘤侵染后的72和98天之間。在Bl處理組中，大多數(shù)小鼠存活到第98天并且 40%的小鼠存活超過實驗結(jié)束時，S卩100天。實施例12利用SCID小鼠評估Daudi-luc異種移植模型中的抗⑶20抗體在一種小鼠模型中評估抗CD20抗體的療效，在所述小鼠模型中利用外部光學(xué)成 像跟蹤人B細(xì)胞腫瘤細(xì)胞的擴散生長。在該模型中用螢火蟲熒光素酶轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞。在 向小鼠施用熒光素(Molecular Probes, Leiden, The Netherlands)之后，可以通過生物 發(fā)光成像利用高度敏感CXD照相機對標(biāo)記的細(xì)胞進行體內(nèi)檢測，見Wetterwald等(2002)American Journal of PatholoQ-y,160(3) 1143—1153。用來自Gene Therapy Systems (San Diego，CA)的 WIZ 螢光素酶轉(zhuǎn)染 Daudi 細(xì)胞并 且在具有10% FCS、Pen/Str印、丙酮酸和1 μ g/ml嘌呤霉素(Sigma)的RPMI中培養(yǎng)。在發(fā) 光計中對細(xì)胞分析螢光素酶的表達(在RLU/1X105細(xì)胞中表達)并且通過FACS分析⑶20 的表達。將2. 5X IO6熒光素酶轉(zhuǎn)染的Daudi細(xì)胞/小鼠靜脈注射到SCID小鼠中。接種后 的第8天，所述小鼠接受2F2T、11B8T、利妥?，?、Bl或同種型對照抗體(hulgGI)的單劑量 (IOug)處理(6只小鼠/處理組)。為了進行成像，通過靜脈注射氯胺酮/賽拉嗪/阿托品 的混合物以小鼠進行麻醉。以25mg/ml的劑量靜脈給予合成的D-螢光素(鈉鹽，Molecular Probes) 0隨后將小鼠置于一只不透光的盒子中，3分鐘后利用VersArray 1300B液氮冷卻 的CXD檢測儀(Roper Scientific)來起始成像。在照明下形成黑色和白色的圖像用于參 考。利用 GraphPadPRISM 3. 02 版(Graphpad Software Inc)以 Newman-Keuls post 試驗 使用單向偏差分析來確立各組之間差異的統(tǒng)計學(xué)顯著性。在一周的間隔期進行來自后側(cè)的成像。在第8天，處理日，僅在尾部接種位點檢測 光光放射。在第14天對來自同種型對照組(hulgGI)的所有小鼠和來自利妥?，斀M的一只 小鼠檢測遠端位點上的腫瘤形成。在接下來的一周光放射穩(wěn)定地增強。圖42給出了在第 39天制得的所有小鼠的圖像(處理后的31天)，其中生物發(fā)光以紅色代表(小鼠中的暗色 區(qū)域)(光強度>50光子/5分鐘)作為小鼠的黑色和白色軀體圖像的覆蓋。通過將光信 號整合到體表上在第25、32、39和46天對每只小鼠的腫瘤大小進行量化，見圖43。在同種 型對照組中觀察到最快的腫瘤生長。用利妥?，斕幚斫o予腫瘤生長的顯著抑制。不過，由 2F2TU1B8T和Bl進行的腫瘤生長抑制顯著地更加有力(見下面表2顯著性水平)。表 2各組之間于不同時間點整合的光強度差異的顯著性水平 實施例13在食蟹猴中的預(yù)示和藥物動力學(xué)研究在每天一次靜脈內(nèi)給藥(通過隱靜脈)連續(xù)4天之后，目的是為了測定2F2在食 蟹猴(大約2歲大；體重范圍2. 1-2. 6kg)中的藥物動力學(xué)模式和藥效。研究還比較了利妥 ?，?shù)乃幮亩鴾y定其等效潛力。為此，將6只雄性和6只雌性食蟹猴分入6個劑量組，所 述劑量組分別以10ml/kg的恒定劑量體積于1. 25,6. 25和12. 5mg/kg/天的劑量水平接受 2F2或利妥?，斶B續(xù)4天。完成最后一次劑量給藥后，將動物保持于一個130天的給藥后觀 察期。在本研究過程中所用的操作和方法與英國衛(wèi)生部提出的良好實驗室操作OECD理論 相一致。定期對所有的動物觀察疾病健康的體征或?qū)χ委煹姆磻?yīng)并且進行體格檢查。在研 究過程中進行血液學(xué)、凝結(jié)、臨床化學(xué)和尿液分析的實驗室研究。在整個給藥和給藥后觀察 時期獲取血液樣品和淋巴節(jié)活組織(來自表皮淋巴節(jié))以進行流式細(xì)胞分析。通過流式細(xì) 胞術(shù)分析流式細(xì)胞表型⑶3，⑶4，⑶8，⑶20和⑶21。給藥后觀察期結(jié)束后將動物處死并 進行詳細(xì)的尸體剖檢。沒有負(fù)面臨床體征或任何認(rèn)為是與2F2或利妥?，斕幚硐嚓P(guān)的發(fā)現(xiàn)。圖44和45 分別顯示經(jīng)過處理的動物的外周血中表達⑶20和⑶21的細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。圖46顯 示在淋巴節(jié)中表達CD20細(xì)胞的流式細(xì)胞分析。總之，兩種在研究過程中分析的表型都顯示 在于6. 25mg/kg/天(25mg/kg全部)和12. 5mg/kg/天(50mg/kg全部)給藥2F2和利妥希 瑪后強烈和有效的B細(xì)胞消除。此外，數(shù)據(jù)顯示在2F2處理的動物的淋巴節(jié)和外周血中表 達CD20細(xì)胞的！^population大約在25mg/kg和50mg/kg給藥75天之后重新開始，即，顯 著晚于利妥希瑪處理的動物。而且，圖47A-C顯示在外周血中表達⑶201<)WCD23+⑶40high的細(xì)胞亞群的流式細(xì)胞 分析(Y. Vugmeyster 等(2003) Cytometry52A 101-109)。將獲自2F2或利妥希瑪處理的猴子的外周血細(xì)胞與抗人⑶20FITC鼠單克隆抗 體(Coulter) —起于室溫溫育10分鐘，所述2F2或利妥希瑪處理是通過于1. 25mg/kg(圖 47A)、6. 25mg/kg(圖47B)和12. 5mg/kg(圖47C)靜脈內(nèi)給藥每天一次連續(xù)4天進行的。隨 后，將計數(shù)珠與PBS和洗滌過兩次的細(xì)胞(300g 10分鐘)一起加入，隨后立即在流式細(xì)胞 儀(Beckman Coulter)中對表達 α^Ο^α^β+ΟΜΟ1^11 對表達 Q^OhighCDZS+QMOltw 的細(xì)胞亞 群進行分析。顯示的⑶201 ⑶23+CD40high細(xì)胞的結(jié)果表示為細(xì)胞/μ 1。如由圖47可見到 的，2F2與利妥?，斚啾饶軌蛘T導(dǎo)完全的和較長的表達⑶ZOlt^DZS+CDAOhigh的細(xì)胞的消除。實施例14利用定點誘變繪制抗原表位圖譜利用定點誘變法的抗原表位圖譜研究顯示在第二細(xì)胞外環(huán)中的位置170上的丙 氨酸(Α170)和位置172上的脯氨酸(Ρ172)對于已知的抗⑶20抗體識別人⑶20是關(guān)鍵 性的。在 Deans 和同事(Μ. J. Polyak 等，Blood, (2002)99(9) :pp 3256-3262 ；Μ. J. Polyak 等，J. Imnzuiiol.，(1998) 161(7) :pp 3242-3248)的研究中所有測試的抗 CD20mAbs 的結(jié)合 都被將A170和P172改變?yōu)橄鄳?yīng)的鼠⑶20殘基S170和S172所消除。已經(jīng)認(rèn)識了一些在 AxP抗原表位識別中的異質(zhì)性，但是由于大多數(shù)抗體像利妥希瑪識別S170和S172突變?yōu)槿?A170xP172序列的鼠⑶20，而一些其它的抗體則需要在緊鄰AxP序列N端的其它突變。為了驗證A170xP172對根據(jù)本發(fā)明的抗體的結(jié)合是否也重要，利用定點誘變將AxP序列突變 為SxS (AxP突變體=A170S, P172S)，用AxP突變體和野生型(WT)CD20DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，比較 抗⑶20mAbs的結(jié)合特性。利用定點誘變制備其它的突變體，P172S(位置172上的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸)， N166D (位置166上的天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?，和N163D (位置163上的天冬酰胺突變?yōu)?天冬氨酸)，以評估突變的氨基酸殘基對于本發(fā)明的抗體的結(jié)合是否重要。為了對此進行檢測，通過利用合適的引物擴增⑶編碼序列來構(gòu)建⑶20表達載體， 所述引物引入限制性位點和一個理想的Kozak序列以優(yōu)選表達。消化擴增的片段并且連接 于表達載體PEE13.4中。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中后，篩選插入片段的克隆并且選擇兩個克隆進 行測序以確認(rèn)正確的序列。構(gòu)建體命名為PEE13. 4⑶20HS。進行誘變以引入AxP突變并且在人⑶20的細(xì)胞外環(huán)中引入20個小鼠突變。通過 限制酶消化和測序來檢查誘變。將構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染于CHO細(xì)胞(對于AxP突變)或HEK293F 細(xì)胞中并且在轉(zhuǎn)染后的24或48小時利用流式細(xì)胞術(shù)進行分析。寡核苷酸PCR引物合成寡核苷酸PCR引物并通過Isogen BV(Maarssen, The Netherlands)進行量化。將引物以lOOpmol/ul的濃度重構(gòu)于水中并且保存于_20°C中直 到需要。PCR和測序引物的總結(jié)顯示于表3中。核酸的光密度測定根據(jù)生產(chǎn)商的說明書利用Ultrospec 2100 proClassic (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)對光密度進行測定。通過 0D260· 的分析測量DNA濃度，其中一個0D260 單位=50 μ g/ml。參照溶液與用于溶解核酸的溶 液相同。從大腸桿菌培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA 根據(jù)生產(chǎn)商的說明書(Westburg BV, Leusden, The Netherlands)使用來自Qiagen的試劑盒從大腸桿菌培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒DNA。 使用 HiSpeed plasmid Maxi i式齊[J盒或 Hi—Speed plasmid Midi i式齊[J盒(Qiagen)進行大量 質(zhì)粒的制備。使用Qiapr印Spin Minipr印試劑盒(Qiagen)進行小量質(zhì)粒的制備并且將 DNA 溶于 50ul TE (Tris-HCl IOmM pH 8. 0, EDTA ImM)中。PCR 擴增根據(jù)生產(chǎn)商對于 Pfu-Turbo Hotstart DNA 多聚酶(Stratagene， Amsterdam, The Netherlands)的說明書進行PCR反應(yīng)。每個20ul的反應(yīng)都包含1 XPCR反 應(yīng)緩沖液、2000uM混合dNTPs、6. 7pmol每種正向和反向引物、大約Ing模板DNA和1單位 ^ Pfu-Turbo Hotstart DNA 胃☆_。 PCRT—gradientThermocycler 96 (Biometra GmbH, Goettingen, Germany)上利用30個循環(huán)的程序進行+95°C 2分鐘，隨后進行30個循 環(huán)的+95°C 30秒，退火45-65°C的梯度30秒，和延伸+72°C 2分鐘，接著進行最后的延伸 步驟于72°C 10分鐘隨后保存于4°C。通過瓊脂糖凝膠電泳分析完成的反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳根據(jù) Sambrook (Molecular Cloning LaboratoryManual，第三 版)利用50ml膠，于IXTris/乙酸/EDTA(TAE)緩沖液中進行瓊脂糖凝膠電泳。通過在膠 中加入溴化乙錠來顯像DNA并在紫外線燈下進行觀察。通過CXD照相機和圖像分析系統(tǒng) (GeneGnome ；Syngene, Cambridge, UK)記錄凝膠圖像。限制酶消化限制酶由New England Biolabs (Beverly, ΜΑ)提供并且根據(jù)供應(yīng)商 的建議進行使用。通常，用5單位的酶于合適的緩沖液內(nèi)在IOul的總體積中消化lOOng。 反應(yīng)體積根據(jù)需要適當(dāng)?shù)卣{(diào)高。在生產(chǎn)商推薦的溫度上進行消化溫育最少60分鐘。
對于需要用具有不兼容緩沖液或溫度需要的限制酶進行雙消化的片段，按順序進 行消化，從而依次為每種酶提供良好條件。堿性磷酸酶處理蝦堿性磷酸酶(USB，Cleveland, OH)根據(jù)供應(yīng)商的建議進行使 用。堿性磷酸酶將5’磷酸基團從DNA片段的末端去除，由此阻止自身連接。當(dāng)DNA的自身 連接能夠?qū)е掠袕?fù)制能力的載體時這尤其有關(guān)聯(lián)。該酶在大多數(shù)限制酶緩沖液中具有活性 并且根據(jù)需要適當(dāng)加入。消化后，通過將溫度提高到70°C 15分鐘來滅活該酶。PCR的純化和限制酶反應(yīng)產(chǎn)物利用mini-elute PCR純化試劑盒(Qiagen提 供)，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書進行純化。簡言之，將DNA樣品稀釋于5倍體積的結(jié)合緩沖液 I (Qiagen)中并上樣至Eppendorf離心管中的mini-elute柱上。將該裝置在bench-top微 離心機中進行離心。用緩沖液II (Qiagen)洗滌柱兩次使用緩沖液后，將該裝置離心并且 棄去流過液。通過在沒有加入緩沖液的情況下離心來干燥柱。通過向柱中加入洗脫液來溶 液洗脫DNA并且通過離心收集洗脫物。通過紫外分光鏡檢查來量化分離的DNA并且通過瓊 脂糖凝膠電泳來評估質(zhì)量。從瓊脂糖凝膠中分離DNA片段在適當(dāng)?shù)那闆r下(即當(dāng)多種片段存在時)，通過凝 膠電泳來分離消化的DNA樣品并且根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，將需要的片段從凝膠中切出和利 用QIAEX II凝膠提取試劑盒(Qiagen)進行回收。簡言之，將DNA帶從瓊脂糖凝膠中切出 并于+55°C溶于適當(dāng)?shù)木彌_液中。加入QIAEX II樹脂并且溫育5分鐘。通過短暫離心步驟 沉淀QIAEX II樹脂(1分鐘，14000g，室溫)并且用500 μ 1的洗滌緩沖液PE洗滌兩次。將 最終的沉淀物于通風(fēng)櫥中干燥并且以適當(dāng)體積的TE和溫度溶解DNA (根據(jù)DNA的大小)。DNA 片段的連接用 Quick Ligation Kit (New England Biolabs)根據(jù)生產(chǎn)商的 說明書進行連接。對于每個連接，將載體DNA與多出大約3倍摩爾量的插入DNA相混合，從 而使用DNA的總量在10 μ 1中小于200ng，根據(jù)需要用水來調(diào)節(jié)體積。向其中加入10 μ 1 2XQuickLigation Buffer和Ιμ Quick T4DNA連接酶并且將連接混合物在室溫溫育5-30 分鐘。DNA轉(zhuǎn)化至細(xì)菌中利用熱激法根據(jù)生產(chǎn)商的說明書將DNA樣品用于轉(zhuǎn)化One ShotDHSa TlR 感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen, Breda, The Netherlands)。簡言之，將 1-5 μ 1的DNA溶液(一般2 μ 1的DNA連接混合物)加至一份轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌細(xì)胞中并將 混合的于冰上溫育30分鐘。隨后通過轉(zhuǎn)移至42°C的水浴中30秒，接著在冰上進一步溫育 5分鐘來熱激所述細(xì)胞。通過在非選擇性培養(yǎng)基(SOC)中于37°C振蕩溫育1小時來復(fù)原細(xì) 胞并且接下來將其鋪到含有合適選擇劑(50yg/ml的氨芐青霉素)的瓊脂糖平板上。于 +37°C溫育平板16-18小時或直到細(xì)菌菌落變得明顯。通過PCR篩選細(xì)菌菌落利用PCR菌落篩選技術(shù)對細(xì)菌菌落篩選含有所需序列的 載體的存在。將含有0. 5倍體積的HotStarTaqMaster Mix(Qiagen)、4pmol的正向和反向 引物和用水補滿的20 μ 1的PCR反應(yīng)混合物加到PCR管中。用一個20 μ 1的吸移管頭輕輕 接觸一個菌落，在培養(yǎng)管內(nèi)的2ml LB中接觸一次(用作生長含有相應(yīng)質(zhì)粒的細(xì)菌)并且 在 Ομ 1 的 PCRt昆合物中重懸。PCR 反應(yīng)在 T-gradientThermocycler 96 (Biometra GmbH, Goettingen, Germany)上利用35個循環(huán)的程序進行+95°C 15分鐘，隨后進行35個循環(huán)的 +940C 30秒，退火55°C 30秒，和延伸+72°C 2分鐘，接著進行最后的延伸步驟于72°C 10分鐘隨后保存于4°C。通過瓊脂糖凝膠電泳分析完成的反應(yīng)。用于菌落PCR的引物對的細(xì)胞參見表3。表3名稱用途長度CD20P172SCD20 誘變 36 GGTTCACAGTTGTACD20N166DCD20 誘變 39CD20N163DCD20 誘變 36cd20exforCD20 構(gòu)建 41 ACCCAGAAATTCAcd20exrevCD20 構(gòu)建 38 CATTTTCTATpeel3. 4seqrev2 菌落 PCR 23pConKseql菌落 PCR 23cd20hsapmutr (AxP) CD20 誘變 42 GGTTCACAGTTGTAcd20hsapmutf (AxP) CD20 誘變 42 AGAAAAACTCCCCACD20seq2CD20 測序 23cd20seqlCD20 測序 23
寡序列
TGGGGAGTTTTTCTCAGAGGAATTCGAT
TGTAACAGTATTGGGTAGATGGG AATCATGGACATACTTAATATTA TATAGCCCGGGGCCGCCACCATGACAAC
GCGTCTCATGTACATTAAGGAGAGCTGT
TCGGACATCTCATGACTTTCTTT GTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGC TGGGGAGTTTTTCTCAGAGGAATTCGAT
TACAACTGTGAACCATCGAATTCCTCTG
TGTAACAGTATTGGGTAGATGGG AATCATGGACATACTTAATATTA誘變利用QuikChange XL 定點誘變試劑盒(Cat 200517-5，Lotl 120630， Stratagene Europe)根據(jù)生產(chǎn)商的說明書進行誘變。利用乙醇沉淀濃縮誘變反應(yīng)物并且將其轉(zhuǎn)化至oneshot DH5 α -TlR感受態(tài)大腸桿 菌細(xì)胞或電穿孔至ElectroTen-Blue 電穿孔感受態(tài)細(xì)胞中。通過在轉(zhuǎn)染之前進行菌落 PCR和限制性消化來檢查菌落。HEK293F細(xì)胞轉(zhuǎn)染HEK293F細(xì)胞由Invitrogen獲得并且根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，利 用293feCtin進行轉(zhuǎn)染。將HEK293F細(xì)胞用作所有的單一突變體序列。CHO 細(xì)胞轉(zhuǎn)染當(dāng)利用 Iipofectamine 2000 (M668-019，Invitrogen, Breda, Netherlands)以⑶20野生型、突變體cDNA或兩種構(gòu)建體的組合進行瞬時轉(zhuǎn)染時CHO細(xì)胞 總共生長至約95%。結(jié)束后，將24 μ g的沉淀DNA稀釋(lyg/yl)于500 μ 1的optimem 中，比例為 AxP 100% :WT 0%;AxP 33. 3%:WT 66. 6%;AxP 66. 6%:WT 33. 3%;AxP 0%:WT 100%。對于每一次轉(zhuǎn)染都將24μ 1的lipofectamine稀釋于500 μ loptimem中。隨后，將 稀釋的lipofectamine進行溫育(室溫，5分鐘)，并且稀釋的DNA與稀釋的lipofectamine 組合。輕輕混合并溫育所述溶液(室溫，2分鐘)后，向CHO細(xì)胞加入1000 μ 1 DNA/ lipofectamine，完全混合并于37°C 5% CO2溫育48小時。CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的兩天，以FACS 緩沖液洗滌細(xì)胞兩次(添加了 0. 1 % BSA和0. 002% NaN3的PBS)。CHO細(xì)胞用trypsin/ EDTA(Gibco BRL, Life Technologies, Paisley, Scotland)處理并且移出培養(yǎng)板。抗CD20抗體結(jié)合取PBS中的濃度為2X 106/ml的HEK293F細(xì)胞和CHO細(xì)胞，加 至圓底培養(yǎng)板中(IX IO5/孔)。隨后，以10、5、2.5或Oyg每孔的一系列稀釋液加入50μ 1 CD20mAb (4°C，30分鐘)。在FACS緩沖液中洗滌之后(添加7 0. 1% BSA和0. 002 % NaN3的PBS)，在流式細(xì)胞儀上分析所述細(xì)胞(Becton Dickinson, San Diego，CA，USA)，在高流速上 取得5，000次事件/樣品。如由圖48A-E可見到的，所有的抗⑶20mAbs有效地結(jié)合表達WT⑶20的CHO細(xì)胞。 如所預(yù)期的，利妥?，敳唤Y(jié)合AxP突變體(圖48A)，Bl很少地結(jié)合這種突變體(圖48D)。 相反，2F2和11B8等同地很好地結(jié)合WT和AxP突變體CD20 (圖48B和圖48C)。在表面上滴定WT⑶20的量確實促進了利妥希瑪和Bl的量。2F2和11B8再一次 對突變的缺失或存在是不敏感的。本研究顯示2F2和11B8結(jié)合⑶20對于氨基酸位置170和172上的突變是不敏感 的。所以2F2和11B8代表一種識別新型⑶20抗原表位的⑶20mAbs的新類別。圖49A顯示2F2、11B8T、Bl或利妥希瑪與突變體P172S對WTCD20的百分比結(jié)合， 圖 49B 顯示 2F2T、11B8T、Bi、CAT (CAT 13. 6E12，小鼠單克隆 IgG2A 抗 CD20 抗體，Diatec. Com)、對照同種型抗體(KLH)或利妥?，斉c突變體CD20 (AxP)對WT CD20的百分比結(jié)合。對于在位置166上的天冬酰胺已被天冬氨酸取代的突變體(⑶2CM166D) 2F2顯示 非常低的結(jié)合，而Bi、利妥?，敽?1B8T則能夠結(jié)合，見圖49C。在一個類似的實驗中，CAT 13. 6E12和利妥?，斈軌蚪Y(jié)合CD2CM166D，而2F2T僅僅顯示非常低的結(jié)合，見圖49D。對于 在位置163上的天冬酰胺已被天冬氨酸取代的突變體(⑶2CM163D)，利妥希瑪、11B8T和Bl 仍然能夠結(jié)合⑶2CM163D，而2F2和2F2T僅僅顯示非常低的結(jié)合，見圖49E。在一個類似的 實驗中，CAT 13.6E12和利妥希瑪能夠結(jié)合⑶2CM163D，而2F2T僅僅顯示非常低的結(jié)合，見 圖 49F。這些實驗顯示2F2和11B8結(jié)合不同的抗原表位。實施例15利用P印scan法進行抗原表位圖譜繪制肽的合成根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法合成7-、9_和15-姆的肽。在某些情況下15-姆肽 末端的化學(xué)連接有助于識別有可能不連續(xù)的抗原表位的氨基酸序列。根據(jù)已知的方法 (H. M-Geysen 等(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81 :3998 ;J. W. Slootstra 等(1996)Mol. Divers. 1 87 ；和WO 01/60769)，合成7_、9_和15-姆的肽，所述肽可以是有關(guān)2F2或11B8T 結(jié)合人CD20分子的可能的結(jié)合位點或抗原表位。將_和15-姆的肽合成為環(huán)并且利用信 用卡格式的mini-PEPSCAN卡(455肽格式/卡)進行篩選。在所有環(huán)狀肽中將不同位置 上的氨基酸用半胱氨酸代替(例如，乙酰基-XCXXXXXXXXXXXCX-minicard)。利用標(biāo)準(zhǔn)的 Fmoc-化學(xué)法合成所述肽并且利用TFA以消除劑進行去保護。隨后，將去保護的肽在微陣 列上與0. 5mM的碳酸氫銨(20mM，pH 7.9)中的1，3_ 二(溴甲基)苯溶液反應(yīng)，所述溶液添 加了乙腈(1 l(v/v))0當(dāng)被所述溶液完全覆蓋時，將微陣列在溶液中輕輕搖動30-60分 鐘。最后，用過量的Millipore H2O充分洗滌微陣列并且在含有1 % SDS、0. 1 % β-巰基乙 醇，于PBS中(ρΗ 7. 2)的裂解緩沖液中于70°C聲波破碎30分鐘，隨后再于Millipore H2O 中聲波破碎45分鐘。接下來，微孔已經(jīng)可以在ELISA測試中進行篩選了。Pepscan ELISA測試將含有共價連接肽的455孔信用卡格式的聚乙烯卡與血 清(在含有5%馬血清(ν/ν)和5%卵清蛋白(w/v)的封閉液中稀釋1 1000) —起溫育 (4°C，過液)。洗滌后，將所述肽與抗人抗體過氧化物酶一起溫育(稀釋1 1000，1小時， 25°C )，洗滌后加入過氧化物酶底物2，2’-連氮基-二 -3-乙基苯并噻唑啉磺酸鹽和2 μ 1/ ml3%H202。一小時后，測量顯示的顏色。用CXD相機和圖像處理系統(tǒng)來量化ELISA的顏色顯示。所述裝置由 CCD 相機和一個 55mm 鏡頭(Sony CCD Video Camera XC-77RR，Nikon micro-nikk 或 55mm f/2. 8 鏡頭)、攝像機接合器(Sony Camera adaptor DC-77RR)和圖像 處理軟件包 0ptimas，6. 5 版(Media Cybernetics, Silver Spring, MD 20910，U.S.A.)所 組成。Optimas在奔騰II計算機系統(tǒng)上運行。 不同抗體濃度上肽的吸光度(0D值)顯示于下面的表4和表5中。
表 5 由表4可見，11B8顯示于10 μ g/ml和100 μ g/ml結(jié)合到人CD20的小的第一胞外 環(huán)的AGIYAP上，而其它測試的抗體則沒有顯示明顯的結(jié)合AGIYAP。而且，11B8顯示于10 μ g/ml和100 μ g/ml結(jié)合到人CD20的第二胞外環(huán)的 MESLNFIRAHTPYI上，而其它測試的抗體則沒有顯示明顯的結(jié)合MESLNFIRAHTPYI。由表5可見，利妥?，旓@示于1 μ g/ml和10 μ g/ml結(jié)合到人⑶20的第二胞外環(huán) 的EPANPSEK上，而其它測試的抗體則沒有顯示明顯的結(jié)合EPANPSEK。實施例16抗獨特型抗體抗獨特型抗體的制備通過用2F2或11B8T免疫Balb/C小鼠，并且利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù) 以NSl骨髓瘤細(xì)胞融合產(chǎn)生來自這些小鼠脾的雜交瘤來制成小鼠抗獨特型抗體。產(chǎn)生了下 列抗獨特型抗體抗 2F2 sabl. 1、抗 2F2 sab 1. 2、抗 2F2 sab 1. 3、抗 11B8T sab 2. 2、抗 11B8T sab 2. 3、抗 11B8T sab 2. 4、抗 11B8T sab 2. 5 和抗 11B8T sab 2.6。對這些抗體測 試對2F2T、7D8和11B8T的特異性結(jié)合。用2F2T、7D8或11B8T涂布ELISA板(溶于PBS，終 濃度為1_2μ g/ml，37°C，2小時)。將所述板用含有0. 05% Tween-20和2%雞血清的PBS 進行封閉(室溫，1小時)。隨后，將所述板與來自抗獨特型抗體培養(yǎng)物的上清液一起溫育 (終濃度調(diào)節(jié)為1-10 μ g/ml，室溫，2小時)。用兔抗小鼠IgG-HRP (JacksonlmmunoResearch) 來檢測結(jié)合的小鼠抗獨特型抗體。如圖50 中所示，抗 2F2sabl. 1、抗 2F2sab 1. 2 和抗 2F2sab 1. 3 結(jié)合 2F2T 和 7D8， 但不結(jié)合11B8T或一種不相關(guān)的同種型對照人抗體。由于2F2T和7D8在\和Vh序列中非 常同源，預(yù)期抗2F2獨特型抗體與7D8反應(yīng)。圖 51 顯示抗 11B8T sab 2. 2、抗 11B8T sab 2. 3、抗 11B8T sab 2. 4、抗 11B8T sab 2. 5和抗11B8T sab 2. 6都以相似的程度結(jié)合11B8T?？躬毺匦涂贵w作為免疫診斷工具2F2/7D8和11B8T特異性抗獨特型抗體可以用 作免疫診斷工具以檢測和量化在實驗室或患者樣品中抗⑶人單克隆抗體的水平。這可能 對于檢測抗CD20抗體的藥物動力學(xué)或者對于檢測和調(diào)節(jié)抗CD20抗體的劑量或者對于監(jiān) 測疾病和患者治療的效果是有用的。作為這種測試的一個例子，用4 μ g/ml抗2F2sabl. 1、 抗2F2 sab 1. 2或抗2F2 sab 1.3涂布ELISA板。將所述板用含有0. 05% Tween-20和 2%雞血清的PBS進行封閉(室溫，1小時)。隨后，將所述板與系列稀釋的2F2T —起溫育 (10，000-9. 77ng/ml，室溫，2小時)。小鼠抗人IgG-HRP結(jié)合的抗體來檢測結(jié)合的2F2T。圖 52A-C中也顯示了觀察到的2F2T的劑量依賴結(jié)合。等同發(fā)明
本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到并能夠確認(rèn)，使用常規(guī)的實驗，可以獲得許多本文所述 發(fā)明的具體實施方案的等同發(fā)明。這些等同發(fā)明為下面的權(quán)利要求書所包括。從屬權(quán)利要 求中所公開的實施方案的任何組合也都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。并入?yún)⒖嘉墨I特此將本文所引用的全部專利、待決專利申請和其它公開物的全部內(nèi)容并入作為參考。
權(quán)利要求
一種分離的人單克隆抗體，所述抗體結(jié)合人CD20，并且具有至少一種選自下列的特性(i)選自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、分泌型IgA、IgD和IgE抗體；(ii)以大約10 5秒 1或更小的解離速率常數(shù)(Kd)從人CD20上解離下來；(iii)以大約5nM或更小的親和常數(shù)(KD)結(jié)合人CD20；(iv)能夠在補體存在時誘導(dǎo)表達CD20的細(xì)胞的補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)；(v)能夠在補體存在時誘導(dǎo)表達CD20的細(xì)胞的補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)和高水平的CD55和/或CD59；(vi)能夠誘導(dǎo)表達CD20的細(xì)胞的凋亡；(vii)能夠在效應(yīng)細(xì)胞存在時誘導(dǎo)表達CD20的細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)；(viii)能夠誘導(dǎo)表達CD20的細(xì)胞的同型粘著；(ix)能夠在結(jié)合CD20后轉(zhuǎn)位至脂筏中；(x)能夠延長患表達CD20的腫瘤細(xì)胞的個體的存活；(xi)能夠消除表達CD20的細(xì)胞；和(xii)能夠消除表達低水平的CD20的細(xì)胞(CD20Low細(xì)胞)。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體具有一種或多種選自下列的特性(i)能夠在33V01/V01%血漿存在時在3小時內(nèi)于37°C以10μg/ml的抗體濃度誘導(dǎo)至 少20%，優(yōu)選至少30%的⑶C介導(dǎo)的B-CLL細(xì)胞的裂解；(ii)能夠在33vol/vol%全血細(xì)胞存在時在3小時內(nèi)于37°C以10μ g/ml的抗體濃度 誘導(dǎo)至少20 %，優(yōu)選至少30 %的B-CLL細(xì)胞的裂解；(iii)能夠以20μ g的劑量延長用Daudi細(xì)胞注射的SCID小鼠的50%存活率超過 30% ；和(iv)能夠于6.25mg/kg每天的劑量連續(xù)給藥4天，在食蟹猴中消除表達低水平的⑶20 的外周B細(xì)胞(⑶20^Β細(xì)胞)至不能檢測到的水平持續(xù)超過50天。
3.一種分離的結(jié)合人CD20的人單克隆抗體，所述抗體由(i)人重鏈和人κ輕鏈核酸，所述人重鏈和人κ輕鏈核酸在其可變區(qū)分別包含如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列，及其保守性序列修飾物；( )人重鏈和人κ輕鏈核酸，所述人重鏈和人κ輕鏈核酸在其可變區(qū)分別包含如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 7所示的核苷酸序列，及其保守性序列修飾物；或(iii)人重鏈和人κ輕鏈核酸，所述人重鏈和人κ輕鏈核酸在其可變區(qū)分別包含如 SEQ ID NO :9和SEQ ID NO :11所示的核苷酸序列，及其保守性序列修飾物 所編碼。
4.一種分離的結(jié)合人CD20的人單克隆抗體，所述抗體具有(i)人重鏈和人κ輕鏈可變區(qū)，所述人重鏈和人κ輕鏈可變區(qū)分別包含如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 4所示的氨基酸序列，及其保守性序列修飾物；( )人重鏈和人κ輕鏈可變區(qū)，所述人重鏈和人κ輕鏈可變區(qū)分別與如SEQ ID NO 2 和SEQ ID NO :4所示的氨基酸序列至少90%同源，優(yōu)選至少95%同源，更加優(yōu)選至少98% 或至少99%同源；(iii)人重鏈和人κ輕鏈可變區(qū)，所述人重鏈和人κ輕鏈可變區(qū)分別包含如SEQ IDNO 6和SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列，及其保守性序列修飾物；(iv)人重鏈和人κ輕鏈可變區(qū)，所述人重鏈和人κ輕鏈可變區(qū)分別與如SEQ ID NO 6 和SEQ ID NO :8所示的氨基酸序列至少90%同源，優(yōu)選至少95%同源，更加優(yōu)選至少98% 或至少99%同源；(ν)人重鏈和人κ輕鏈可變區(qū)，所述人重鏈和人κ輕鏈可變區(qū)分別包含如SEQ ID NO 10和SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列，及其保守性序列修飾物；(vi)人重鏈和人κ輕鏈可變區(qū)，所述人重鏈和人κ輕鏈可變區(qū)分別與如SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO :12所示的氨基酸序列至少90%同源，優(yōu)選至少95%同源，更加優(yōu)選至少 98%或至少99%同源。
5.上述權(quán)利要求1-4任一項的抗體，所述抗體包含至少一種選自 (i)SEQ ID NOs :2、4、6、8、10 或 12 ；和( ) 一種與上面(i)中所示氨基酸序列的任一項至少90%同源，優(yōu)選至少95%同源， 更加優(yōu)選至少98%或至少99%同源的序列的人可變區(qū)。
6.一種分離的人單克隆抗體，所述抗體結(jié)合人CD20上的抗原表位，所述抗原表位由權(quán) 利要求1-5任一項的抗體所定義。
7.一種分離的人單克隆抗體，所述抗體結(jié)合CD20上的抗原表位，所述抗原表位 (i)不包含或不需要位置172上的氨基酸殘基脯氨酸；( )不包含或不需要位置170上的氨基酸殘基丙氨酸或位置172上的脯氨酸；(iii)不包含或不需要位置163上的氨基酸殘基天冬酰胺或位置166上的天冬酰胺；(iv)不包含或不需要位置172上的氨基酸殘基脯氨酸，但包含或需要位置163上的氨 基酸殘基天冬酰胺或位置166上的天冬酰胺；或(ν)不包含或不需要位置170上的氨基酸殘基丙氨酸或位置172上的脯氨酸，但包含或 需要位置163上的氨基酸殘基天冬酰胺或位置166上的天冬酰胺。
8.一種結(jié)合CD20的分離的人單克隆抗體，其中該抗體具有一種或多種下列特性(i)以至少與結(jié)合人⑶20相同的親和力結(jié)合突變體P172S⑶20 (位置172上的脯氨酸 突變?yōu)榻z氨酸)；( )以至少與結(jié)合人CD20相同的親和力結(jié)合突變體AxP (位置170上的丙氨酸突變?yōu)?絲氨酸，并且位置172上的脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸)；(iii)與人⑶20相比于10yg/ml的抗體濃度顯示減弱50%或更多的結(jié)合突變體 W66D (位置166上的天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?；或(iv)與人⑶20相比于10yg/ml的抗體濃度顯示減弱50%或更多的結(jié)合突變體 W63D (位置163上的天冬酰胺突變?yōu)樘於彼?。
9.一種分離的人單克隆抗體，其中所述抗體具有一種或多種下列特性 (i)結(jié)合人CD20的小的第一胞外環(huán)上的抗原表位；( )結(jié)合⑶20上的不連續(xù)抗原表位；(iii)結(jié)合CD20上的不連續(xù)抗原表位，其中該抗原表位包含第一小胞外環(huán)的部分和第 二胞外環(huán)的部分；(iv)結(jié)合CD20上的不連續(xù)抗原表位，其中該抗原表位具有小的第一胞外環(huán)的殘基 AGIYAP和第二胞外環(huán)的殘基MESLNFIRAHTPH。
10.一種分離的人單克隆抗體，所述抗體具有權(quán)利要求1-9任一項的抗體的結(jié)合特性。
11.一種分離的人單克隆抗體，所述抗體結(jié)合包含至少一種選自(i)SEQID NOs :13、14、15、16、17 或 18 ；(ii)(i)中所列序列的保守性序列修飾物；和(iii)保留結(jié)合人CD20能力的在⑴或(ii)中定義的任一種序列的片段的CDR序列 的人⑶20。
12.權(quán)利要求11的抗體，所述抗體包含SEQID NO :15。
13.權(quán)利要求11的抗體，所述抗體包含選自(i)SEQID NOs :13、14、15、16、17 或 18 ；(ii)(i)中所列序列的保守性序列修飾物；和(iii)保留結(jié)合人CD20能力的在⑴或(ii)中定義的任一種序列的片段的至少四種 CDR序列。
14.權(quán)利要求11的抗體，所述抗體包含SEQID NO :13、14、15、16、17和18。
15.一種分離的人單克隆抗體，所述抗體結(jié)合包含至少一種選自(i)SEQID NOs :19、20、21、22、23 或 24 ；(ii)(i)中所列序列的保守性序列修飾物；和(iii)保留結(jié)合人CD20能力的在⑴或(ii)中定義的任一種序列的片段的CDR序列 的人⑶20。
16.權(quán)利要求15的抗體，所述抗體包含選自(i)SEQID NOs :19、20、21、22、23 或 24 ；(ii)(i)中所列序列的保守性序列修飾物；和(iii)保留結(jié)合人CD20能力的在⑴或(ii)中定義的任一種序列的片段的至少四種 CDR序列。
17.權(quán)利要求15的抗體，所述抗體包含SEQID NOs :19、20、21、22、23和24。
18.一種分離的人單克隆抗體，所述抗體結(jié)合包含至少一種選自(i)SEQID NOs :25、26、27、28、29 或 30 ；(ii)(i)中所列序列的保守性序列修飾物；和(iii)保留結(jié)合人CD20能力的在⑴或(ii)中定義的任一種序列的片段的CDR序列 的人⑶20。
19.權(quán)利要求18的抗體，所述抗體包含SEQID NO :27。
20.權(quán)利要求18的抗體，所述抗體包含選自(i)SEQID NOs :25、26、27、28、29 或 30 ；(ii)(i)中所列序列的保守性序列修飾物；和(iii)保留結(jié)合人CD20能力的在⑴或(ii)中定義的任一種序列的片段的至少四種 CDR序列。
21.權(quán)利要求18的抗體，所述抗體包含SEQID NOs :25、26、27、28、29和30。
22.上述權(quán)利要求任一項的抗體，所述抗體包含選自(i)SEQ ID NOs 13、19或25，或具有SEQ ID NOs 13、19或25序列的1個氨基酸取代、 缺失或添加的序列；(ii)SEQID NOs :14、20 或 26，或具有 SEQ ID NOs 14、20 或 26 序列的 1_4 個氨基酸取 代、缺失或添加的序列；(iii)SEQID NOs 15或27，或具有SEQ ID NOs 15或27序列的1_4個氨基酸取代、缺 失或添加的序列；(iv)SEQ ID N0:16，或具有SEQ ID NOs :16序列的1_2個氨基酸取代、缺失或添加的序列；(V)SEQ ID N0:17，或具有SEQ ID NOs :17序列的1_2個氨基酸取代、缺失或添加的序列；(vi)SEQ ID NOs 18或30，或具有SEQ ID NOs 18或30序列的1_2個氨基酸取代、缺 失或添加的序列的至少一種⑶R。
23.權(quán)利要求22的抗體，所述抗體包含選自(i)SEQID NOs 13、19或25，或具有SEQ ID NOs 13、19或25序列的1個氨基酸取代、 缺失或添加的序列；(ii)SEQID NOs :14、20 或 26，或具有 SEQ ID NOs 14、20 或 26 序列的 1_4 個氨基酸取 代、缺失或添加的序列；(iii)SEQID NOs 15或27，或具有SEQ ID NOs 15或27序列的1_4個氨基酸取代、缺 失或添加的序列；(iv)SEQ ID N0:16，或具有SEQ ID NOs :16序列的1_2個氨基酸取代、缺失或添加的序列；(V)SEQ ID N0:17，或具有SEQ ID NOs :17序列的1_2個氨基酸取代、缺失或添加的序列；(vi)SEQ ID NOs 18或30，或具有SEQ ID NOs 18或30序列的1_2個氨基酸取代、缺 失或添加的序列的至少四種⑶R。
24.權(quán)利要求22的抗體，所述抗體包含一種選自SEQ ID NOs 15或27，或具有SEQ ID NOs 15或27序列的1_4個氨基酸取代、缺失或 添加的序列。
25.上述權(quán)利要求任一項的抗體，該抗體為選自完整的IgGl抗體、完整的IgG2抗體、 完整的IgG3抗體、完整的IgG4抗體、完整的IgM抗體、完整的IgAl抗體、完整的IgA2抗體、 完整的分泌型IgA抗體、完整的IgD抗體和完整的IgE抗體的完整抗體，其中所述抗體在真 核細(xì)胞中進行糖基化。
26.上述權(quán)利要求任一項的抗體，所述抗體是一個抗體片段或單鏈抗體。
27.上述權(quán)利要求任一項的抗體，所述抗體是一種結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白，包 含(i)以融合到免疫球蛋白鉸鏈區(qū)多肽上的如權(quán)利要求5中所定義的重鏈可變區(qū)或輕鏈可 變區(qū)形式存在的結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽，(ii)融合到鉸鏈區(qū)上的免疫球蛋白重鏈CH2恒定區(qū)，和 (iii)融合到CH2恒定區(qū)上的免疫球蛋白重鏈CH3恒定區(qū)。
28.上述權(quán)利要求任一項的抗體，所述抗體由一種包括獲自轉(zhuǎn)基因非人動物并且與永 生化細(xì)胞融合的B細(xì)胞的雜交瘤產(chǎn)生，在所述非人動物中V-(D)-J基因片段重排導(dǎo)致功能 性人重鏈轉(zhuǎn)基因和功能性人輕鏈轉(zhuǎn)基因的形成。
29.一種雜交瘤，所述雜交瘤包含與永生化細(xì)胞融合的獲自轉(zhuǎn)基因非人動物的B細(xì)胞，其中所述雜交瘤產(chǎn)生上述權(quán)利要求任一項的可檢測量的單克隆抗體，在所述非人動物中 V-(D)-J基因片段重排導(dǎo)致功能性人重鏈轉(zhuǎn)基因和功能性人輕鏈轉(zhuǎn)基因的形成。
30.一種雜交瘤，所述雜交瘤產(chǎn)生由人IgG重鏈和人κ輕鏈核酸編碼的人單克隆抗體， 所述人IgG重鏈和人κ輕鏈核酸在其可變區(qū)分別包含如SEQ ID N0:l、5或9和SEQ ID NO :3、7或11所示的核苷酸序列，及其保守性序列修飾物。
31.一種雜交瘤，所述雜交瘤產(chǎn)生具有IgG重鏈和κ輕鏈可變區(qū)的人單克隆抗體，所 述IgG重鏈和κ輕鏈可變區(qū)分別包含如SEQ ID NO :2、6或10和SEQ ID NO :4、8或12所 示的氨基酸序列，及其保守性序列修飾物。
32.由轉(zhuǎn)染瘤產(chǎn)生的權(quán)利要求1-27任一項的抗體，所述轉(zhuǎn)染瘤包含編碼人重鏈和人輕 鏈的核酸。
33.一種包含編碼人重鏈和人輕鏈的核酸的轉(zhuǎn)染瘤，其中該轉(zhuǎn)染瘤產(chǎn)生可檢測量的權(quán) 利要求1-27任一項的抗體。
34.一種轉(zhuǎn)染瘤，它產(chǎn)生由人IgG重鏈和人κ輕鏈核酸編碼的人單克隆抗體，所述人 IgG重鏈和人κ輕鏈核酸在其可變區(qū)分別包含如SEQID N0:l、5或9和SEQ ID N0:3、7或 11所示的核苷酸序列，及其保守性序列修飾物。
35.一種轉(zhuǎn)染瘤，它產(chǎn)生具有IgG重鏈和κ輕鏈可變區(qū)的人單克隆抗體，所述IgG重鏈 和κ輕鏈可變區(qū)分別包含如SEQ ID NO :2、6或10和SEQ ID NO :4、8或12所示的氨基酸 序列，及其保守性序列修飾物。
36.一種真核或原核宿主細(xì)胞，它產(chǎn)生具有重鏈和輕鏈可變區(qū)的人單克隆抗體，所述重 鏈和輕鏈可變區(qū)分別包含如SEQ ID NO :2、6或10和SEQ ID NO :4、8或12所示的氨基酸序 列，及其保守性序列修飾物。
37.一種轉(zhuǎn)基因非人動物或植物，它產(chǎn)生具有重鏈和輕鏈可變區(qū)的人單克隆抗體，所述 重鏈和輕鏈可變區(qū)分別包含如SEQ ID NO :2、6或10和SEQ ID NO :4、8或12所示的氨基酸 序列，及其保守性序列修飾物。
38.一種生產(chǎn)結(jié)合人⑶20的人單克隆抗體的方法，包括用人CD20或表達人CD20的細(xì)胞免疫一種轉(zhuǎn)基因非人動物，所述轉(zhuǎn)基因非人動物具有 包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，從而通過所述動物的B細(xì)胞來生產(chǎn)抗體；分離所述動物的B細(xì)胞；將所述B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成永生的雜交瘤細(xì)胞，所述雜交瘤細(xì)胞分泌對人 CD20特異性的人單克隆抗體；和從雜交瘤培養(yǎng)物上清液或源自這種雜交瘤的轉(zhuǎn)染瘤中分離對CD20特異性的人單克隆 抗體。
39.一種根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中用已經(jīng)以人CD20轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞進行免疫。
40.一種分離的結(jié)合人CD20的人單克隆抗體，所述抗體是通過如下方法獲得的用人CD20或表達人CD20的細(xì)胞免疫一種轉(zhuǎn)基因非人動物，所述轉(zhuǎn)基因非人動物具有包含人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)基因的基因組，從而通過所述動物的B細(xì)胞來生產(chǎn)抗體；分離所述動物的B細(xì)胞；將所述B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合以形成永生的雜交瘤細(xì)胞，所述雜交瘤細(xì)胞分泌對人 CD20特異性的人單克隆抗體；和6從雜交瘤培養(yǎng)物上清液或源自這種雜交瘤的轉(zhuǎn)染瘤中分離對CD20特異性的人單克隆 抗體。
41.一種分離的人抗體，所述抗體包含源自人VH3-13/DP-44種系序列(SEQ ID NO 54) 的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和源自人L6/JK4-CK(SEQ ID NO :55)種系序列的輕鏈可變區(qū)氨基 酸序列，其中人抗體結(jié)合人CD20。
42.一種分離的人抗體，所述抗體包含源自人VH3-09/JH6b種系序列(SEQ ID NO 56) 的重鏈可變區(qū)氨基酸序列和源自人VL-L6/JK5種系序列(SEQ ID NO 57)的輕鏈可變區(qū)氨 基酸序列，其中人抗體結(jié)合人CD20。
43.一種組合物，所述組合物包含權(quán)利要求1-27任一項的人抗體和可藥用的載體。
44.一種組合物，所述組合物包含兩種或多種根據(jù)權(quán)利要求1-27任一項的人抗體的組 合，所述抗體具有互補的功能活性。
45.一種根據(jù)權(quán)利要求44的組合物，所述組合物包含具有分別含有如SEQ ID N0:2和 SEQ ID NO :4所示氨基酸序列的人重鏈和人κ輕鏈可變區(qū)的第一抗體，及其保守性修飾； 和具有分別含有如SEQ IDN0:10和SEQ ID NO 12所示氨基酸序列的人重鏈和人κ輕鏈可 變區(qū)的第二抗體，及其保守性修飾。
46.根據(jù)權(quán)利要求43-45任一項的組合物，所述組合物還包含治療劑。
47.根據(jù)權(quán)利要求1-27任一項的抗體，所述抗體還包含螯合劑連接物以附著放射性同 位素。
48.一種免疫結(jié)合物，它包含連接細(xì)胞毒性劑、放射性同位素或藥物的根據(jù)權(quán)利要求 1-27任一項的抗體。
49.一種雙特異性分子，它包含根據(jù)權(quán)利要求1-27任一項的抗體和對于人效應(yīng)細(xì)胞的 結(jié)合特異性。
50.一種雙特異性分子，它包含根據(jù)權(quán)利要求1-27任一項的抗體和對于人Fc受體的結(jié) 合特異性或?qū)τ赥細(xì)胞受體，如CD3的結(jié)合特異性。
51.一種抑制表達CD20的細(xì)胞的生長的方法，包括將所述細(xì)胞與有效量的根據(jù)權(quán)利要 求1-27任一項的抗體相接觸，從而抑制所述細(xì)胞的生長。
52.一種殺傷表達CD20的細(xì)胞的方法，包括將所述細(xì)胞與根據(jù)權(quán)利要求1-27任一項的 抗體相接觸，從而殺傷表達⑶20的細(xì)胞。
53.權(quán)利要求51或52任一項的方法，其中所述細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。
54.一種治療或預(yù)防涉及表達CD20細(xì)胞的疾病或病癥的方法，包括以對于治療或預(yù)防 疾病有效的量向個體給藥根據(jù)權(quán)利要求1-27或41-50任一項的人抗體、組合物、免疫結(jié)合 物或雙特異性分子，根據(jù)權(quán)利要求73-75任一項的表達載體。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述疾病為B細(xì)胞淋巴瘤。
56.權(quán)利要求54的方法，其中所述疾病為B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤。
57.權(quán)利要求54的方法，其中所述疾病選自前體B細(xì)胞成淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤和 成熟B細(xì)胞瘤，如B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(SLL)、Β細(xì)胞原淋 巴細(xì)胞淋巴瘤、淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)、濾泡淋巴瘤(FL)、皮膚毛囊中心 淋巴瘤、邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤(MALT型、結(jié)節(jié)和脾型)、毛細(xì)胞白血病、擴散大B細(xì)胞淋巴瘤、 Burkitt淋巴瘤、漿細(xì)胞瘤、漿細(xì)胞骨髓瘤、移植后淋巴增生性疾病、Waldenstrom巨球蛋白血癥和退行發(fā)育性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述疾病為濾泡淋巴瘤(FL)或B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血 病(CLL)/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤(SLL)。
59.權(quán)利要求54的方法，其中所述疾病選自淋巴瘤樣肉芽腫病、原發(fā)性外滲淋巴瘤、血 管內(nèi)大B細(xì)胞淋巴瘤、縱隔大B細(xì)胞淋巴瘤、重鏈疾病(包括γ、μ和α疾病)、用免疫抑 制劑進行治療所誘發(fā)的淋巴瘤，如環(huán)孢霉素誘發(fā)的淋巴瘤和氨甲蝶呤誘發(fā)的淋巴瘤。
60.一種治療或預(yù)防涉及表達CD20的免疫細(xì)胞的免疫疾病的方法，包括以對于治療或 預(yù)防所述免疫疾病有效的量向個體給藥根據(jù)權(quán)利要求1-27或41-48任一項的人抗體、組合 物、免疫結(jié)合物或雙特異性分子或根據(jù)權(quán)利要求73-75任一項的表達載體。
61.權(quán)利要求60的方法，其中治療包括殺傷產(chǎn)生抗自身抗原的抗體的B細(xì)胞。
62.權(quán)利要求54的方法，其中所述疾病或病癥選自牛皮癬、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、皮膚炎、 系統(tǒng)性硬皮病和硬化、炎癥性腸疾病(IBD)、局限性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、呼吸窘迫綜合 征、腦膜炎、腦炎、色素層炎、腎小球腎炎、濕疹、哮喘、動脈粥樣硬化、白細(xì)胞粘連缺乏、多發(fā) 性硬化癥、Raynaud綜合征、SjSgren綜合征、青少年起病型糖尿病、Reiter病、Behcet病、 免疫復(fù)合性腎炎、IgA腎病、IgM多發(fā)性神經(jīng)病、免疫介導(dǎo)的血小板減少癥，如急性特發(fā)性血 小板減少性紫癜和慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜，溶血性貧血、重癥肌無力、狼瘡性腎炎、 系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、特應(yīng)性皮炎、天皰瘡、格雷夫斯病、橋本甲狀腺炎、 Wegener肉芽腫病、Omenn氏綜合征、慢性腎功能衰竭、急性傳染性單核細(xì)胞增多癥、HIV和 皰疹病毒相關(guān)疾病。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述自身免疫疾病為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。
64.權(quán)利要求54的方法，其中所述疾病為選自潰瘍性結(jié)腸炎、局限性回腸炎、青少年起 病型糖尿病、多發(fā)性硬化癥、免疫介導(dǎo)的血小板減少癥，如如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜 和慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜，溶血性貧血、重癥肌無力、系統(tǒng)性硬化病和尋常性天皰瘡 的炎癥性、免疫和/或自身免疫病癥。
65.權(quán)利要求54的方法，其中所述疾病為選自炎癥性腸疾病(IBD)、潰瘍性結(jié)腸炎、局 限性回腸炎和多發(fā)性硬化癥的炎癥性、免疫和/或自身免疫病癥。
66.權(quán)利要求51-65任一項的方法，進一步包括單獨向個體給藥另一種治療劑。
67.權(quán)利要求66的方法，其中所述治療劑為(i)細(xì)胞毒性劑或放射毒性劑；( )免疫抑制劑；或(iii)免疫調(diào)節(jié)劑，如細(xì)胞因子或趨化因子。
68.權(quán)利要求66的方法，其中所述治療劑選自阿霉素、順鉬、博來霉素、卡莫司汀、苯丁 酸氮芥和環(huán)磷酰胺。
69.權(quán)利要求66的方法，其中所述治療劑選自抗CD25抗體、抗CD19抗體、抗CD21抗 體、抗CD22抗體、抗CD37抗體、抗CD38抗體、抗IL6R抗體、抗IL8抗體、抗IL15抗體、抗 IL15R抗體、抗CD4抗體、抗CDlla抗體、抗α-4/β-Ι整聯(lián)蛋白(VLA4)抗體、CTLA4_Ig和 抗C3b(i)抗體。
70.一種檢測樣品中⑶20抗原或表達⑶20的細(xì)胞存在的體外方法，包括在允許形成抗體和CD20之間復(fù)合物的條件下將樣品與權(quán)利要求1-27任一項的抗體相接觸；和檢測復(fù)合物的形成。
71.—種檢測個體中CD20抗原或表達CD20的細(xì)胞存在的試劑盒，其包含權(quán)利要求 1-27任一項的抗體。
72.一種檢測⑶20抗原或表達⑶20的細(xì)胞的體內(nèi)方法，包括在允許形成抗體和CD20之間復(fù)合物的條件下給藥權(quán)利要求1-27任一項的抗體；和檢 測形成的復(fù)合物。
73.—種表達載體，所述表達載體包含編碼含有選自SEQ IDNos :1、5和9所示核苷酸 序列的核苷酸的重鏈可變區(qū)，和含有選自SEQID Nos :3、7和11所示核苷酸序列的核苷酸序 列的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，及其保守性修飾物。
74.一種表達載體，所述表達載體包含編碼含有選自SEQ IDNos :2、6和10所示氨基酸 序列的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)，和含有選自SEQ ID Nos:4、8和12所示氨基酸序列的氨 基酸序列的輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，及其保守性修飾物。
75.一種藥物組合物，所述組合物包含權(quán)利要求73-74任一項的表達載體和可藥用的 載體。
76.—種結(jié)合權(quán)利要求1-27任一項的抗體的抗獨特型抗體。
77.一種結(jié)合2F2、11B8或7D8的抗獨特型抗體。
78.權(quán)利要求76或77的抗獨特型抗體在檢測樣品中抗CD20人單克隆抗體的水平中的應(yīng)用。
全文摘要
公開了分離的結(jié)合并抑制人CD20的人單克隆抗體，以及相關(guān)的基于抗體的組合物和分子。所述人抗體可以通過轉(zhuǎn)染瘤或在非人轉(zhuǎn)基因動物，例如，轉(zhuǎn)基因小鼠中進行生產(chǎn)，所述轉(zhuǎn)基因動物能夠通過進行V-D-J重組和同種型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生多同種型的人單克隆抗體。還公開了含有所述人抗體的藥物組合物，產(chǎn)生所述人抗體的非人轉(zhuǎn)基因動物和雜交瘤，以及利用所述人抗體的治療和診斷方法。
文檔編號C12N5/22GK101928344SQ20101015052
公開日2010年12月29日 申請日期2003年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月17日
發(fā)明者H·黃, J·G·J·范德溫克爾, J·比得森, J·特伊齡, M·格蘭尼, O·D·M·S·巴德斯伽德, P·帕仁, S·魯爾斯 申請人:根馬布股份公司